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The handle http://hdl.handle.net/1887/47467 holds various files of this Leiden University dissertation

Author: Welten, S.M.J.

Title: The role of 14q32 microRNAs in vascular remodelling

Issue Date: 2017-03-09

WŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϯϮϵĚƵƌŝŶŐǀĂƐĐƵůĂƌ

ƌĞŐĞŶĞƌĂƟŽŶĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ

DĂŶƵƐĐƌŝƉƚŝŶƉƌĞƉĂƌĂƟŽŶ

SMJ Welten^1,2

ŽǁŶŝĞZƵŝnjsĞůĂƐĐŽ^ϯ W,YƵĂdž^1,2 'DŝĐŚůĞǁƐŬŝ^ϯ

zEŽƐƐĞŶƚ^1,2

1ĞƉĂƌƚŵĞŶƚŽĨ^ƵƌŐĞƌLJ͕>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJDĞĚŝĐĂůĞŶƚĞƌ͕>ĞŝĚĞŶ͕ƚŚĞEĞƚŚĞƌůĂŶĚƐ

2ŝŶƚŚŽǀĞŶ>ĂďŽƌĂƚŽƌLJĨŽƌdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂůsĂƐĐƵůĂƌDĞĚŝĐŝŶĞ͕

>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJDĞĚŝĐĂůĞŶƚĞƌ͕>ĞŝĚĞŶ͕ƚŚĞEĞƚŚĞƌůĂŶĚƐ

ϯdŚĞtĞůůĐŽŵĞdƌƵƐƚĞŶƚƌĞĨŽƌĞůůŝŽůŽŐLJ͕

Chapter 7

ϭϴϮ

Abstract

dŚĞ ŚƵŵĂŶ ŝŵƉƌŝŶƚĞĚ ϭϰƋϯϮ ůŽĐƵƐ ŚŽůĚƐ ƚŚĞ ůĂƌŐĞƐƚ ŬŶŽǁŶ ŵŝĐƌŽZE ŐĞŶĞ ĐůƵƐƚĞƌ͕ ĞŶĐŽĚŝŶŐ ϱϰ

ŝŶĚŝǀŝĚƵĂů ŵŝĐƌŽZEƐ͘tĞŚĂǀĞƉƌĞǀŝŽƵƐůLJƐŚŽǁŶƚŚĂƚƚŚĞ ϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEĐůƵƐƚĞƌƉůĂLJƐĂƌŽůĞŝŶ

ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘ŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶŵŝĐĞ͕ϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐĂƌĞƌĞŐƵůĂƚĞĚŝŶƚŚƌĞĞĚŝƐƟŶĐƚ

ƚĞŵƉŽƌĂůƉĂƩĞƌŶƐ͘dŚĞƐĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶƉĂƩĞƌŶƐ͕ĂƐǁĞůůĂƐďĂƐĂůĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐ͕ǁĞƌĞŝŶĚĞƉĞŶĚĞŶƚ

ŽĨ ƚŚĞ ŵŝĐƌŽZE ŐĞŶĞƐ͛ ŽƌĚĞƌ ŝŶ ƚŚĞ ϭϰƋϯϮ ůŽĐƵƐ͘ dŚĞƐĞ ĮŶĚŝŶŐƐ ŝŶĚŝĐĂƚĞ ƚŚĂƚ ƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů

ƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐŝƐĂŵĂũŽƌĚĞƚĞƌŵŝŶĂŶƚŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ͘

hƐŝŶŐƌƚͬƋWZƉƌŝŵĞƌƐƐƉĞĐŝĮĐĨŽƌĞĂĐŚƐƚĂŐĞŽĨŵŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐ͕ŝ͘Ğ͘ƉƌŝͲŵŝĐƌŽZE͕ƉƌĞͲŵŝĐƌŽZE

ĂŶĚ ŵĂƚƵƌĞ ŵŝĐƌŽZE͕ ǁĞ ĨŽƵŶĚ ƚŚĂƚ ŝŶĐƌĞĂƐĞĚ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ĂŌĞƌ ŚŝŶĚůŝŵď

