Afstudeerverslag Haaronderzoek
Objectivering van haaronderzoek met confocale microscopie
Nisha Bhagwat
Juni 2014Afstudeerverslag NFI
Haaronderzoek
Objectivering van haaronderzoek met confocale microscopie
Afstudeerbedrijf
Nederlands Forensisch Instituut (NFI) Deskundigheidsgebied haaronderzoek Laan van Ypenburg 6
2497GB Den Haag
Projectbegeleider
Philomeen de Vreede p.de.vreede@nfi.minvenj.nl Jaap van der Weerd j.van.der.weerd@nfi.minvenj.nl
Student:
Nisha Bhagwat (2037133) an.bhagwat@student.avans.nl Afstudeerbegeleider Alexander Lindenbergh Opleiding:
Avans Hogeschool Breda
ATGM: Academie voor Technologie, Gezondheid en Milieu Forensisch Laboratorium Onderzoek
Lovensdijkstraat 61-‐63 4818 AJ Breda
Samenvatting
Vaak worden op plaatsen delict op haar lijkende sporen aangetroffen. Hierbij kan men te maken hebben met vezels of echte dierlijke of humane haren. In het geval van humane haren wordt forensisch morfologisch onderzoek uitgevoerd om erachter te komen van wie het haarspoor afkomstig is. Het morfologisch haaronderzoek zoals het nu uitgevoerd wordt, is subjectief. Omdat er behoefte is aan een methode voor het haaronderzoek die wetenschappelijk
onderbouwd kan worden, werd onderzoek gedaan naar de mogelijkheden voor haaronderzoek met behulp van confocale microscopie.
Het doel van dit onderzoek is een meer objectieve methode ontwikkelen om het haaronderzoek uit te voeren met behulp van confocale microscopie. Tijdens de stageperiode werd onderzoek verricht naar de mogelijkheden voor forensisch haaronderzoek met behulp van confocale microscopie. Aan de hand hiervan werd toen al een methode ontwikkeld om haren mee te kunnen meten. Gedurende het afstudeeronderzoek werd onder andere de ontwikkelde methode geoptimaliseerd. Dit werd gedaan door onder andere onderzoek te doen naar intensiteitsverschillen in de verkregen afbeeldingen. Verder werd ook onderzoek verricht naar de afwijkende haarbreedtes in de verkregen afbeeldingen. Het doel van het optimaliseren van de methode is het verkrijgen van een reproduceerbare meting zodat de afbeeldingen die hieruit voortvloeien voor vergelijking geschikt zijn.
Daarnaast werd de microscoop tussen de metingen door gekalibreerd. Uit het onderzoek naar de verschillende kalibratiestandaarden bleek dat het objectglas een goede kalibratiestandaard is. Verder zijn uit de kalibratiestap standaardinstellingen verkregen waarbij haren van
verschillende kleuren probleemloos gemeten kunnen worden. Met behulp van deze
standaardinstellingen werden in eerste instantie metingen uitgevoerd aan verschillende haren van verschillende donoren. Tot slot werd een grotere set haren van verschillende kleuren en verschillende donoren bij deze standaardinstellingen gemeten. Met deze instellingen vallen de afbeeldingen verkregen van zowel blonde, bruine, grijsbruine, kleurloze als zwarte haren binnen het dynamisch bereik van de microscoop. De condities waaronder de verschillende haren gemeten worden kunnen dus voor alle haarkleuren gelijk worden gehouden.
Tijdens dit onderzoek is gebleken dat met de confocale microscoop duidelijke en gedetailleerde afbeeldingen van haren verkregen werden. De afbeeldingen zijn goed reproduceerbaar, onder andere vanwege het feit dat de intensiteitsverschillen in de afbeeldingen zijn gestabiliseerd. Verder laten de afbeeldingen verschillen zien tussen haren met verschillende kleuren.
Echter, voordat confocale microscopie in zaakwerk geïntroduceerd kan worden moet nog veel onderzoek worden verricht. Zo is het nodig om een veel beter beeld te krijgen van de
bewijswaarde: Hoe goed kunnen haren van verschillende personen onderscheiden worden? Om de techniek objectief te krijgen moet bovendien de dataverwerking worden
geoptimaliseerd. Tot die tijd, wordt aanbevolen om het forensisch haaronderzoek zoals het nu wordt uitgevoerd voort te zetten.
Inhoudsopgave
Samenvatting ... 3
Inhoudsopgave ... 4
1. Inleiding ... 5
2. Theoretisch achtergrond ... 6
2.1 De vorming van haren ... 6
2.2 Haarschacht ... 6
2.3 Morfologische kenmerken ... 8
2.4 Variatie binnen haarkleur ... 10
2.5 Forensisch haaronderzoek ... 11
2.6 Technieken ... 12
2.7 Onderdelen confocale microscoop ... 14
2.8 Automatisering van de dataverwerking ... 16
3. Methode ... 17
3.1 Optimalisatie: Intensiteit in de afbeeldingen ... 17
3.2 Optimalisatie: Kalibratie instellingen ... 17
3.3 Optimalisatie: Stabilisatie plek en breedte haar ... 18
3.4 Stereomicroscopisch vs. Confocaal ... 18
3.5 Metingen bij standaardinstellingen ... 19
3.6 Dataverwerking ... 19
3.7 Toelichting gebruikte apparatuur, materialen en software ... 20
4. Resultaten ... 21
4.1 Optimalisatie: Intensiteit in de afbeeldingen ... 21
4.2 Optimalisatie: Kalibratie instellingen ... 21
4.3 Optimalisatie: Stabilisatie plek en breedte haar ... 22
4.4 Stereomicroscopisch vs. Confocaal ... 24
4.5 Metingen bij standaardinstellingen ... 27
5. Discussie en conclusie ... 30
6. Aanbeveling ... 35 Verklarende woordenlijst ... 36 Literatuurlijst ... 38
1. Inleiding
Dagelijks verliest men op natuurlijke wijze 100 tot 150 haren. Deze haren kunnen terecht komen op allerlei plaatsen, zoals bedden, banken of kleding. Ook kunnen door de toepassing van lichamelijk geweld, uitgetrokken haren aangetroffen worden.
