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Author: Welten, S.M.J.
Title: The role of 14q32 microRNAs in vascular remodelling
Issue Date: 2017-03-09
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Circ Res 2014 Sep 26;115:696-708
SMJ Welten1,2Ύ
:EDĂƐƟĂĂŶƐĞŶ1,2Ύ ZDĚĞ:ŽŶŐ1,2 DZĚĞsƌŝĞƐ1,2 ,WĞƚĞƌƐ1,2 DŽŽŶƐƚƌĂ1
^W^ŚĞŝŬŚϯ E>ĂDŽŶŝĐĂϰ
Z<ĂŶĚŝŵĂůůĂϰ W,YƵĂdž1,2
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ΎƵƚŚŽƌƐĐŽŶƚƌŝďƵƚĞĚĞƋƵĂůůLJƚŽƚŚŝƐǁŽƌŬ
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Chapter 3-I
ϲϬ
Abstract
ZĂƟŽŶĂůĞ͗īĞĐƟǀĞŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶŝƐĐƌƵĐŝĂůĨŽƌƌĞĐŽǀĞƌLJĂŌĞƌĐĂƌĚŝŽǀĂƐĐƵůĂƌĞǀĞŶƚƐ͘
KďũĞĐƟǀĞ͗ƐŵŝĐƌŽZEƐƌĞŐƵůĂƚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƵƉƚŽƐĞǀĞƌĂůŚƵŶĚƌĞĚƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ͕ǁĞƐĞƚŽƵƚƚŽ
ŝĚĞŶƟĨLJŵŝĐƌŽZEƐƚŚĂƚƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐŝŶĂůůƉĂƚŚǁĂLJƐŽĨƚŚĞŵƵůƟĨĂĐƚŽƌŝĂůŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶƉƌŽĐĞƐƐ͘
hƐŝŶŐǁǁǁ͘ƚĂƌŐĞƚƐĐĂŶ͘ŽƌŐ͕ǁĞƉĞƌĨŽƌŵĞĚĂƌĞǀĞƌƐĞƚĂƌŐĞƚƉƌĞĚŝĐƟŽŶĂŶĂůLJƐŝƐŽŶĂƐĞƚŽĨϭϵϳŐĞŶĞƐ
ŝŶǀŽůǀĞĚŝŶŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘tĞĨŽƵŶĚĞŶƌŝĐŚŵĞŶƚŽĨďŝŶĚŝŶŐƐŝƚĞƐĨŽƌϮϳŵŝĐƌŽZEƐŝŶĂƐŝŶŐůĞ
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ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶŝŶŵŝĐĞĨŽůůŽǁŝŶŐƐŝŶŐůĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJůŝŐĂƟŽŶ͘
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ĂĨƵůůƌĞĐŽǀĞƌLJŽĨƉĞƌĨƵƐŝŽŶĂŌĞƌϳĚĂLJƐ;ǀƐ͘ϲϬйŝŶĐŽŶƚƌŽůͿ͘/ŶĐƌĞĂƐĞĚĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌLJĚŝĂŵĞƚĞƌƐ
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ŽŶĐůƵƐŝŽŶ͗dŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌŝƐŚŝŐŚůLJŝŶǀŽůǀĞĚŝŶŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨ
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ƚŚĞƌĂƉĞƵƟĐŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘
3-I
/ŶƚƌŽĚƵĐƟŽŶ
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ĂŌĞƌ Ă ĐĂƌĚŝŽǀĂƐĐƵůĂƌ ĞǀĞŶƚ͘ EĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ ŝƐ ĐŽŵƉƌŝƐĞĚ ŽĨ ĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ ĂŶĚ ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͘
ƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐŝƐĚĞĮŶĞĚďLJƚŚĞŵĂƚƵƌĂƟŽŶŽĨƉƌĞͲĞdžŝƐƟŶŐĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐŝŶƚŽŵĂƚƵƌĞĐŽůůĂƚĞƌĂů
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ĂƌƚĞƌŝŽůĞƐ͘dŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞƐŝŶŇŽǁ͕ƐŚĞĂƌƐƚƌĞƐƐĂŶĚĐŝƌĐƵŵĨĞƌĞŶƟĂůƐƚƌĞƚĐŚĂĐƟǀĂƚĞƚŚĞĂƌƚĞƌŝŽůĂƌǁĂůů
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ŽƵƚǁĂƌĚƌĞŵŽĚĞůŝŶŐŽĨƚŚĞĂƌƚĞƌŝŽůĞ͘ŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐŝƐĚĞĮŶĞĚďLJƚŚĞƐƉƌŽƵƟŶŐŽĨŶĞǁĐĂƉŝůůĂƌŝĞƐĨƌŽŵ
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ŽƚŚĞƌƐ͕ ƚŚĞ ,LJƉŽdžŝĂͲ/ŶĚƵĐŝďůĞ &ĂĐƚŽƌ ϭɲ ;,/&ϭɲͿ͕ ŝƐĐŚĞŵŝĂ ůĞĂĚƐ ƚŽ ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ƉƌŽͲĂŶŐŝŽŐĞŶŝĐ