ŝƐĐŚĞŵŝĂŝƐĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚďLJŝŶĐƌĞĂƐĞĚƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐĨƌŽŵƉƌĞͲƚŽŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZE͕ƌĂƚŚĞƌƚŚĂŶŝŶĐƌĞĂƐĞĚ

ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶ͘tĞƵƐĞĚ^ƚĂďůĞ/ƐŽƚŽƉĞ>ĂďĞůůŝŶŐŽĨŵŝŶŽĐŝĚƐ;^/>Ϳ͕ĨŽůůŽǁĞĚďLJƉƌĞͲŵŝĐƌŽZE

ƉƵůůͲĚŽǁŶ ĂŶĚ DĂƐƐ ^ƉĞĐƚƌŽŵĞƚƌLJ ƚŽ ŝĚĞŶƟĨLJ ƉƌŽƚĞŝŶƐ ƚŚĂƚ ĂƌĞ ƌĞƐƉŽŶƐŝďůĞ ĨŽƌ ƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů

ƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐ͘

tĞŽďƐĞƌǀĞĚĚŝīĞƌĞŶƟĂůďŝŶĚŝŶŐŽĨƉƌŽƚĞŝŶƐ/ZWĂŶĚ,,ƚŽƚŚĞƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐŽĨůĂƚĞͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌ

ŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŶŽŶͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌŵŝZͲϰϵϱͲϯƉ͘/ŵŵƵŶŽŚŝƐƚŽĐŚĞŵŝĐĂůƐƚĂŝŶŝŶŐĐŽŶĮƌŵĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨ

ďŽƚŚ/ZWĂŶĚ,,ŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŽĨŵŝĐĞĂŶĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨďŽƚŚ/ZWĂŶĚ,,

ǁĂƐ ƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚ ĂŌĞƌ ŚŝŶĚ ůŝŵď ŝƐĐŚĞŵŝĂ͘ hƐŝŶŐ ZE ŝŶĚŝŶŐ WƌŽƚĞŝŶ ŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶ ;Z/WͿ

ĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐ͕ǁĞƐŚŽǁĞĚƐƉĞĐŝĮĐďŝŶĚŝŶŐŽĨ/ZWƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵ͕ďƵƚŶŽƚƚŽƉƌŝͲŵŝZͲϯϮϵ͘&ŝŶĂůůLJ͕

ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨ/ZW͕ƵƐŝŶŐZEŝ͕ƌĞĚƵĐĞĚŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉůĞǀĞůƐŝŶϯdϯĐĞůůƐ͘

dŚĞƐĞĚĂƚĂĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞĂŶŽǀĞůƌŽůĞĨŽƌ/ZWĂŶĚ,,ŝŶƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEƐƵŶĚĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ͘

7

/ŶƚƌŽĚƵĐƟŽŶ

DŝĐƌŽZEƐ ĂƌĞ ƐŚŽƌƚ ĞŶĚŽŐĞŶŽƵƐ ZE ŵŽůĞĐƵůĞƐ ;ΕϮϮ ŶƵĐůĞŽƟĚĞƐͿ ƚŚĂƚ ĚĞĐƌĞĂƐĞ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ

ƚŚĞŝƌƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐǀŝĂƚƌĂŶƐůĂƟŽŶĂůƌĞƉƌĞƐƐŝŽŶ¹͘DŝĐƌŽZEŐĞŶĞƐĂƌĞƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚďLJZEƉŽůLJŵĞƌĂƐĞ

// ĂƐ ƉƌŝŵĂƌLJ ŵŝĐƌŽZE ;ƉƌŝͲŵŝZͿ ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐ͘ ^ƵďƐĞƋƵĞŶƚůLJ͕ ƚŚĞƐĞ ƉƌŝͲŵŝZƐ ĂƌĞ ƉƌŽĐĞƐƐĞĚ ďLJ ƚŚĞ