Het verlies van deze haren draagt bij aan het forensische haaronderzoek [7].
Op het Nederlands Forensisch Instituut (NFI) wordt het forensische haaronderzoek uitgevoerd door twee onafhankelijke haaronderzoekers. Zij bekijken het op een plaats delict aangetroffen haarspoor en het referentiemateriaal onder de microscoop. Dit gebeurt afzonderlijk en onafhankelijk van elkaar om beïnvloeding van het resultaat te voorkomen. Bij het forensische haaronderzoek wordt gelet op de morfologische kenmerken van de haar. De morfologische kenmerken van het referentiemonster worden beschreven en dit levert een haarpalet op [7].
Echter de methode die nu voor het forensische haaronderzoek gebruikt wordt, is subjectief. Er is behoefte aan een methode die men wetenschappelijk kan onderbouwen. Hiertoe is dit
onderzoek opgezet met als hoofddoel proberen het forensische haaronderzoek door middel van confocale microscopie meer objectief te maken.
De doelen die tijdens de afstudeerperiode behaald dienden te worden waren de volgende: 1. De ontwikkelede methode verder uittesten en optimaliseren. Hierbij onder andere gelet
op intensiteit en reproduceerbaarheid.
2. Het ontwikkelen van een methode om de confocale microscoop tussen de metingen door mee te kalibreren.
3. Standaardinstellingen vaststellen en vaststellen of het mogelijk is alle haren, ongeacht kleur, vorm, pigmentverdeling etc. te meten bij dezelfde standaardinstellingen. 4. Het definiëren van parameters waar naar gekeken zal worden bij de objectivering en
automatisering van de dataverwerking
5. Vaststellen of het mogelijk is objectief onderscheid te maken tussen meerdere hoofdharen van 1 donor en tussen haren van verschillende personen.
Deze doelen zijn gebaseerd op de resultaten die waren verkregen tijdens de stageperiode [24].
Dit verslag is als volgt ingedeeld. In hoofdstuk 2 is algemene informatie over haren,
haaronderzoek en de confocale microscoop opgenomen. In hoofdstuk 3 worden de gebruikte materialen en toegepaste methoden toegelicht. In hoofdstuk 4 volgen de resultaten van het onderzoek. Verder is in hoofdstuk 5 de conclusie van het onderzoek en een discussie opgenomen. In hoofdstuk 6 staat een aanbeveling en invullingen voor eventueel vervolgonderzoek waarna een verklarende woordenlijst en de literatuurlijst volgen.
2. Theoretisch achtergrond
2.1 De vorming van haren
De haarfollikel of het haarzakje, zie figuur 1, is weefsel dat in de opperhuid gevormd wordt. Geschat wordt dat volwassen mensen in totaal ongeveer twee miljoen haarfollikels hebben. Ongeveer een miljoen van deze follikels zitten op het hoofd.
In de basale laag van de epidermis wordt op een gegeven moment een neerwaartse groei zichtbaar. In combinatie met de huid papil wordt hieruit een soort prop gevormd. Deze prop is een jonge haarfollikel. De cellen van de dermis zullen daarna bindweefsel en kleine bloed capillairen om de groeiende follikel heen vormen. Het doel van het vormen van het bindweefsel en de bloed capillairen is om het nieuw ontstane weefsel van voedingsstoffen te voorzien. De cellen van de basale laag van de epidermis en de haarpin vormen samen de buitenste
wortelschacht van de follikel. De ontwikkeling van de haarfollikel begint in de foetus. Afhankelijk van de plaats op het lichaam gebeurt dit op verschillende momenten. In de haarfollikel vindt deling, differentiatie en migratie van cellen plaats. Al deze processen leiden tot de groei van de haarvezel. De haarvezel wordt gevormd door de biosynthese en uitharding van de inhoud van de medulla, cortex en opperhuid (cuticula) cellen die zich in de haarschacht bevinden. De haarwortel wordt gevormd door actief groeiende cellen. Door deze cellen krijgen haarvezels de lange, cilindervormige en fijne structuur. In de haarwortel zitten ook cellen die verantwoordelijk zijn voor de vorming van pigmentkorrels. Deze cellen heten melanocyten. In de rechter
afbeelding van figuur 1 is de dwarsdoorsnede van een haarfollikel weergegeven. Het gedeelte van de haarvezel dat zichtbaar is boven de huid wordt haarschacht genoemd. De haarschacht is opgebouwd uit dode cellen die omgezet zijn in keratine en bindingsmaterie [1][2][3].
Figuur 1: Dwarsdoorsnede haarfollikel en haar[4]
2.2 Haarschacht
De haarschacht is het deel van de haar wat zichtbaar is boven de huid. De haarschacht is de grootste component van de haarfollikel. De haarschacht bestaat uit de volgende drie componenten.
• medulla • cortex • cuticula
In elke laag zit een ander soort cel. De buitenste laag zit om de cortex en de medulla heen. Deze laag is een hoornlaag en wordt de cuticula genoemd [5].
2.2.1 Medulla
De medulla wordt gevormd als een kolom van cellen die eiwitten produceren die verschillen van de eiwitten die geproduceerd worden door de cellen in de cortex en de cuticula. Deze cellen zakken als het ware in elkaar tijdens hun vorming.
Hierdoor ziet de medulla eruit als een netwerk van cellulaire verbindingen met ruimtes en spleten die met lucht gevuld zijn.