ŐƌŽǁƚŚĨĂĐƚŽƌƐ͕ƚƌŝŐŐĞƌŝŶŐŶĞĂƌďLJǀĂƐĐƵůĂƌĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĐĞůůƐ;ƐͿƚŽĨŽƌŵƐƉƌŽƵƚƐƚŽǁĂƌĚƐƚŚĞŝƐĐŚĞŵŝĐ
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ĨĂĐŝůŝƚĂƟŶŐĞdžƚƌĂĐĞůůƵůĂƌŵĂƚƌŝdžƌĞĂƌƌĂŶŐĞŵĞŶƚ͕ĐĞůůŐƌŽǁƚŚĂŶĚƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͘
ŽƚŚĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŶĚĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂƌĞŚŝŐŚůLJŵƵůƟĨĂĐƚŽƌŝĂůƉƌŽĐĞƐƐĞƐĂŶĚLJĞƚĐůŝŶŝĐĂůƚƌŝĂůƐĂŝŵŝŶŐ
ƚŽŝŶĚƵĐĞŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶŝŶƉĂƟĞŶƚƐǁŝƚŚŽĐĐůƵƐŝǀĞĂƌƚĞƌŝĂůĚŝƐĞĂƐĞŚĂǀĞƐŽĨĂƌŽŶůLJĨŽĐƵƐĞĚŽŶ
ƐŝŶŐůĞͲĨĂĐƚŽƌƚŚĞƌĂƉĞƵƟĐƐ͕ƐƵĐŚĂƐŐƌŽǁƚŚĨĂĐƚŽƌƐ;ĨŽƌĞdžĂŵƉůĞsĂƐĐƵůĂƌŶĚŽƚŚĞůŝĂů'ƌŽǁƚŚ&ĂĐƚŽƌ
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ƚŚĂŶ ĂŶƟĐŝƉĂƚĞĚ
ϭ͕ ϯ͕ ϰ͘ 'ƌŽǁƚŚ ĨĂĐƚŽƌƐ ŽŶůLJ ƚĂƌŐĞƚ ŽŶĞ ŽĨ ŵƵůƟƉůĞ ƉƌŽĐĞƐƐĞƐ ƌĞƋƵŝƌĞĚ ĨŽƌ ĞĸĐŝĞŶƚ
ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘dŚĞƌĞĨŽƌĞ͕ƚŚĞƌĞŝƐĂŶĞĞĚĨŽƌŶŽǀĞůƉƌŽͲĂƌƚĞƌŝŽͲĂŶĚƉƌŽͲĂŶŐŝŽŐĞŶŝĐĨĂĐƚŽƌƐƚŚĂƚ
ĐĂŶĂĐƚĂƐŵĂƐƚĞƌƐǁŝƚĐŚĞƐŝŶŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘
DŝĐƌŽZEƐ ;ŵŝZƐͿ ĂƌĞ ĞŶĚŽŐĞŶŽƵƐ ZE ŵŽůĞĐƵůĞƐ ƚŚĂƚ ĚŽǁŶͲƌĞŐƵůĂƚĞ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ ƚŚĞŝƌ ƚĂƌŐĞƚ
ŐĞŶĞƐ
ϱ͘DŝZƐĚŽŶŽƚĐŽŵƉůĞƚĞůLJƐŝůĞŶĐĞƚŚĞŝƌƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ͕ďƵƚƌĂƚŚĞƌĚŽǁŶͲƚƵŶĞƚŚĞŝƌĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ͘
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ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶĐĂŶŚĂǀĞĂŵĂũŽƌŝŵƉĂĐƚ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨĂƐŝŶŐůĞŵŝZĐĂŶƚŚƵƐůĞĂĚƚŽĂĐƟǀĂƟŽŶŽĨĞŶƟƌĞ
ŵƵůƟĨĂĐƚŽƌŝĂůƉŚLJƐŝŽůŽŐŝĐĂůƉƌŽĐĞƐƐĞƐ͘
^ĞǀĞƌĂůƐƚƵĚŝĞƐŚĂǀĞďĞĞŶƉƵďůŝƐŚĞĚŽŶƚŚĞĞīĞĐƚƐŽĨŵŝZŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͕ďƵƚŝŶ
ŐĞŶĞƌĂů͕ƚŚĞĨŽĐƵƐŽĨƚŚĞƐĞƐƚƵĚŝĞƐůŝĞƐǁŝƚŚĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂůŽŶĞ͕ŶŽƚĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ
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ƐƚƵĚLJ͕ǁĞĞdžƉůŽŝƚĞĚƚŚĞŵĂƐƚĞƌƐǁŝƚĐŚĐŚĂƌĂĐƚĞƌŽĨŵŝZƐŝŶŽƌĚĞƌƚŽŝĚĞŶƟĨLJŵŝZƐƚŚĂƚƉůĂLJĂƌĞŐƵůĂƚŽƌLJ
ƌŽůĞŝŶŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶĂƐĂǁŚŽůĞ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐďŽƚŚĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŶĚĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͘tĞƉĞƌĨŽƌŵĞĚ
Ă ͚ƌĞǀĞƌƐĞ ƚĂƌŐĞƚ ƉƌĞĚŝĐƟŽŶ͛ ĂŶĂůLJƐŝƐ ;ZdWͿ ŽŶ Ă ƐĞƚ ŽĨ ŶĞĂƌůLJ ϮϬϬ ŐĞŶĞƐ ŝŶǀŽůǀĞĚ ŝŶ Ăůů ĨĂĐĞƚƐ ŽĨ
ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŶĚĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͕ĂŝŵŝŶŐƚŽŝĚĞŶƟĨLJŵŝZƐƚŚĂƚĐĂŶƚĂƌŐĞƚŵƵůƟƉůĞŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ
ŐĞŶĞƐ͘ tĞ ĨŽƵŶĚ ĞŶƌŝĐŚŵĞŶƚ ŽĨ ƉƵƚĂƟǀĞ ƚĂƌŐĞƚ ƐŝƚĞƐ ĨŽƌ Ϯϳ ŵŝZƐ ƚŚĂƚ ĂƌĞ Ăůů ůŽĐĂƚĞĚ ŝŶ ŽŶĞ ůĂƌŐĞ
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ĂƌĞƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚĨƌŽŵŽŶĞƉŽůLJĐLJƐƚƌŽŶŝĐƐŝƚĞŽŶƚŚĞŝŵƉƌŝŶƚĞĚ><ϭͲƌĞŐŝŽŶŽŶƚŚĞůŽŶŐĂƌŵŽĨŚƵŵĂŶ