ŵŝĐƌŽƉƌŽĐĞƐƐŽƌĐŽŵƉůĞdž͕ĐŽŶƐŝƐƟŶŐŽĨƚŚĞZEĂƐĞ///ƌŽƐŚĂĂŶĚĐŽͲĨĂĐƚŽƌ'Zϴ͕ƚŽĨŽƌŵƉƌĞĐƵƌƐŽƌ

ŵŝĐƌŽZEƐ;ƉƌĞͲŵŝZƐͿŽĨĂďŽƵƚϳϬŶƵĐůĞŽƟĚĞƐůŽŶŐ͘WƌĞͲŵŝZƐĂƌĞĞdžƉŽƌƚĞĚƚŽƚŚĞĐLJƚŽƉůĂƐŵǁŚĞƌĞ

ƚŚĞĞŶnjLJŵĞŝĐĞƌĐůĞĂǀĞƐƚŚĞƉƌĞͲŵŝZŝŶƚŽĂŵŝĐƌŽZEĚƵƉůĞdž͘'ĞŶĞƌĂůůLJ͕ŽŶĞƐƚƌĂŶĚŽĨƚŚĞŵŝĐƌŽZE

ĚƵƉůĞdž;ŐƵŝĚĞƐƚƌĂŶĚͿŝƐƉƌĞĨĞƌƌĞĚĨŽƌĂƐƐŽĐŝĂƟŽŶǁŝƚŚĂŶƌŐŽŶĂƵƚĞ;'KͿƉƌŽƚĞŝŶĂŶĚůŽĂĚŝŶŐŝŶƚŽƚŚĞ

ZEŝŶĚƵĐĞĚƐŝůĞŶĐŝŶŐĐŽŵƉůĞdž;Z/^Ϳ͘,ŽǁĞǀĞƌ͕ĂĐĐƵŵƵůĂƟŶŐĞǀŝĚĞŶĐĞƐƵŐŐĞƐƚƐƚŚĂƚƚŚĞŽƚŚĞƌƐƚƌĂŶĚ

;ƉĂƐƐĞŶŐĞƌƐƚƌĂŶĚͿĐĂŶĂůƐŽďĞůŽĂĚĞĚŝŶƚŽƚŚĞZ/^^Ϯ͕ϯ͘DŝĐƌŽZEƐŐƵŝĚĞƚŚĞZ/^ƚŽƐƉĞĐŝĮĐŵZE

ƚĂƌŐĞƚƐ͕ŝŶŽƌĚĞƌƚŽĐŽŶƚƌŽůŵZEƚƌĂŶƐůĂƟŽŶ¹͘ƐŝŶŐůĞŵŝĐƌŽZEŝƐĂďůĞƚŽƚĂƌŐĞƚŶƵŵĞƌŽƵƐŐĞŶĞƐ

ĂŶĚďLJĚŽŝŶŐƐŽ͕ƚŚĂƚŵŝĐƌŽZEĐĂŶƌĞŐƵůĂƚĞĐŽŵƉůĞdž͕ƉŚLJƐŝŽůŽŐŝĐĂůƉƌŽĐĞƐƐĞƐ͘KǀĞƌƚŚĞƉĂƐƚĚĞĐĂĚĞ͕

ŵŝĐƌŽZEƐŚĂǀĞďĞĞŶƐŚŽǁŶƚŽƉůĂLJĂŶŝŵƉŽƌƚĂŶƚƌŽůĞŝŶŚƵŵĂŶĚŝƐĞĂƐĞ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐĐĂƌĚŝŽǀĂƐĐƵůĂƌ

ĚŝƐĞĂƐĞ͘ ůƚŚŽƵŐŚ ŵŝĐƌŽZEƐ ƌĞŐƵůĂƚĞ ƉŚLJƐŝŽůŽŐŝĐĂů ĂŶĚ ƉĂƚŚŽůŽŐŝĐĂů ƉƌŽĐĞƐƐĞƐ ǀŝĂ ŵŽĚƵůĂƟŽŶ ŽĨ

ƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ͕ŵŝĐƌŽZEĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŝƚƐĞůĨŝƐƐƵďũĞĐƚƚŽƌĞŐƵůĂƟŽŶƚŽŽ͘

DŝĐƌŽZE ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ĐĂŶ ďĞ ƌĞŐƵůĂƚĞĚ Ăƚ ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů ĂƐ ǁĞůů ĂƐ ƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů ůĞǀĞů͘

WƌŽĐĞƐƐŝŶŐŽĨŵŝĐƌŽZEƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐĐĂŶďĞĐŽŶƚƌŽůůĞĚĂƚƚŚĞĐŽŶǀĞƌƐŝŽŶŽĨƉƌŝͲŵŝZƚŽƉƌĞͲŵŝZƚŚƌŽƵŐŚ

ŵŽĚƵůĂƟŽŶŽĨƌŽƐŚĂͬ'ZϴĂĐƟǀŝƚLJĂŶĚĂƚƚŚĞĐŽŶǀĞƌƐŝŽŶŽĨƉƌĞͲŵŝZƚŽŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEƚŚƌŽƵŐŚ

ŵŽĚƵůĂƟŽŶ ŽĨ ŝĐĞƌ ĂĐƟǀŝƚLJ͘ ZE ďŝŶĚŝŶŐ ƉƌŽƚĞŝŶƐ ;ZWƐͿ ŚĂǀĞ ďĞĞŶ ĨŽƵŶĚ ƚŽ ďŝŶĚ ƐĞƋƵĞŶĐĞƐ ŝŶ

ƚŚĞƚĞƌŵŝŶĂůůŽŽƉĂŶĚƐƚĞŵŽĨƉƌŝͲŵŝZƐ͕ƚŚĞƌĞďLJĞŶŚĂŶĐŝŶŐŽƌŝŶŚŝďŝƟŶŐƉƌŝͲƚŽƉƌĞͲŵŝZĐůĞĂǀĂŐĞ^ϰͲϳ.

&ŽƌĞdžĂŵƉůĞ͕ƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐ ŽĨ ƉƌŝͲŵŝZƐ ǁŝƚŚ ĐŽŶƐĞƌǀĞĚƚĞƌŵŝŶĂů ůŽŽƉ ƌĞŐŝŽŶƐ͕ ƐƵĐŚ ĂƐƉƌŝͲŵŝZͲϭϴĂ Žƌ

ƉƌŝͲůĞƚͲϳĂŚĂǀĞďĞĞŶƐŚŽǁŶƚŽďĞĂīĞĐƚĞĚďLJŚŶZEWϭƉƌŽƚĞŝŶ^ϳͲϵ͘&ƵƌƚŚĞƌŵŽƌĞ͕ĂƐƵďƐĞƚŽĨŵƵƌŝŶĞ

ŵŝĐƌŽZEƐǁĂƐĂīĞĐƚĞĚďLJĚĞƉůĞƟŽŶŽĨƉϲϴĂŶĚƉϳϮŚĞůŝĐĂƐĞƐ͕ƌĞƐƵůƟŶŐŝŶƌĞĚƵĐĞĚůĞǀĞůƐŽĨƉƌĞͲŵŝZƐ͕

ďƵƚŶŽƚƉƌŝͲŵŝZƐ¹⁰͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕ƉϱϯĂŶĚ^DƐŚĂǀĞďĞĞŶƌĞƉŽƌƚĞĚƚŽ;ŝŶͿĚŝƌĞĐƚůLJŝŶƚĞƌĂĐƚǁŝƚŚƌŽƐŚĂ

ĂŶĚ ŵŽĚƵůĂƚĞ ƉƌŝͲ ƚŽ ƉƌĞͲŵŝZ ĐůĞĂǀĂŐĞ^{ϲ͕ ϭϭ}͘ dŚĞ ZE ďŝŶĚŝŶŐ ƉƌŽƚĞŝŶ >/EͲϮϴ ǁĂƐ ƌĞƉŽƌƚĞĚ ƚŽ ďůŽĐŬ