De medulla is niet aanwezig in alle humane haren. Vooral in hele fijne en dunne haren kan de medulla ontbreken. In humane haren kan de medulla zowel afgebroken als onafgebroken doorlopen over de volledige lengte van de haar. De medulla zit niet in de haarpunt en de wortel. In grovere haren kan de medulla onafgebroken doorlopen. De medulla kan dwars met
onregelmatige tussenruimtes onderbroken worden (dieren). Dit wordt een onderbroken medulla genoemd. Ook kan de medulla met onregelmatigheden in heel kleine hoeveelheden aanwezig zijn in de cortex. Dit wordt een gefragmenteerde medulla genoemd. Bij mensen is de medulla meestal niet lang. Vaak is de diameter maar een of twee cellen groot. Verder is de medulla vaak niet breder dan een derde van de breedte van de haarschacht. De medulla kan zichtbaar gemaakt worden met lichtmicroscopie [1].
2.2.2 Cortex
De centrale laag tussen de medulla en de cuticula is de cortex. De cortex bestaat uit cellen met een spoelvorm. De cellen zijn evenwijdig aan de as van de haarvezel. Omdat de cellen in elkaar passen zijn ze nauw verpakt. Hierdoor zien de cellen er onder de microscoop homogeen als een doorschijnende massa uit. In de cellen is weinig detail zichtbaar onder de microscoop. Hierdoor is het microscopische beeld van deze cortiale cellen niet erg waardevol voor identificatie. Echter in sommige gevallen kan de dikte van de cortex ten opzichte van de totale breedte van de haar belangrijk zijn.
De cortiale cellen zijn aan elkaar verbonden via intercellulaire contacten die het intercellulaire membraan complex of cel membraan complex wordt genoemd. De kracht waarmee aan de haar getrokken kan worden is gedeeltelijk afhankelijk van deze contacten. Bij de volledig gevormde haar bevatten de cortiale cellen nog wat nucleaire resten en pigmentkorrels. De pigmentatie die zorgt voor de haarkleur kan klein van vorm zijn. Daarnaast komt deze pigmentatie ook voor als grote vormloze massa’s of in de vorm van een verspreide vlek. De meeste pigmentatie in de vorm van pigmentkorrels bevindt zich in de cortex [1][2][6].
2.2.3 Cuticula
De buitenste laag van de haarschacht wordt de cuticula genoemd. Deze laag bestaat uit
afgeplatte cellen die elkaar overlappen. De cellen overlappen elkaar zowel in de lengte-‐ als in de breedterichting van de haren zodat de haar volledig omringd is en de cortex goed bij elkaar gehouden kan worden. Deze cellen zijn opgebouwd uit keratine.
Een van de functies van de cuticula is het beschermen van de interne vezels. De cuticula van humane haren wordt gevormd uit een enkele cellaag in de haarfollikel.
In de volgroeide haar zijn de cuticula cellen ruw en rechthoekig van vorm. De cellen zijn ongeveer 50 tot 60 µm lang en ongeveer 0,5 µm dik. Daarnaast bevat de cuticula meerdere lagen met een dikte van ongeveer zes cellen.
Hierdoor is de cuticula ongeveer 3 tot 5 µm dik. Cuticula cellen vormen een patroon dat microscopisch gevisualiseerd kan worden op het haaroppervlak.
Dit wordt het schubbenpatroon genoemd. Dit patroon verschilt van diersoort tot diersoort en kan helpen bij de identificatie van diersoorten. Bij mensen onderling verschilt het
2.3 Morfologische kenmerken
Met de morfologische kenmerken van haren worden de vorm, structuur, kleur, bouw en maten van de haar beschreven. Bij humane haren kan onderscheid gemaakt worden tussen bijzondere en algemene morfologische kenmerken.
Deze morfologische kenmerken zijn min of meer karakteristiek voor een persoon. De algemene morfologische kenmerken omvatten de eigenschappen die de haar van nature heeft. Zoals de haarkleur en de intensiteit van de kleur. Daarnaast heeft de haar ook een natuurlijke lengte, vorm, dikte en pigmentatie. Bijzondere kenmerken ontstaan door omgevingsfactoren. Zo kiest men er tegenwoordig steeds vaker voor om het haar te verven of te permanenten. Daarnaast kan het haar ook aangetast worden door zonlicht, verbranding en fysisch geweld [7][8].
2.3.1 Pigmentatie en pigmentkorrels
Het pigment in het haar wordt veroorzaakt door pigmentkorrels, deze korrels worden melanosomen genoemd. In hoofdhaar worden pigmentkorrels voornamelijk aangetroffen tussen de microfilamenten van de cortex. Ook worden wel eens pigmentkorrels aangetroffen in de medulla.
In de cuticula en de binnenste wortelschacht worden doorgaans geen pigmentkorrels aangetroffen. Bij humane haren is het opvallend dat de concentratie van de pigmentkorrels rondom de omtrek van de haar groter is. Dit is goed zichtbaar in een doorsnede van de haar. De kleur van haar is onder andere afhankelijk van de grootte van de pigmentkorrels. Daarnaast is de kleur van haar ook afhankelijk van de kleurstoffen eumelanine en phaeomelanine. Deze kleurstoffen worden melaninen genoemd. De natuurlijke haarkleur ontstaat door de verhouding waarin deze twee melaninen voorkomen in een haar. De kleurstof eumelanine heeft een bruine tot zwarte kleur. Phaeomelanine heeft een geel tot rode kleur. De verhouding waarin beide kleurstoffen in het haar aanwezig zijn, bepaalt wat voor kleur haar iemand krijgt. Bruin en zwart haar wordt veroorzaakt door een grotere mate van aanwezigheid van eumelanine kleurstof. Rood haar wordt veroorzaakt door een grotere mate van aanwezigheid van phaeomelanine kleurstof. Ook zijn het aantal pigmentkorrels en de verdeling ervan van invloed op de haarkleur. Echter het verschil in kleur tussen verschillende haren wordt meer veroorzaakt door het type kleurstof en de concentratie van de kleurstof in de pigmentkorrels dan door het absolute aantal pigmentkorrels.
Bij zwarte haren hebben de pigmentkorrels een ellipsvorm. Ze zijn 0,8 tot 1,0 µm lang en hebben een diameter van 0,3 tot 0,4 µm.
In rode en blonde haren zijn de pigmentkorrels kleiner en bolvormig.