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dŚĞϭϰƋϯϮŵŝZŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌǁĂƐĮƌƐƚĚŝƐĐŽǀĞƌĞĚŝŶϮϬϬϰ͕ďLJ^ĞŝƚnjĞƚĂů
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ŐĞŶĞƐ;ϲϭŝŶŵŝĐĞͿ͘dŚĞĐůƵƐƚĞƌŝƐŚŝŐŚůLJĐŽŶƐĞƌǀĞĚŝŶŵĂŵŵĂůƐ͕ďƵƚŶŽƚŝŶŽƚŚĞƌǀĞƌƚĞďƌĂƚĞƐŽƌŝŶ
ŝŶǀĞƌƚĞďƌĂƚĞƐ͘ůƚŚŽƵŐŚŵĂŶLJŵŝZƐĂƌĞƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚĨƌŽŵƉŽůLJĐŝƐƚƌŽŶŝĐŵŝZŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌƐ͕ƚŚĞϭϰƋϯϮ
ĐůƵƐƚĞƌŝƐĂŵŽŶŐƚŚĞůĂƌŐĞƐƚŬŶŽǁŶŵŝZŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌƐŝŶĂŶLJƐƉĞĐŝĞƐ͘dŚĞĨĂĐƚƐƚŚĂƚƚŚĞĐůƵƐƚĞƌŝƐƐŽ
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ƚŚĞŐĞŶŽŵĞ͕ŚŝŶƚĂƚŝƚƐďŝŽůŽŐŝĐĂůŝŵƉŽƌƚĂŶĐĞ͘/ŶĚĞĞĚ͕ĂůŵŽƐƚĂůůϭϰƋϯϮŵŝZƐŚĂǀĞďĞĞŶŝŵƉůŝĐĂƚĞĚŝŶ
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ϭϲ͘/ŶƚĞƌĞƐƟŶŐůLJ͕ŵŽƐƚϭϰƋϯϮŵŝZƐĂƌĞƉƌĞĚŝĐƚĞĚ
ƚŽƌĞŐƵůĂƚĞĨŽĐĂůĂĚŚĞƐŝŽŶĂŶĚDŝŶƚĞƌĂĐƟŽŶƐ͕ďŽƚŚĐƌƵĐŝĂůŝŶǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐ͘<ŶŽĐŬŽƵƚŽĨƚŚĞ
ĐůƵƐƚĞƌ͕ǀŝĂŬŶŽĐŬŽƵƚŽĨƚŚĞDĞŐϯůŽĐƵƐ
ϭϳ͕ϭϴ͕ůĞĚƚŽŽǀĞƌͲĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƐĞǀĞƌĂůƉƌŽͲĂŶŐŝŽŐĞŶŝĐŐĞŶĞƐ͕
ŝŶĐůƵĚŝŶŐsĞŐĨĂĂŶĚůůϰ͕ĂŶĚĚƌĂƐƟĐĂůůLJŝŶĐƌĞĂƐĞĚǀĂƐĐƵůĂƌĐĂƉŝůůĂƌLJĚĞŶƐŝƚLJŝŶŵŽƵƐĞĞŵďƌLJŽƐ
ϭϵ. A ƌĞĐĞŶƚƐƚƵĚLJƐŚŽǁĞĚƚŚĂƚƚŚĞĐůƵƐƚĞƌŝƐƵŶĚĞƌƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůĐŽŶƚƌŽůŽĨĂďŝŶĚŝŶŐƐŝƚĞĨŽƌƚŚĞDLJŽĐLJƚĞ
ŶŚĂŶĐĞƌ&ĂĐƚŽƌϮ;D&ϮͿ
20͕ĂƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĨĂĐƚŽƌŬŶŽǁŶƚŽŝŶŇƵĞŶĐĞǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐ
21, 22. tĞƐŚŽǁŚĞƌĞƚŚĂƚŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŝŶĚŝǀŝĚƵĂůϭϰƋϯϮŵŝZƐůĞĂĚƐƚŽŝŵƉƌŽǀĞŵĞŶƚƐŝŶƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐďůŽŽĚ
ŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶǀŝǀŽ͘
3-I
Figure 1.ƐĐŚĞŵĂƟĐŽǀĞƌǀŝĞǁŽĨƚŚĞŚƵŵĂŶϭϰƋϯϮĂŶĚŵƵƌŝŶĞϭϮ&ϭůŽĐŝ͘ŽůŽƌƐŝŶĚŝĐĂƚĞǁŚĞƚŚĞƌƚŚĞŵƵƌŝŶĞŵŝZƐǁĞƌĞĞĂƌůLJ
;ƌĞĚͿ͕ůĂƚĞ;ŐƌĞĞŶͿŽƌŶŽŶͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌƐ;ďůƵĞͿĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐĞĚďLJƐŝŶŐůĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJŝŶŚĞĂůƚŚLJ
ϱϳůͬϲŵŝĐĞ͘ϭϰƋϯϮŵŝZƐƚŚĂƚǁĞƌĞŶŽƚŝŶĐůƵĚĞĚŝŶƚŚĞŵŝĐƌŽƌƌĂLJĂƌĞŝŶĚŝĐĂƚĞĚŝŶƉƵƌƉůĞĂŶĚĐŽĚŝŶŐ;ƚŚŝĐŬďĂƌƐͿĂŶĚŶŽŶͲĐŽĚŝŶŐ
ŐĞŶĞƐ;ƚŚŝŶďĂƌƐͿĂƌĞŝŶĚŝĐĂƚĞĚŝŶďůĂĐŬ͘,ƵŵĂŶďĂƐĞƉŽƐŝƟŽŶƐĂƌĞŶƵŵďĞƌĞĚĂĐĐŽƌĚŝŶŐƚŽĂƐƐĞŵďůLJ'ZŚϯϳ͘Ɖϭϯ͕ŵƵƌŝŶĞďĂƐĞ
ƉŽƐŝƟŽŶƐĂĐĐŽƌĚŝŶŐƚŽ'Zŵϯϴ͘ƉϮ͘
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Methods
ZĞǀĞƌƐĞdĂƌŐĞƚWƌĞĚŝĐƟŽŶ
dŽ ŝĚĞŶƟĨLJ ŵŝZƐ ƚŚĂƚ ĂƌĞ ŝŶǀŽůǀĞĚ ŝŶ ĂƌƚĞƌŝŽͲ ĂŶĚ ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͕ ĂŶ ŝŶ ƐŝůŝĐŽ ƌĞǀĞƌƐĞ ƚĂƌŐĞƚ ƉƌĞĚŝĐƟŽŶ ;ZdWͿ ǁĂƐ ƉĞƌĨŽƌŵĞĚ͘
ƐĞůĞĐƟŽŶǁĂƐŵĂĚĞŽĨϭϮϳŐĞŶĞƐŬŶŽǁŶĨƌŽŵůŝƚĞƌĂƚƵƌĞĂŶĚƉƌĞǀŝŽƵƐƐƚƵĚŝĞƐǁŝƚŚŝŶŽƵƌŐƌŽƵƉƚŽƉůĂLJŝŵƉŽƌƚĂŶƚƌŽůĞƐŝŶĂƌƚĞƌŝŽͲ
ĂŶĚĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ;dĂďůĞ^ϭͿ͘dŽĞŶƐƵƌĞƚŚĞŵĂƐƚĞƌƐǁŝƚĐŚĐŚĂƌĂĐƚĞƌŽĨƚŚĞŝĚĞŶƟĮĞĚŵŝZƐ͕ǁĞƐĞůĞĐƚĞĚƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐĐŽǀĞƌŝŶŐ
ĂůůĂƐƉĞĐƚƐŽĨǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůŝŶŐ͖ĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĂĐƟǀĂƟŽŶ͕ƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͕ĞdžƚƌĂĐĞůůƵůĂƌŵĂƚƌŝdžƌĞĂƌƌĂŶŐĞŵĞŶƚ͕
ĐŚĞŵŽͲĂŶĚĐLJƚŽŬŝŶĞƐĂŶĚƚŚĞŝƌƌĞĐĞƉƚŽƌƐ͕ŐƌŽǁƚŚĨĂĐƚŽƌƐĂŶĚƚŚĞŝƌƌĞĐĞƉƚŽƌƐ͕ƚŚĞŶĂƚƵƌĂůŬŝůůĞƌĐŽŵƉůĞdž͕ƉƌŽͲĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶŝĐĂŶĚƉƌŽͲ ĂŶŐŝŽŐĞŶŝĐƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĨĂĐƚŽƌƐĂŶĚƐŝŐŶĂůŝŶŐŵŽůĞĐƵůĞƐ;dĂďůĞ^ϭͿ͘tĞƚŚĞŶƵƐĞĚǁǁǁ͘ƚĂƌŐĞƚƐĐĂŶ͘ŽƌŐƚŽ͕ĨŽƌĞĂĐŚŝŶĚŝǀŝĚƵĂůŐĞŶĞ͕
ŐĞŶĞƌĂƚĞĂůŝƐƚŽĨĂůůŵŝZƐƉƌĞĚŝĐƚĞĚƚŽƚĂƌŐĞƚƚŚĞƐĞϭϮϳŐĞŶĞƐ͘ĂĐŚůŝƐƚ͕ŶŽƌĞƐƚƌŝĐƟŽŶƐǁĞƌĞĂƉƉůŝĞĚ͕ǁĂƐĐŽƉŝĞĚŝŶƚŽĂƐƉƌĞĂĚƐŚĞĞƚ
ĂŶĚĨŽƌĞĂĐŚŵŝZǁĞƐŝŵƉůLJĐŽƵŶƚĞĚƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨƟŵĞƐŝƚǁĂƐƉƌĞƐĞŶƚŝŶƚŚĞĮůĞ͘
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ĂƚƚŚĞƐŝƚĞŽĨĂĐƟǀĞĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͕ƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŐƌŽƵƉ͕ŝŶϱϳůͬϲŵŝĐĞƐƵďũĞĐƚĞĚƚŽƐŝŶŐůĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞůĞŌĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ
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MicroRNA Inhibitors
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Hind Limb Ischemia Models
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3-I
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Results
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ŽĨƚŚĞŝŶŝƟĂůϮϳŝĚĞŶƟĮĞĚϭϰƋϯϮŵŝZƐǁĂƐƌĞĐŽǀĞƌĞĚ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱ;ϭϬ͕
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ĮŶĚŝŶŐƐĨŽƌϭϰƋϯϮŵŝZƐŝŶZdWϭĂŶĚZdWϮĂƌĞƐƵŵŵĂƌŝnjĞĚŝŶKŶůŝŶĞdĂďůĞ///͘
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ĐŽƌƌĞƐƉŽŶĚŝŶŐ ƚŽ ĚĂLJ ϰ ĂŌĞƌ ŝŶũĞĐƟŽŶ͕ ĐŽŵƉĂƌĞĚ ƚŽ ƚŚĞ '^KͲĐŽŶƚƌŽů͘ ƚ ĚĂLJ ϳ ĂŌĞƌ ƐƵƌŐĞƌLJ͕ ĚĂLJ
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ŝƐĐŚĞŵŝĂ͕ /ZͲϴϬϬͲůĂďĞůůĞĚ '^KͲϯϮϵ ǁĂƐ ǀŝƐƵĂůŝnjĞĚ ĂŌĞƌ ŝŶũĞĐƟŽŶ͘ ůƌĞĂĚLJ ǁŝƚŚŝŶ ŽŶĞ ŚŽƵƌ ĂŌĞƌ
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'^KƐǁĂƐĐůĞĂƌůLJǀŝƐŝďůĞŝŶĂůůŽƌŐĂŶƐĂŶĚƟƐƐƵĞƐ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐďůŽŽĚǀĞƐƐĞůƐ;ĂŽƌƚĂĂŶĚǀĞŶĂĐĂǀĂ͕ďƵƚŶŽƚ
ŝŶƚŚĞďƌĂŝŶ͕ǁŚŝĐŚǁĂƐƚŚĞŶƵƐĞĚƚŽŶŽƌŵĂůŝnjĞĚLJĞͲŝŶƚĞŶƐŝƟĞƐĂƐĂŵĞĂƐƵƌĞŽĨƟƐƐƵĞͲƵƉƚĂŬĞ;&ŝŐƵƌĞ
ϯ:Ϳ͘ůƚŚŽƵŐŚƉƌĞƐĞŶƚ͕ƚŚĞĚLJĞͲƐŝŐŶĂůŝŶďŽƚŚƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌĂŶĚĐĂůĨŵƵƐĐůĞƐǁĂƐǀĞƌLJǁĞĂŬ;&ŝŐƵƌĞƐ
ϯ͕ϯĂŶĚϯ'Ϳ͘,ŽǁĞǀĞƌŝŶĂŶŝŵĂůƐƐƵďũĞĐƚĞĚƚŽŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂϮϰŚŽƵƌƐĂŌĞƌ'^KŝŶũĞĐƟŽŶ͕
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3-I
Figure 2. DŝZŝŶŚŝďŝƟŽŶŝŶƉƌŝŵĂƌLJŚƵŵĂŶĂƌƚĞƌŝĂůŵLJŽĮďƌŽďůĂƐƚƐĂŶĚŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨŵŝĐĞƐƵďũĞĐƚĞĚƚŽ,ŝŶĚ>ŝŵď
/ƐĐŚĞŵŝĂ͘;Ϳ/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŝŶĚŝǀŝĚƵĂůϭϰƋϯϮŵŝZƐŝŶŵLJŽĮďƌŽďůĂƐƚƐĨŽƌϰϴŚŽƵƌƐďLJĂŶƚĂŐŽŵŝZƐ;ϭϬŶŐͬђůͿ͘;Ϳ/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŝŶĚŝǀŝĚƵĂů
ϭϰƋϯϮŵŝZƐŝŶŵLJŽĮďƌŽďůĂƐƚƐĨŽƌϰϴŚƌƐďLJ'^KƐ;ϭϬŶŐͬђůͿ͘DĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐ͕ĨƌŽŵĂƚůĞĂƐƚϯŝŶĚĞƉĞŶĚĞŶƚĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐ͕
ƌĞůĂƟǀĞƚŽŵŝZͲϭϬϯĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞц^D͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͕ΎΎƉфϬ͘Ϭϭ͘;ͿdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝZƐŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨϱϳůͬϲ
ŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵ͕'^KͲϰϴϳď͕'^KͲϰϵϰĂŶĚ'^KϰϵϱŽƌ'^KͲĐŽŶƚƌŽů;ϭŵŐͬŵŽƵƐĞͿĂƚϯ͕ϳĂŶĚϭϳĚĂLJƐĂŌĞƌĚŽƵďůĞůŝŐĂƟŽŶ
ŽĨƚŚĞůĞŌĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨϮ;ĚĂLJϯͿ͕ϵ;ĚĂLJϳͿĂŶĚϭϬ;ĚĂLJϭϳͿŵŝĐĞǁĂƐƵƐĞĚ͘DĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ
ůĞǀĞůƐƌĞůĂƟǀĞƚŽůĞƚͲϳĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞц^D͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘
ϲϴ
ƵƉŝŶƚŽƚŚĞůŝǀĞƌ͕ƚŚĞĨĞĐĞƐĂƚϰϴŚŽƵƌƐĚŝĚŶŽƚĐŽŶƚĂŝŶĂŶLJůĂďĞů͘,ŽǁĞǀĞƌ͕ďŽƚŚŬŝĚŶĞLJƐĂŶĚƵƌŝŶĞĂƚϰϴ
ŚŽƵƌƐŐĂǀĞǀĞƌLJŚŝŐŚĚLJĞŝŶƚĞŶƐŝƟĞƐ͕ŝŶĚŝĐĂƟŶŐƚŚĂƚ'^KƐĂƌĞĐůĞĂƌĞĚƉƌĞĚŽŵŝŶĂŶƚůLJǀŝĂƚŚĞŬŝĚŶĞLJƐ͘
ůƚŚŽƵŐŚŝŶƚĞŶƐŝƟĞƐĚƌŽƉƉĞĚƐůŝŐŚƚůLJŝŶŵŽƐƚŽƌŐĂŶƐĂƚϰϴŚŽƵƌƐĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽŽŶĞŚŽƵƌĂŌĞƌŝŶũĞĐƟŽŶ͕
ĚLJĞŝŶƚĞŶƐŝƟĞƐǁĞƌĞƐƟůůŚŝŐŚƚŚƌŽƵŐŚŽƵƚƚŚĞďŽĚLJĂŌĞƌϰϴŚŽƵƌƐ͕ŝŶĚŝĐĂƟŶŐƐůŽǁĐůĞĂƌĂŶĐĞ͕ǁŚŝĐŚ
ƐƵƉƉŽƌƚƐƚŚĞƉƌŽůŽŶŐĞĚŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝĐƌŽZEƐƚŚĂƚǁĞŽďƐĞƌǀĞĚŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŽĨŵŝĐĞ
ƐƵďũĞĐƚĞĚƚŽŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂ͘
Figure 3. dŝƐƐƵĞƵƉƚĂŬĞĂŶĚďŝŽĚŝƐƚƌŝďƵƟŽŶŽĨ'^KƐ͘hƉƚĂŬĞŽĨ/LJĞϴϬϬtůĂďĞůůĞĚ'^KͲϯϮϵĂƚϭŚŽƵƌ;ůĞŌƉĂŶĞůƐͿĂŶĚϰϴŚŽƵƌƐ
;ƌŝŐŚƚƉĂŶĞůƐͿĂŌĞƌŝ͘ǀ͘ŝŶũĞĐƟŽŶ͘KǀĞƌůĂLJŝŵĂŐĞƐŽĨǁŚŽůĞĂŶŝŵĂůƐ;ĂŶĚͿĂŶĚŶĞĂƌͲŝŶĨƌĂƌĞĚ;ĂŶĚͿ͕ǁŚŝƚĞ;ĂŶĚ&ͿĂŶĚŽǀĞƌůĂLJ
;'ĂŶĚ,ͿŽĨŝŶĚŝǀŝĚƵĂůŽƌŐĂŶƐƐŚŽǁŝŶŐƵƉƚĂŬĞŽĨ'^KƐďLJǀĂƌŝŽƵƐŽƌŐĂŶƐ͘;/Ϳ^ĐŚĞŵĂƟĐƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟŽŶŽĨŽƌŐĂŶƐƐŚŽǁŶŝŶƉĂŶĞůƐ
Ͳ,͘;:ͿŶĞĂƌͲŝŶĨƌĂƌĞĚŇƵŽƌĞƐĐĞŶĐĞŽĨŝŶĚŝǀŝĚƵĂůŽƌŐĂŶƐƌĞůĂƟǀĞƚŽŇƵŽƌĞƐĐĞŶĐĞŽĨƚŚĞďƌĂŝŶ͘
3-I
ůŽŽĚ&ůŽǁZĞĐŽǀĞƌLJ/ŶsŝǀŽ
DŝĐĞǁĞƌĞŐŝǀĞŶĂďŽůƵƐŝŶũĞĐƟŽŶŽĨϭŵŐ'^KŝŶW^͕ŽƌW^ĂůŽŶĞ͕ǀŝĂƚŚĞƚĂŝůǀĞŝŶ͘dŚĞŶĞdžƚĚĂLJ͕
ƚŚĞLJǁĞƌĞƐƵďũĞĐƚĞĚƚŽĚŽƵďůĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞůĞŌĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͕ĂŵŽĚĞůĨŽƌƐĞǀĞƌĞƉĞƌŝƉŚĞƌĂůĂƌƚĞƌLJ
ĚŝƐĞĂƐĞ͘ůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJƚŽƚŚĞƉĂǁǁĂƐĨŽůůŽǁĞĚďLJ>W/ƵƉƚŽϭϳĚĂLJƐĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂ͘
DŝĐĞŝŶĂůůŐƌŽƵƉƐĂƉƉĞĂƌĞĚŚĞĂůƚŚLJĂŶĚŶŽƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚǁĞŝŐŚƚůŽƐƐǁĂƐŽďƐĞƌǀĞĚ͘ůůĨŽƵƌƚƌĞĂƚŵĞŶƚ
ŐƌŽƵƉƐ͕'^KͲϯϮϵ͕'^KͲϰϴϳď͕'^KͲϰϵϰĂŶĚ'^KͲϰϵϱ͕ƐŚŽǁĞĚĚƌĂƐƟĐĂůůLJŝŵƉƌŽǀĞĚďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJ
ĐŽŵƉĂƌĞĚ ƚŽ ďŽƚŚ ƚŚĞ W^ ĂŶĚ ƚŚĞ '^KͲĐŽŶƚƌŽů ŐƌŽƵƉƐ ;&ŝŐƵƌĞƐ ϰͲͿ͘ dŚĞƌĞ ǁĞƌĞ ŶŽ ƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ
ĚŝīĞƌĞŶĐĞƐďĞƚǁĞĞŶƚŚĞW^ĂŶĚ'^KͲĐŽŶƚƌŽůŐƌŽƵƉƐ͘DŝĐĞƚŚĂƚƌĞĐĞŝǀĞĚĞŝƚŚĞƌ'^KͲϯϮϵŽƌ'^KͲ ϰϵϱƐŚŽǁĞĚĂŶŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶƉĞƌĨƵƐŝŽŶĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽůĂƐĞĂƌůLJĂƐϯĚĂLJƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨ
ŝƐĐŚĞŵŝĂ͘dŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶƉĞƌĨƵƐŝŽŶƉĞƌƐŝƐƚĞĚŽǀĞƌƟŵĞŝŶďŽƚŚŐƌŽƵƉƐĂŶĚŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲ ϯϮϵĞǀĞŶŵĂĚĞĂĨƵůůƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶƉĂǁƉĞƌĨƵƐŝŽŶǁŝƚŚŝŶĂŶĂƐƚŽƵŶĚŝŶŐƐĞǀĞŶĚĂLJƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨ
ŝƐĐŚĞŵŝĂ͕ĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽĂƉƉƌŽdžŝŵĂƚĞůLJϲϬйƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶ'^KͲĐŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ;&ŝŐƵƌĞƐϰĂŶĚϰͿ͘
DŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϰϵϱŽƌ'^KͲϰϵϰŚĂĚŶĞĂƌůLJĨƵůůLJƌĞĐŽǀĞƌĞĚƉĞƌĨƵƐŝŽŶĂŌĞƌƚĞŶĚĂLJƐĨŽůůŽǁĞĚ
ďLJŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϰϴϳďĂƚƚǁŽǁĞĞŬƐ͘dŚĞ'^KͲĐŽŶƚƌŽůĂŶĚW^ŐƌŽƵƉƐĚŝĚŶŽƚŵĂŬĞĨƵůů
ƌĞĐŽǀĞƌŝĞƐďĞĨŽƌĞďĞŝŶŐƐĂĐƌŝĮĐĞĚĂƚĚĂLJϭϳ͘
Figure 4. ůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJĂŌĞƌŝŶǀŝǀŽϭϰƋϯϮŵŝZŝŶŚŝďŝƟŽŶ͘;ͲͿYƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨ>W/ŵĞĂƐƵƌĞŵĞŶƚƐŽǀĞƌƟŵĞŝŶŵŝĐĞ;ϭϭͬ
ŐƌŽƵƉͿƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐ;ϭŵŐͬŵŽƵƐĞͿ͘ĂƚĂĂƌĞĐĂůĐƵůĂƚĞĚĂƐƚŚĞƌĂƟŽŽĨƚŚĞŝƐĐŚĞŵŝĐŽǀĞƌƚŚĞŶŽŶͲŝƐĐŚĞŵŝĐƉĂǁĂŶĚƉƌĞƐĞŶƚĞĚ
ĂƐŵĞĂŶц^D͘;ͿZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ>W/ŝŵĂŐĞƐŽĨƉĂǁƐϳĚĂLJƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨ,>/ŝŶƚŚĞůĞŌůŝŵďŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚĞŝƚŚĞƌ
'^KͲĐŽŶƚƌŽůŽƌ'^KͲϯϮϵ͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘
70
ŽůůĂƚĞƌĂůƌƚĞƌLJŝĂŵĞƚĞƌ/ŶĐƌĞĂƐĞ
/ŶĂĚĚŝƟŽŶƚŽƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞĚďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJŽďƐĞƌǀĞĚŝŶĂŶŝŵĂůƐƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵ͕'^KͲ ϰϴϳď͕'^KͲϰϵϰĂŶĚ'^KͲϰϵϱ͕ǁĞĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚƚŚĞŶƵŵďĞƌĂŶĚĚŝĂŵĞƚĞƌŽĨĂƌƚĞƌŝŽůĞƐďLJĂŶĂůLJnjŝŶŐ
ɲͲ^DƉŽƐŝƟǀĞǀĞƐƐĞůƐŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐŽĨ'^KͲƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞƐĂĐƌŝĮĐĞĚϳĚĂLJƐĂŌĞƌĚŽƵďůĞ
ůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞůĞŌĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͘ŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐĨŽƌŵĨƌŽŵƉƌĞͲĞdžŝƐƟŶŐĂƌƚĞƌŝŽůĞƐ͘dŚĞƌĞĨŽƌĞ͕ǁĞ
ǁĞƌĞŶŽƚƐƵƌƉƌŝƐĞĚƚŚĂƚƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐďĞƚǁĞĞŶƚŚĞůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚƉĂǁĞŝƚŚĞƌǁŝƚŚŝŶ
ŐƌŽƵƉƐ͕ŽƌďĞƚǁĞĞŶŐƌŽƵƉƐ͕ǁĞƌĞƐŝŵŝůĂƌŝŶĂůůŐƌŽƵƉƐ͕ĞdžĐĞƉƚĨŽƌ'^KͲϰϴϳď;&ŝŐƵƌĞϱͿ͘,ŽǁĞǀĞƌ͕ǁĞ
ĚŝĚŽďƐĞƌǀĞŝŶĐƌĞĂƐĞƐŝŶĂƌƚĞƌŝŽůĞĚŝĂŵĞƚĞƌƐďĞƚǁĞĞŶƚŚĞůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ
ƚŚĞ'^KĐŽŶƚƌŽůĨŽƌŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϰϴϳď;ϯͲĨŽůĚ͕ƉсϬ͘ϬϮͿ͘ƌƚĞƌŝŽůĞĚŝĂŵĞƚĞƌƐĂůƐŽĂƉƉĞĂƌĞĚ