De pigmentkorrels kunnen apart of in groepjes voorkomen. In donker haar zijn de
pigmentkorrels altijd afzonderlijk verdeeld en komen puntsgewijs voor. In lichtere haren komen de pigmentkorrels niet puntsgewijs voor maar gevlekt. In figuur 2 is een schematische weergave van de haarkleur en opbouw van verschillende haren weergegeven [1][9].
2.3.2 Melanine vorming
Haar melaninen zijn polymeren die gevormd worden door melanosomen. De twee typen melaninen die in haren voorkomen kunnen van elkaar onderscheiden worden door hun kleur, hun chemische eigenschappen en de samenstelling.
Phaeomelaninen zijn polymeren die bestaan uit stikstof en zwavel en oplosbaar zijn in basen. Eumelaninen daarentegen zijn niet oplosbaar in basen en bevatten alleen stikstof. Eumelaninen zijn monomeren. De twee typen melaninen die in haren voorkomen zijn aan elkaar verwant. Beide melaninen ontstaan door een metabolische reactie uit het kleurloze aminozuur tyrosine. Tyrosinase is een belangrijk onderdeel van het proces waarbij melaninen gevormd worden. Inmiddels zijn er meerdere vormen van het tyrosinase enzym bekend. De kans bestaat dat bepaalde polymorfismen van dit enzym invloed hebben op de ontstane haarkleur. Ook zou voorspeld kunnen worden welke type melanine er geproduceerd wordt door de mate van expressie van het tyrosinase enzym in de haarfollikel te meten. Zo worden in haarfollikels die verantwoordelijk zijn voor de productie van rode haren, verhogingen in tyrosinase activiteit gemeten. Ook is het tyrosinase enzym in hogere concentraties aanwezig in haarfollikels die rode haren produceren dan in haarfollikels die zwarte of bruine haren produceren. Ditzelfde geldt ook voor blonde haren. Dit zou kunnen betekenen dat de lichte kleur van het haar niet ontstaat door een tekort aan melanine maar door het type melanine wat gevormd wordt. Anderzijds wordt er geen tyrosinase activiteit waargenomen in haarfollikels die verantwoordelijk zijn voor de vorming van witte haren [1].
2.3.3 Melanosomen
De synthese van melanine vindt plaats in melanosomen. Melanosomen ontstaan in de melanocyten. Melanocyten zijn cellen met een afwijkende vorm. Deze cellen zijn aanwezig in klieren, de dermis, haarfollikels en andere weefsels van het lichaam. Hier staan ze in contact met de epitheel cellen. De melanocyten transporteren melanosomen naar de epitheel cellen. Melanocyten zijn een bron van pigmentatie in weefsels zoals haar en huid. In de haarfollikel zijn de melanocyten in alle weefsellagen aanwezig, echter wil dit niet per definitie zeggen dat ze ook actief zijn in alle weefsellagen. Actieve melanocyten in de haarwortel zijn aanwezig in het midden van de cellen aan de top van de huidpapil. Onderzoek heeft aangetoond dat er inactieve melanocyten aanwezig zijn in het midden van de humane haarfollikel. Vanaf dit punt kunnen de cellen omhoog of omlaag migreren en veranderen de cellen in actieve melanocyten die zich in de epidermis bevinden.
De melanosomen worden via de melanocyten naar de cortiale cellen getransporteerd. Hier worden de melanosomen vastgezet door het uithardingproces die de cel componenten
ondergaan tijdens de keratinisatie. Als gevolg hiervan ontwikkelt zich een gepigmenteerde vezel. In de ontwikkeling van melanosomen in de melanocyten kunnen vier fases worden
onderscheiden:
- Fase 1: De eumelanine melanosomen uit fase 1 zijn bolvormige en met vocht gevulde blaasjes (vacuolen). In die blaasjes bevinden zich eiwitachtig materiaal en bolvormige celorganellen.
- Fase 2: In fase 2 worden de melanosomen in ellipsvormig en verandert een deel van de melanosomen in bolvormige celorganellen.
- Fase 3: In deze fase 3 begint de pigmentatie van de lamellae en is de tyrosinase activiteit duidelijk waar te nemen.
- Fase 4: De melanosomen van fase 4 bevatten de laatste ovaalvormige eumelaninen pigmenten.
Phaeomelaninen zijn altijd bolvormig en vormen geen lamellae. Verder bevatten
phaeomelaninen in alle vier stadia bolvormige celorganellen. Deze bolvormige celorganellen worden gezien als de sleutel eenheid die de melanogenesis verzorgt.
Melanogenesis is het proces waarbij melaninen worden geproduceerd door melanocyten. De exacte rol van de bolvormige celorganellen tijdens dit proces is echter nog niet helemaal bekend.
Alleen in de anagene fase 3 en 4 wordt actief pigment gesynthetiseerd door de melanocyten die in de haarfollikel zitten. Dit gegeven is gebaseerd op de tyrosinase activiteit. Aan het einde van de haargroeicyclus stoppen de melanine en medulla formatie tegelijkertijd. Dit zorgt voor het ontstaan van het worteleind van de haarwortel. Dit worteleind bevat geen medulla. Het is onbekend wat er met de melanocyten gebeurt wanneer de groeicyclus van de haarfollikel en het proces van pigmentproductie compleet zijn [1].
2.4 Variatie binnen haarkleur
De haarkleur zoals deze wordt waargenomen is niet alleen afhankelijk van de pigmentatie in de haar maar ook van de fysische eigenschappen van de haar zelf. Deze fysische eigenschappen kunnen invloed hebben op de lichtinteractie met de haar. Factoren zoals de aan-‐ of afwezigheid van een medulla en de glad-‐ of grofheid van de cuticula kunnen invloed hebben op de manier waarop het licht wordt gereflecteerd en gebroken door de haarschacht.
Dit zorgt ervoor dat deze factoren invloed hebben op de haarkleur die wordt waargenomen. Hierdoor is er in het forensische haaronderzoek de behoefte aan goede en reproduceerbare methoden om de haren te prepareren en het licht te controleren gedurende de onderzoeken. De haarkleur is genetisch bepaald, echter er is zeer weinig bekend over de manier van
overerving bij mensen. Het lijkt er wel op dat tenminste 4 genetische loci betrokken zijn bij de overerving. Bij personen van het Negroïde ras is de kans op donker haar erg groot. Bij personen van het Kaukasische ras is er geen selectie in het voordeel van een bepaalde haarkleur.
Doorgaans wordt donker haar, zwart of bruin, geassocieerd met een donkere huid. Hoewel blondering bij donkere mensen niet geheel onbekend is, bijvoorbeeld bij de Australische Aboriginals. Het grootste ras met blond en rood haar is het Kaukasische ras uit Noord-‐ en West Europa.
Het is beperkt mogelijk om de raciale afkomst van een onbekende haar te bepalen door onder andere te kijken naar de pigmentverdeling in de haar met behulp van microscopie.
De kleur van haren kan verschillen afhankelijk van de plek op het lichaam waar de haar zich bevindt. Zo zijn genitale haren meestal lichter van kleur dan hoofdharen. Bij blonde personen daarentegen zijn de schaamharen, okselharen, wenkbrauwharen en wimperharen vaker donkerder dan het hoofdhaar.
Ook de leeftijd van een persoon heeft invloed op de haarkleur. Zo komt het vaak voor dat het blonde haar van jonge kinderen naarmate ze ouder worden donkerder of zelfs bruin wordt. Wanneer men nog ouder wordt, wordt ook grijs haar ontwikkeld. De grijze kleur ontstaat meestal door een mix van gekleurde haren en witte, niet gepigmenteerde haren.
Ook worden er haren gevonden met een grijze kleur waarin minder pigment zichtbaar is. Het vergrijzen of witter worden van haren wordt canities genoemd en komt voor bij elke persoon. Canities is meestal onomkeerbaar. De leeftijd waarop de vergrijzing begint is tot op zekere hoogte erfelijk. Bij het kaukasische ras verschijnen witte haren gemiddeld voor het eerst op een leeftijd van 34 jaar. Ongeveer vijftig procent van de mensen, ongeacht de sekse of haarkleur, is voor de helft grijs bij een leeftijd van 50 jaar. Bij het negroïde ras verschijnen de witte haren voor het eerst ongeveer 10 jaar later dan bij het Kaukasische ras.
Echter de witte haren worden eerder opgemerkt bij donkerharige personen omdat het contrast tussen de donkere en de witte haren groter is. Op het hoofd worden grijze haren vaak het eerst zichtbaar bij de slapen. Zichtbare bestaande haren veranderen niet van kleur tijdens het
vergrijzingproces. Het vergrijzingproces kan alleen optreden door de vermindering of het
ophouden van de pigmentatie in groeiende haren terwijl deze nog steeds worden gevormd in de haarfollikel. Ook kan vergrijzing van haren optreden door de productie van minder
gepigmenteerde haren in daaropvolgende haargroei cycli [1].
2.5 Forensisch haaronderzoek
Bij het forensische haaronderzoek zijn er twee onderzoeksmogelijkheden waarmee de specifieke kenmerken van haarsporen die op een plaats delict gevonden zijn, vastgesteld kunnen worden. Er kan gekeken worden naar de uiterlijke, morfologische kenmerken van het gevonden haarspoor. Het haarspoor wordt dan geclassificeerd tot een bepaald haartype. Vervolgens wordt het vergelijkende haaronderzoek uitgevoerd .
Daarnaast kan bij aanwezigheid van een haarwortel mogelijk een autosomaal DNA profiel opgesteld worden door middel van DNA-‐onderzoek. Indien er geen haarwortel aanwezig is kan ook mitochondriaal DNA uit de haar zelf gehaald worden [7].
2.5.1 Het vergelijkend haaronderzoek
Bij het vergelijkend haaronderzoek wordt gebruik gemaakt van de microscoop. Nadat
haarsporen op stukken van overtuiging veiliggesteld zijn, wordt door een haaronderzoeker naar de haren onder de microscoop gekeken. De haaronderzoeker beschrijft de morfologische kenmerken van de haren. Allereerst wordt vastgesteld of het een menselijke of een dierlijke haar is. Bij menselijke haren zijn verschillende typen haren te onderscheiden: hoofdharen, schaamharen, wenkbrauw of wimperharen en baardharen. Haren die niet herleid kunnen worden tot een van deze vier haartypen noemt men humane haar.
Tijdens het vergelijkend haaronderzoek wordt het haarspoor vergeleken met
referentiemonsters van het haar van de verdachte, het slachtoffer of andere betrokken personen. De morfologische kenmerken van verschillende haartypen kunnen niet onderling vergeleken worden. Een schaamhaar kan dus niet vergeleken worden met een hoofdhaar. Schaamharen onderling kunnen wel vergeleken worden.
Doordat de morfologische kenmerken van een haar min of meer karakteristiek zijn voor een persoon, kan hiervan gebruik gemaakt worden bij het vergelijkend haaronderzoek. Haren kunnen goed van elkaar onderscheiden worden wanneer er bijzondere kenmerken aanwezig zijn of als er een ongewone combinatie van kenmerken aanwezig zijn [7].
2.5.2 Haarpalet
Een haarpalet is de beschrijving van de morfologische kenmerken van het referentie
haarmonster. Bij het vergelijkend haaronderzoek wordt gekeken of het gevonden haarspoor past in het verkregen haarpalet. Indien er een of meerdere morfologische kenmerken van het haarspoor verschillen van de morfologische kenmerken van het haarpalet kan gesteld worden dat het haarspoor niet afkomstig is van de persoon waarvan het haarpalet is verkregen [7].
2.6 Technieken
2.6.1 Het lichtspectrum
Er bestaat een verband tussen de structuur van een microscoop en het menselijke oog. Het oog is in staat om verschillen in helderheid en intensiteit te registreren. Daarnaast kan het oog licht van violet blauw tot oranje rode golflengten van elkaar onderscheiden.