ŝŶĐƌĞĂƐĞĚŝŶŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵ;Ϯ͘ϲͲĨŽůĚ͕ƉсϬ͘ϬϵͿ͕'^KͲϰϵϰ;ϭ͘ϵͲĨŽůĚ͕ƉсϬ͘ϯͿĂŶĚ'^KͲϰϵϱ
;Ϯ͘ϯĨŽůĚ͕ƉсϬ͘ϯͿ͕ŝŶĚŝĐĂƟŶŐ'^KͲŝŶĚƵĐĞĚŝŶĐƌĞĂƐĞƐŝŶĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ;&ŝŐƵƌĞϱͿ͘tŚĞŶǁĞƋƵĂŶƟĮĞĚ
ďŽƚŚĂƌƚĞƌŝŽůĞƐǁŝƚŚĂĚŝĂŵĞƚĞƌƐŵĂůůĞƌĂŶĚĂĚŝĂŵĞƚĞƌůĂƌŐĞƌƚŚĂŶϮϬђŵǁĞŽďƐĞƌǀĞĚĂƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ
ĚĞĐƌĞĂƐĞŝŶƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨƐŵĂůůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐŝŶƚŚĞůĞŌĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽƚŚĞƌŝŐŚƚƉĂǁŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ
'^KͲϯϮϵĂŶĚ'^KͲϰϴϳď;&ŝŐƵƌĞϱͿĂŶĚĂƚƌĞŶĚƚŽǁĂƌĚƐĂŶŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨůĂƌŐĞĐŽůůĂƚĞƌĂůƐ
ĨŽƌĂůůĨŽƵƌ'^KƐ;&ŝŐƵƌĞϱͿ͕ĐůĞĂƌůLJŝŶĚŝĐĂƟŶŐƌĞŵŽĚĞůŝŶŐŽĨƐŵĂůůĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐŝŶƚŽůĂƌŐĞƌ
ĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͘
ĐĐƵŵƵůĂƟŽŶŽĨŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐĂƌŽƵŶĚƚŚĞƌĞŵŽĚĞůŝŶŐĂƌƚĞƌŝŽůĞƐŝƐǀŝƐƵĂůŝnjĞĚŝŶKŶůŝŶĞ&ŝŐƵƌĞs͘
Figure 5. /ŶǀŝǀŽĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŌĞƌϭϰƋϯϮŵŝZŝŶŚŝďŝƟŽŶ͘ZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŽĨɲͲ^DƐƚĂŝŶŝŶŐŝŶƌŝŐŚƚ;ƵŶƚƌĞĂƚĞĚͿĂŶĚůĞŌ
;ůŝŐĂƚĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJͿĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞƐŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐĂŶĚ;ͿƋƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶĚŝĂŵĞƚĞƌŽĨ
ɲͲ^DнĂƌƚĞƌŝŽůĞƐ͕ƌĞůĂƟǀĞƚŽƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘EƵŵďĞƌŽĨ;ͿƚŽƚĂů͕;ͿƐŵĂůů;ĚŝĂŵĞƚĞƌфϮϬђŵͿĂŶĚ
;ͿůĂƌŐĞ;ĚŝĂŵĞƚĞƌхϮϬђŵͿĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐ͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐŽĨϵŵŝĐĞǁĞƌĞŝŶĐůƵĚĞĚ͘&ƌŽŵĞĂĐŚ
ŵƵƐĐůĞ͕ϴƐĞĐƟŽŶƐǁĞƌĞƵƐĞĚĂŶĚĨƌŽŵĞĂĐŚƐĞĐƟŽŶ͕ϭƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞƉŚŽƚŽŐƌĂƉŚǁĂƐƵƐĞĚ͘dŚĞƐĐĂůĞďĂƌƌĞƉƌĞƐĞŶƚƐϭϬϬђŵ͘ĂƚĂ
ĂƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚĂƐŵĞĂŶц^D͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘
3-I
/ŶĐƌĞĂƐĞŝŶĂƉŝůůĂƌLJĞŶƐŝƚLJ
dŚĞůĞŌ;ŝƐĐŚĞŵŝĐͿĂŶĚƌŝŐŚƚ;ŶŽƌŵŽdžŝĐͿƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐŽĨ'^KͲƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ͕ƐĂĐƌŝĮĐĞĚϳĚĂLJƐĂŌĞƌ
ĚŽƵďůĞ ůŝŐĂƟŽŶ ŽĨ ƚŚĞ ůĞŌ ĨĞŵŽƌĂů ĂƌƚĞƌLJ͕ ǁĞƌĞ ƐƚĂŝŶĞĚ ĨŽƌ ϯϭ ƚŽ ǀŝƐƵĂůŝnjĞ ĐĂƉŝůůĂƌLJ ĨŽƌŵĂƟŽŶ͘
/ŶĐƌĞĂƐĞƐŝŶĐĂƉŝůůĂƌLJĨŽƌŵĂƟŽŶĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KĐŽŶƚƌŽůǁĞƌĞŽďƐĞƌǀĞĚŝŶƚŚĞ
ůĞŌƐŽůĞŝŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵ;ϱͲĨŽůĚͿ͕'^KͲϰϴϳď;ϰͲĨŽůĚͿĂŶĚ'^KͲϰϵϱ;ϰͲĨŽůĚͿ͘ĂƉŝůůĂƌLJ
ĨŽƌŵĂƟŽŶĂůƐŽĂƉƉĞĂƌĞĚŝŶĐƌĞĂƐĞĚŝŶƚŚĞůĞŌƐŽůĞŝŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϰϵϰ;Ϯ͘ϱͲĨŽůĚͿ͕ďƵƚƚŚŝƐ
ǁĂƐŶŽƚƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ;&ŝŐƵƌĞϲͿ͘