Het voor het menselijke oog zichtbare lichtspectrum ligt tussen 400 en 750 nanometer. In figuur 3 is het spectrum van wit licht weergegeven [11].
Figuur 3: Het spectrum van wit licht [11]
2.6.2 Conventionele microscopie
Microscopen zijn instrumenten die zijn ontworpen om objecten die onzichtbaar zijn voor het blote oog vergroot te visualiseren. Daarnaast worden deze vergrootte afbeeldingen ook wel eens op foto vastgelegd. De vergroting van een beeld wordt gerealiseerd door het monster door een simpele lens te bekijken. Door meerdere lenzen op een specifieke manier met elkaar te combineren, kan een microscopisch beeld met grote vergroting verkregen worden. In de microscopie kan gebruikt gemaakt worden van verschillende soorten lenzen [11].
Bij een vergrootglas wordt gebruik gemaakt van één enkele dubbel convexe lens. Die lens in combinatie met de ooglens zorgt ervoor dat een vergoot beeld van het te observeren object op het netvlies geprojecteerd wordt. Hierbij wordt er met het oog gekeken naar een virtueel vergoot beeld van het object.
Met dit principe als basis ontwikkelde Antoni van Leeuwenhoek in de zeventiende eeuw de eerste microscoop. Deze microscoop moest wel vrij dicht bij het oog gehouden worden om een object te kunnen observeren. Hierop volgde de eerste samengestelde microscoop die werd ontwikkeld door de gebroeders Janssen.
Een samengestelde microscoop bestaat uit drie lenzen die op dezelfde optische as gecentreerd zijn. De objectieflens zit het dichts bij het object.
De tubus lens zit tussen de objectieflens en het oculair in. Het oculair zelf zorgt ook voor een vergroting en bevindt zich het dichtst bij het oog. Verder bevat de microscoop ook een mechanisme om de afstand tussen het object en de lens in te stellen.
Het beeld wordt vergroot in twee fasen. Allereerst wordt de objectieflens gebruikt om divergerende stralen die afkomstig zijn van het object om te buigen tot een evenwijdige stralengang. Vervolgens worden deze stralen door de tubus lens opnieuw gefocusseerd tot een convergerende bundel. Dit zorgt ervoor dat er een eerste vergroot beeld van het object ontstaat in de tubus van de microscoop. De lens van het oculair vergroot dit beeld verder. Hierdoor ontstaat in combinatie met de ooglens een vergroot beeld.
In de meeste microscopen bevindt zich onder de tafel een condensor. Deze condensor zorgt ervoor dat het licht wat door een lamp wordt uitgezonden ombuigt tot een convergerende stralengang [11][12].
2.6.3 Microscopie en fluorescentie
Wanneer bij fluorescentie een stof wordt bestraald met licht van een bepaalde golflengte kan die stof daarna zelf licht van een langere golflengte gaan uitzenden. Dit licht bevindt zich dan ook in een lagere energietoestand. Elektronen absorberen fotonen met een hoog
energiegehalte.
De elektronen belanden hierbij in een aangeslagen toestand waarna ze terug vallen naar de normale toestand. Hierbij worden door de elektronen, fotonen met een lager energiegehalte uitgezonden.
Fluoresceïne is een verf die op dezelfde manier werkt. Het zendt een bepaalde kleur licht uit wanneer het met een andere kleur in aanraking komt. Als het bijvoorbeeld met blauw licht in aanraking komt zendt het groen licht uit.
Het voordeel van fluorescentie voor microscopie is dat je vaak fluorescerende verfmoleculen kunt vastmaken aan specifieke delen van je monster zodat alleen die delen zichtbaar worden onder de microscoop. Er kan ook gebruik gemaakt worden van meer dan een type verf. Door het veranderen van het excitatie licht kan ervoor gezorgd worden dat eerst het ene type van de verf gaat fluoresceren en daarna een andere. Dit wordt toegepast om de verschillende delen van het monster van elkaar te kunnen onderscheiden [13][14].
Bij fluorescentie microscopie wordt gebruik gemaakt van een speciale dichroïsche spiegel. De spiegel reflecteert licht wat een kortere golflengte heeft en laat het licht met een langere golflengte passeren. Excitatie licht is violet en uitgestraald licht is rood. De ogen vangen alleen het uitgestraalde, rode, licht op. Het verspreide paarse licht wordt niet opgevangen. Vaak bevat een fluorescentie microscoop rode en paarse balken die zich naast de dichroïsche spiegel bevinden. Dit zijn bijkomende filters die voorkomen dat de verschillende golflengtes van licht de verkeerde richting op gaan [14].
2.6.4 Confocale microscopie
Confocale laser scanning microscopie is een microscopische techniek die driedimensionale optische resolutie biedt. Microscopen zijn vooral gevoelig voor signalen die afkomstig zijn van de plek in het object dat in focus ligt.
Signalen die afkomstig zijn uit boven-‐ of onderliggende lagen dragen bij aan de vorming van de afbeelding. Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om deze signalen uit de afbeelding te houden. Bij deconvolutie bijvoorbeeld, worden zowel de signalen van het in focus punt als de signalen van punten van de stack van afbeeldingen die uit focus liggen gebruikt bij de vorming van de driedimensionale afbeelding.
Bij confocale microscopie wordt driedimensionale resolutie gerealiseerd door de aanwezigheid van een pinhole. Deze pinhole zorgt ervoor dat het signaal dat afkomstig is uit boven-‐ en
onderliggende lagen grotendeels wordt geblokkeerd. Deze pinhole is voor de detector geplaatst. Hierdoor worden die signalen niet tot de detector toegelaten.
Het licht dat uit een in focus laag van een object afkomstig is wordt in beeld gebracht door het objectief van de microscoop. Dit terwijl het licht wat afkomstig is uit lagen die niet in focus liggen wordt geblokkeerd door de pinhole. Dit zorgt ervoor dat confocale afbeeldingen doorgaans scherper kunnen worden weergegeven dan met een gewone conventionele microscoop. Zie figuur 4 voor een voorbeeld hiervan. In de afbeelding links is een opname van stuifmeelkorrels zichtbaar met een gewone conventionele microscoop. In de afbeelding rechts is hetzelfde object zichtbaar, gemeten met een confocale microscoop [15].
Figuur 4: Gewone versus confocale fluorescentie microscopie [16]
Bij confocale microscopie worden signalen de afkomstig zijn uit een plek in het monster die uit focus ligt geblokkeerd. Deze blokkade van de signalen wordt gerealiseerd door het gebruik van een of meerdere pinholes. Vaak is de pinhole voor de detector geplaatst, zie figuur 5. Licht dat afkomstig is uit een plek in het monster die in focus ligt gaat wel door de pinhole heen en wordt dus toegelaten tot de detector. Dit is zichtbaar op het linker plaatje van figuur 5. In de middelste afbeelding van figuur 5 is zichtbaar hoe de lichtstralen lopen wanneer een plek in het monster niet in focus ligt. In een confocale microscoop wordt het object doorgaans verlicht door een laser. De confocale microscoop die bij dit onderzoek gebruikt wordt kan licht met een golflengte van 488 nm en 568 nm uitstralen. In figuur 3, het spectrum van wit licht, is zichtbaar dat het licht met een golflengte van 488 nm blauw is en het licht met een golflengte van 568 nm geel is. Het licht wat afkomstig is uit de laser passeert een zogenoemde pinhole apertuur en wordt gedeeltelijk gereflecteerd door een halfdoorlatende spiegel. De laserstraal verandert hierbij van richting. Een deel van het licht wordt toegelaten tot het object en een ander deel schijnt door de spiegel heen, zie figuur 5 rechts [15].
Figuur 5: Schematische weergave van de confocale microscoop [15]
2.7 Onderdelen confocale microscoop
2.7.1 Objectieven
Een van de belangrijkste onderdelen van de microscoop is het objectief. Het objectief zorgt voor de beeldvorming, vergroting en focussering.
Tijdens dit onderzoek is gebruik gemaakt van een olie objectief. Olie immersie wordt gebruikt om een sterkere vergroting van de haar mogelijk te maken. Het olie objectief heeft meestal een vergroting van 100x.
Olie immersie wordt gebruikt omdat er bij het gebruik van de objectieven met de sterkste vergroting een verstoring van het beeld kan ontstaan. Dit komt door de breking van het licht die optreedt tussen het monster en de lucht. De brekingsindex van de haar is ongeveer 1,5 bij een golflengte van 589 nm. Doordat dit gelijk is aan de brekingsindex van olie wordt de verstoring van het beeld weg gevangen.
Daarnaast beïnvloedt olie de numerieke apertuur van een objectief en verbetert de optische resolutie. De numerieke apertuur van een objectief geeft aan in welke mate een objectief in staat is licht op te vangen en met behulp daarvan veel details van een object af te beelden. De numerieke apertuur kan bepaald worden Aan de hand van de formule NA= n * sin ø hierin staat NA voor numerieke apertuur, n staat voor de brekingsindex van het medium tussen de lens en het object en ø staat voor de hoek die de straal maakt met de optische as.
Daarnaast zorgt de kleine werkafstand tussen het preparaat en het olie objectief ook weer voor een hogere numerieke apertuur [17][18][19][20][21].
2.7.2 Spiegels
Een dichroïsche spiegel heeft de eigenschap de ene golflengte te reflecteren en een andere golflengte door te laten. Een dichroïsche spiegel biedt de mogelijkheid overmatig excitatie licht te filteren. De dichroïsche spiegel wordt vooral gebruikt bij fluorescentie. De hoek die het licht met de spiegel maakt kan aangepast worden. Tijdens dit onderzoek is echter geen gebruik gemaakt van de dichroïsche spiegel, er is namelijk geen gebruik gemaakt van fluorescentie. In dit onderzoek is gebruik gemaakt van de halfdoorlatende spiegel. Deze spiegel zorgt ervoor dat de laserstraal die de pinhole passeert, gedeeltelijk gereflecteerd wordt door de spiegel. De laserstraal verandert hierbij van richting. Hierdoor wordt een deel van het licht toegelaten tot het object en schijnt een ander deel van het licht door de spiegel heen[15][18].
2.7.3 Pinhole
De confocale laser scanning microscoop maakt gebruik van pinholes. De pinhole van de microscoop waarvan in dit onderzoek gebruik gemaakt is, heeft een diameter van 10 tot 1000 µm.
De pinhole zorgt ervoor dat het focus punt van het object wordt verkleind tot een beperkt oppervlak van ongeveer een micron groot. Hierdoor kunnen relatief dikke objecten worden afgebeeld in opeenvolgende volumes door een reeks van optische secties te maken langs de optische Z-‐as van de microscoop.
Een kleine pinhole zorgt voor een hogere resolutie in de afbeeldingen. Een grotere pinhole daarentegen laat meer achtergrondsignaal door tot de detector. Hierdoor wordt dit achtergrondsignaal ook zichtbaar in de afbeeldingen. In conventionele microscopen zullen dikkere objecten een afbeelding produceren die scherpe beelddetails van het in-‐focus punt zal bevatten. Echter zullen in dezelfde afbeelding ook de vage beelden van de onderliggende lagen die zichtbaar zijn [18].
2.7.4 Focusserende tafel
De Z-‐stack functie biedt de mogelijkheid om zonder het preparaat te beschadigen een serie van optische segmenten te maken langs de Z-‐as van het preparaat. Dit gebeurt terwijl het preparaat intact blijft. Hierdoor kunnen zelfs afbeeldingen van levende organismen worden gemaakt. Ook kunnen hierdoor driedimensionale afbeeldingen van dikke, doorzichtige objecten, zoals biologische cellen en weefsels gemaakt worden. Op een vergelijkbare manier biedt de confocale microscoop de mogelijkheid om oppervlaktes van driedimensionale objecten en structuren met meerdere lagen zichtbaar te maken.