Figure 6. /Ŷ ǀŝǀŽ ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ ĂŌĞƌ ϭϰƋϯϮ ŵŝZ ŝŶŚŝďŝƟŽŶ͘ ZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ ŝŵĂŐĞƐ ŽĨ ϯϭ ƐƚĂŝŶŝŶŐ ŝŶ ƌŝŐŚƚ ;ŶŽƌŵŽdžŝĐͿ ĂŶĚ ůĞŌ
;ŝƐĐŚĞŵŝĐͿƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐĂŶĚƋƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶϯϭнĂƌĞĂďĞƚǁĞĞŶƌŝŐŚƚĂŶĚůĞŌƐŽůĞƵƐ
ŵƵƐĐůĞƐ͕ƌĞůĂƟǀĞƚŽƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐĨƌŽŵϵŵŝĐĞǁĞƌĞ
ŝŶĐůƵĚĞĚ͘&ƌŽŵĞĂĐŚŵƵƐĐůĞ͕ϲƐĞĐƟŽŶƐǁĞƌĞƵƐĞĚĂŶĚĨƌŽŵĞĂĐŚƐĞĐƟŽŶ͕ϭƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞƉŚŽƚŽŐƌĂƉŚǁĂƐƵƐĞĚ͘dŚĞƐĐĂůĞďĂƌ
ƌĞƉƌĞƐĞŶƚƐϭϬϬђŵ͘ĂƚĂĂƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚĂƐŵĞĂŶц^D͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘
/ŶsŝǀŽdĂƌŐĞƚ'ĞŶĞZĞŐƵůĂƟŽŶ
tĞƐĞůĞĐƚĞĚƚŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐĨŽƌƚŚĞŝƌƉŽƚĞŶƟĂůƚŽƚĂƌŐĞƚĂďƌŽĂĚƌĂŶŐĞŽĨƉƌŽͲĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶŝĐĂŶĚ
ƉƌŽͲĂŶŐŝŽŐĞŶŝĐƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ͘ƐŝƚǁŽƵůĚŶŽƚďĞĨĞĂƐŝďůĞƚŽĐŽŶĮƌŵƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨĂůůƉƵƚĂƟǀĞƚĂƌŐĞƚƐ͕
ǁĞŵĂĚĞĂƐĞůĞĐƟŽŶďĂƐĞĚŽŶƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨƚĂƌŐĞƚƐŝƚĞƐ͕ĐŽŶƐĞƌǀĞĚďĞƚǁĞĞŶŚƵŵĂŶƐĂŶĚŵŝĐĞ͕ŝŶƚŚĞ
ϯ͛hdZƐŽĨƉŽƚĞŶƟĂůϭϰƋϯϮŵŝZƚĂƌŐĞƚƐ;KŶůŝŶĞdĂďůĞsͿ͘ƐǁĞŚĂǀĞƉƌĞǀŝŽƵƐůLJƐŚŽǁŶ͕ŵŝZͲϰϴϳďŚĂƐ
ŽŶůLJϭϰĐŽŶƐĞƌǀĞĚƉƵƚĂƟǀĞƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ͘tĞĐŽŶĮƌŵĞĚƚŚĂƚŵŝZͲϰϴϳďĚŝƌĞĐƚůLJƚĂƌŐĞƚƐƚŚĞǀĂƐŽĂĐƟǀĞ
/ŶƐƵůŝŶZĞĐĞƉƚŽƌ^ƵďƐƚƌĂƚĞϭ;/Z^ϭͿŝŶƚŚĞĂƌƚĞƌŝĂůǁĂůů͕ůĞĂĚŝŶŐƚŽŝŶĐƌĞĂƐĞĚƐƵƌǀŝǀĂůŽĨďŽƚŚƐŵŽŽƚŚ
ŵƵƐĐůĞĐĞůůƐĂŶĚŵLJŽĮďƌŽďůĂƐƚƐ
Ϯϲ͘&ŽƌŵŝZͲϯϮϵ͕ǁĞƐĞůĞĐƚĞĚdůƌϰ
27͕DĞĨϮĂ
ϮϬͲϮϮ͕/ƚŐďϯ
Ϯϴ͕ĨŶďϮ
ϮϵͲϯϬ͕sĞŐĨĂ
ĂŶĚ&ŐĨƌϮ
ϯϭ͖ĨŽƌŵŝZͲϰϵϰ͕ǁĞƐĞůĞĐƚĞĚƌĨϲ
ϯϮ͕důƌϰ͕sĞŐĨĂ͕ĨŶďϮĂŶĚ&ŐĨƌϮ͖ĨŽƌŵŝZͲϰϵϱ͕ǁĞƐĞůĞĐƚĞĚ
dŐĩϮ͕/ƚŐĂǀ
Ϯϴ͕^ƚĂƚϯ
ϯϯĂŶĚdŐĩƌ
ϯϰ.
72
tĞƵƐĞĚƌƚͬƋWZƚŽĚĞƚĞƌŵŝŶĞǁŚĞƚŚĞƌƚŚĞƐĞŐĞŶĞƐǁĞƌĞƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚŝŶƚŚĞůĞŌĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐ
ŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚƚŚĞƌĞůĞǀĂŶƚ'^KƐ͘/ŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵ͕ǁĞ
ŽďƐĞƌǀĞĚ ƵƉͲƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ƐĞǀĞƌĂů ƚĂƌŐĞƚ ŐĞŶĞƐ ĨŽƌ ŵŝZͲϯϮϵ͕ ŝŶĐůƵĚŝŶŐ důƌϰ͕ sĞŐĨĂ ĂŶĚ &ŐĨƌϮ Ăƚ ϯ͕
ĂŶĚDĞĨϮĂĂŶĚ&ŐĨƌϮĂƚϳĚĂLJƐĂŌĞƌ,>/;&ŝŐƵƌĞϳͲͿ͘/ŶŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϰϵϰ͕ǁĞŽďƐĞƌǀĞĚ
ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐdůƌϰĂŶĚsĞŐĨĂĂƚĚĂLJϯĂŶĚŽĨdůƌϰ;ƉсϬ͘ϬϳͿ͕ƌĨϲ͕ĨŶďϮ;ƉсϬ͘ϬϳͿĂŶĚ
&ŐĨƌϮ Ăƚ ĚĂLJ ϳ ĂŌĞƌ ,>/ ;&ŝŐƵƌĞ ϳͲͿ͘ Ɛ ŵŝZͲϯϮϵ ǁĂƐ Ă ůĂƚĞͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌ͕ ƚŚĞ ƐƚƌŽŶŐĞƐƚ ďĞŶĞĮƚƐ ŽĨ
ŵŝZͲϯϮϵŝŶŚŝďŝƟŽŶǁĞƌĞĞdžƉĞĐƚĞĚƚŽďĞŽďƐĞƌǀĞĚĞĂƌůLJĂŌĞƌ,>/͕ŝŶĐŽŶƚƌĂƐƚƚŽŵŝZͲϰϵϰǁŚŝĐŚĂƐĂŶ
ĞĂƌůLJͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌǁĂƐƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚƌĂƉŝĚůLJĂŌĞƌ,>/ĂŶĚƚŚĞƌĞĨŽƌĞďĞŶĞĮƚƐŽĨŝŶŚŝďŝƟŽŶǁĞƌĞĞdžƉĞĐƚĞĚ
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3-I
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