Dit gebeurt ook weer zonder contact met het object en op een niet destructieve manier. Naast de Z-‐stack functie bevat de confocale microscoop ook een x/y scanner. Dit zijn spiegels waarbij de hoek die de lichtstraal met de spiegel maakt steeds verandert. Deze verandering vindt plaats doordat de spiegels afzonderlijk van elkaar op en neer bewegen. Hierdoor wordt stapje voor stapje steeds meer van het uiteindelijke gemeten beeld langs de X-‐ en Y-‐as van het preparaat gevormd [18].
2.7.5 Detector
Er zijn veel verschillende soorten detectors die in een confocale microscoop gebruikt kunnen worden. De confocale microscoop die in dit onderzoek gebruikt werd bevat een Photo Multiplier Tube (PMT). Dit is een detector die is opgebouwd uit een elektronenbuis waarmee zeer zwakke lichtsignalen kunnen worden gemeten.
De detector zet het licht om in een elektrisch signaal en is gekoppeld aan een computer. De computer zorgt ervoor dat de afbeelding pixel voor pixel opgebouwd wordt. In de praktijk gebeurt dit ongeveer drie keer per seconde bij een afbeelding met een formaat van 512 bij 512 pixels. Indien er naar een kleiner veld wordt gekeken, kan het beeld zelfs nog sneller gevormd worden. De opgebouwde afbeelding wordt op de computer opgeslagen en de digitale datasets zijn geschikt voor verdere beeldbewerking [19].
2.8 Automatisering van de dataverwerking
Analyse van de pigmentverdeling in een haar is een manier om haren van verschillende donoren van elkaar te kunnen scheiden. Allereerst worden hiervoor afbeeldingen van haren middels confocale microscopie opgenomen. Hierbij wordt een reeks van 2 dimensionale afbeeldingen van verschillende posities of de Z-‐as van een haar opgenomen. Echter zijn de afbeeldingen die in dit onderzoek zijn gebruikt allemaal opgenomen op een vaste afstand van 1 micron van elkaar. Dit resulteert in een 3 dimensionale dataset. Het is de bedoeling dat de ‘echte’ pigmentkorrels uit deze dataset worden gehaald. Er wordt dus een scheiding gemaakt tussen ‘echte’
pigmentkorrels en achtergrond of ruis. Dit proces wordt segmentatie genoemd.
Pigmentkorrels hebben in de datasets een relatief hoge grijswaarde en de achtergrond, haar met geen of weinig pigment en/of lucht, hebben een relatieve lage grijswaarde. Dit gegeven maakt het mogelijk de segmentatie uit te voeren op basis van grijswaarde. De segmentatie werd in eerste instantie handmatig uitgevoerd en naderhand werd gekozen voor een geavanceerde segmentatie methode die goed tegen ruis kan [22][23].
3. Methode
3.1 Optimalisatie: Intensiteit in de afbeeldingen
Uit de resultaten die verkregen waren tijdens het eerste deel van dit onderzoek bleek dat de intensiteit in de verkregen afbeeldingen niet stabiel was. Dit gegeven bemoeilijkte de resultatenverwerking en vergelijking van afzonderlijke afbeeldingen. Om deze reden werd besloten onderzoek te doen naar de reproduceerbaarheid van de ontwikkelde methode en de reproduceerbaarheid van de confocale microscoop. Hierbij werd met name gelet op de intensiteit in de verkregen afbeeldingen van de metingen aan de haarmonsters. Onder andere door de verandering van intensiteit per afbeelding, bleken de metingen ook niet altijd even reproduceerbaar te zijn. Er werd onderzocht hoe de intensiteit in de afbeeldingen constant gehouden kon worden. Tijdens het eerste deel van het onderzoek werd al ontdekt dat de laser optimaal is ingesteld indien er een waarde van 6,1A verschijnt bij Tube Current. Ook was het al bekend dat de laser warmer wordt naarmate deze langer aanstaat. Dit zou een oorzaak kunnen zijn voor de intensiteitsverschillen in de verkregen afbeeldingen. Om hier achter te komen werden 6 metingen uitgevoerd aan een standaard, in dit geval was dat een objectglas, zie tabel 1. De eerste meting werd meteen nadat de laser aangezet was uitgevoerd. De tweede meting werd 10 minuten later uitgevoerd waarna de volgende 4 metingen steeds na 10 minuten
volgden. Tussendoor werd gecontroleerd of de waarde bij Tube Current op 6,1A bleef, indien dit niet het geval was werd dit aangepast. De standaard werd steeds voor ¾ deel in beeld gebracht en ¼ deel van de afbeelding was achtergrond. De resultaten hiervan zijn opgenomen in 4.1.
Tabel 1: Metingen met betrekking tot intensiteit verschillen.
Verstreken tijd nadat laser werd aangezet
Tube current en intensiteit Tijd
0 minuten 6,1 A 40% 14:30 10 minuten 6,1 A 35% 14:40 20 minuten 6,1 A 35% 14:50 30 minuten 6,1 A 35% 15:00 40 minuten 6,1 A 35% 15:10 50 minuten 6,1 A 35% 15:20
3.2 Optimalisatie: Kalibratie instellingen
Om afbeeldingen te verkrijgen die niet onder-‐ of overbelicht waren en om constante belichting tussen metingen door te verkrijgen werd een kalibratiestap ingezet. Eerst werd een aantal standaarden gemeten om te kunnen bepalen welke standaard het beste als kalibratiestandaard gebruikt kon worden. Hierbij werden metingen uitgevoerd aan de volgende standaarden:
- Wit papier;
- Teflon op een objectglas; - Reflectance standard; - Scalpel;
- Aluminium folie; - Objectglas.
Tijdens de meting werd eerst scherp gesteld op de standaard. Het was van belang dat de standaard een zo homogeen mogelijke afbeelding opleverde. Om te kunnen bepalen welke kalibratie standaard het meest geschikt was, werd bij alle standaarden het histogram bijbehorend bij de verkregen confocale afbeelding bekeken.