ĂĐĐƵŵƵůĂƟŽŶŽĨůĞƚͲϳůĞǀĞůƐďLJƌĞƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨďŽƚŚƌŽƐŚĂĂŶĚŝĐĞƌ¹²͘ŶŽƚŚĞƌZW͕h&ϭ͕ǁĂƐƐŚŽǁŶ

ƚŽŝŶƚĞƌĂĐƚǁŝƚŚŝĐĞƌĂŶĚůŽǁĞƌĞĚŝĐĞƌŵZEƐƚĂďŝůŝƚLJ͕ůĞĂĚŝŶŐƚŽĂĚĞĐƌĞĂƐĞŝŶŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZE

ůĞǀĞůƐ͕ďƵƚŶŽƚƉƌĞͲŵŝZůĞǀĞůƐ^ϭϯ͘ZĞĐĞŶƚůLJ͕ZďĨŽdžƉƌŽƚĞŝŶƐǁĞƌĞĨŽƵŶĚƚŽďŝŶĚƉƌĞͲŵŝZƐŽĨŵŝZͲϮϬďĂŶĚ

ŵŝZͲϭϬϳƚŚƌŽƵŐŚƐƉĞĐŝĮĐZďĨŽdžZEƌĞĐŽŐŶŝƟŽŶŵŽƟĨƐŝŶƚŚĞŝƌƚĞƌŵŝŶĂůůŽŽƉƐĂŶĚZďĨŽdžϮǁĂƐƐŚŽǁŶ

ƚŽĚĞĐƌĞĂƐĞŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϮϬďĂŶĚŵŝZͲϭϬϳůĞǀĞůƐ^ϭϰ.

DĂŶLJŵŝĐƌŽZEƐĂƌĞĞŶĐŽĚĞĚǁŝƚŚŝŶĐůƵƐƚĞƌƐĂŶĚĐĂŶďĞƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚĂƐůŽŶŐƉŽůLJĐŝƐƚƌŽŶŝĐƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐ͘

tŝƚŚϱϰŵŝĐƌŽZEƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐ͕ƚŚĞϭϰƋϯϮĐůƵƐƚĞƌŝƐƚŚĞůĂƌŐĞƐƚŬŶŽǁŶƉŽůLJĐŝƐƚƌŽŶŝĐŵŝĐƌŽZEŐĞŶĞ

ĐůƵƐƚĞƌŝŶŚƵŵĂŶƐ͘/ŶŵŝĐĞ͕ƚŚŝƐĐůƵƐƚĞƌŝƐůŽĐĂƚĞĚŽŶĐŚƌŽŵŽƐŽŵĞϭϮ&ϭĂŶĚĐŽŶƚĂŝŶƐϲϭŵŝĐƌŽZEƐ͘

tĞŚĂǀĞƉƌĞǀŝŽƵƐůLJĚĞƐĐƌŝďĞĚƚŚĞĚŝīĞƌĞŶƟĂůƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŝŶĂŵŽƵƐĞŵŽĚĞůĨŽƌ

ŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶƚŚĞŚŝŶĚůŝŵď^ϭϱ͘DŝĐƌŽZEƐĨƌŽŵƚŚĞϭϰƋϯϮĐůƵƐƚĞƌĨŽůůŽǁĞĚƚŚƌĞĞĚŝīĞƌĞŶƚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

ƉĂƩĞƌŶƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͘dŚĞƐĞƉĂƩĞƌŶƐĂƌĞŝŶĚĞƉĞŶĚĞŶƚŽĨƚŚĞĐŚƌŽŵŽƐŽŵĂůůŽĐĂƟŽŶŽĨ

ƚŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŐĞŶĞƐ͘&ƵƌƚŚĞƌŵŽƌĞ͕ĞǀĞŶďĂƐĞůŝŶĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨƚŚĞƐĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

ǀĂƌLJ ŐƌĞĂƚůLJ͘ dŚĞƐĞ ĮŶĚŝŶŐƐ ŝŶĚŝĐĂƚĞ ƚŚĂƚ ŝŶĚŝǀŝĚƵĂů ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZE ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŝƐ ƌĞŐƵůĂƚĞĚ

ƉƌĞĚŽŵŝŶĂŶƚůLJĂƚƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůůĞǀĞů͘

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/ŶƚŚŝƐƐƚƵĚLJ͕ǁĞƐŚŽǁƚŚĂƚϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐĂƌĞŝŶĚĞĞĚƌĞŐƵůĂƚĞĚĂƚƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůůĞǀĞů͘tĞ

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ĚŝīĞƌĞŶƟĂůĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐƵŶĚĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂĂŶĚĞdžƉĂŶĚƐŽƵƌŬŶŽǁůĞĚŐĞŽĨƌĞŐƵůĂƟŽŶ

ŽĨŵŝĐƌŽZEďŝŽŐĞŶĞƐŝƐƵŶĚĞƌƉĂƚŚŽůŽŐŝĐĂůĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͘

7

Methods

Hind limb ischemia model

ůů ĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐ ǁĞƌĞ ĂƉƉƌŽǀĞĚ ďLJ ƚŚĞ ĐŽŵŵŝƩĞĞ ŽŶ ĂŶŝŵĂů ǁĞůĨĂƌĞ ŽĨ ƚŚĞ >ĞŝĚĞŶ hŶŝǀĞƌƐŝƚLJ DĞĚŝĐĂů ĞŶƚĞƌ ;>ĞŝĚĞŶ͕ ƚŚĞ

EĞƚŚĞƌůĂŶĚƐ͘ƉƉƌŽǀĂůƌĞĨĞƌĞŶĐĞŶƵŵďĞƌƐϬϵϭϲϯĂŶĚϭϬϮϰϯͿ͘dŚŝƐƐƚƵĚLJǁĂƐĐŽŶĚƵĐƚĞĚŝŶĂĐĐŽƌĚĂŶĐĞǁŝƚŚƚŚĞƵƚĐŚŐŽǀĞƌŶŵĞŶƚ

ŐƵŝĚĞůŝŶĞƐĂŶĚƚŚĞŝƌĞĐƟǀĞϮϬϭϬͬϲϯͬhŽĨƚŚĞƵƌŽƉĞĂŶWĂƌůŝĂŵĞŶƚ͘hŶŝůĂƚĞƌĂůŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂǁĂƐŝŶĚƵĐĞĚŝŶŚĞĂůƚŚLJĂĚƵůƚ

ŵĂůĞϱϳ>ϲŵŝĐĞďLJƐŝŶŐůĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞůĞŌĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͕ĂƐƉƌĞǀŝŽƵƐůLJĚĞƐĐƌŝďĞĚ^ϭϱ͘ƌŝĞŇLJ͕ĞůĞĐƚƌŽĐŽĂŐƵůĂƟŽŶŽĨƚŚĞĨĞŵŽƌĂů

ĂƌƚĞƌLJǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚƉƌŽdžŝŵĂůƚŽƚŚĞƐƵƉĞƌĮĐŝĂůĞƉŝŐĂƐƚƌŝĐĂƌƚĞƌLJ;ƐŝŶŐůĞůŝŐĂƟŽŶŵŽĚĞůͿŽƌĐŽŵďŝŶĞĚǁŝƚŚĞůĞĐƚƌŽĐŽĂŐƵůĂƟŽŶŽĨ

ƚŚĞĚŝƐƚĂůĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͕ƉƌŽdžŝŵĂůƚŽƚŚĞďŝĨƵƌĐĂƟŽŶŽĨƚŚĞƉŽƉůŝƚĞĂůĂŶĚƐĂƉŚĞŶŽƵƐĂƌƚĞƌLJ;ĚŽƵďůĞůŝŐĂƟŽŶŵŽĚĞůͿ^ϭϲ͘ϱϳůͬϲŵŝĐĞ

;ŶсϰƉĞƌƟŵĞƉŽŝŶƚͿǁĞƌĞƐĂĐƌŝĮĐĞĚĂƚƐĞǀĞƌĂůƟŵĞƉŽŝŶƚƐ;ĚĂLJϬ;ďĞĨŽƌĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJͿ͕ĚĂLJϭ͕ϯ͕ϳ͕ϭϬ͕ϭϰĂŶĚϮϴͿ

ĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ͘hƉŽŶƐĂĐƌŝĮĐĞ͕ƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌĂŶĚŐĂƐƚƌŽĐŶĞŵŝƵƐŵƵƐĐůĞƐǁĞƌĞŚĂƌǀĞƐƚĞĚĂŶĚĞŝƚŚĞƌƐŶĂƉͲĨƌŽnjĞŶ

ŽŶĚƌLJŝĐĞŽƌĮdžĞĚŝŶϰйƉĂƌĂĨŽƌŵĂůĚĞŚLJĚĞ͘

DŝĐƌŽĂƌƌĂLJ

&Žƌ ŵŝĐƌŽĂƌƌĂLJ ĂŶĂůLJƐŝƐ͕ ƚŽƚĂů ZE ǁĂƐ ŝƐŽůĂƚĞĚ ĨƌŽŵ ĂĚĚƵĐƚŽƌ ŵƵƐĐůĞƐ ƵƐŝŶŐ ƚŚĞ ZEĞĂƐLJ ĮďƌŽƵƐ ƟƐƐƵĞ ŵŝŶŝŬŝƚ ;YŝĂŐĞŶͿ͘ ZE

ĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶ͕ ƉƵƌŝƚLJ ĂŶĚ ŝŶƚĞŐƌŝƚLJ ǁĞƌĞ ĂŶĂůLJƐĞĚ ďLJ ŶĂŶŽĚƌŽƉ ;EĂŶŽĚƌŽƉΠ dĞĐŚŶŽůŽŐŝĞƐͿ ĂŶĚ ŝŽĂŶĂůLJnjĞƌ ;ŐŝůĞŶƚ ϮϬϬϬͿ

ŵĞĂƐƵƌĞŵĞŶƚƐ͘ŶŝŵĂůƐ

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DŝĐƌŽZEĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶƉƌŽĮůŝŶŐǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚĂƐƉƌĞǀŝŽƵƐůLJĚĞƐĐƌŝďĞĚ͕ƵƐŝŶŐ>EďĂƐĞĚĂƌƌĂLJƐ;ŵŝZhZz>EΡŵŝZƌƌĂLJƌĞĂĚLJͲ ƚŽͲƐƉŽƚƉƌŽďĞƐĞƚ͕džŝƋŽŶͿ^ϭϱ͘EŽƌŵĂůŝnjĂƟŽŶĂŶĚďĂĐŬŐƌŽƵŶĚĐŽƌƌĞĐƟŽŶǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚŝŶƚŚĞ͞ƐƚĂƟƐƟĐĂůůĂŶŐƵĂŐĞZ͟ƵƐŝŶŐ͞ǀƐŶ͟

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ŵŽĚĞůĂŶĚĐŽŶƚƌĂƐƟŶŐŝŶĚŝǀŝĚƵĂůƚƌĞĂƚŵĞŶƚƐǁŝƚŚƵŶƚƌĞĂƚĞĚĐŽŶƚƌŽůƐ͘>ŽŐϮĨŽůĚĐŚĂŶŐĞƐǁĞƌĞĐĂůĐƵůĂƚĞĚƵƐŝŶŐƚŚĞƚŽƉƚĂďůĞĨƵŶĐƟŽŶ

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ƵƐĞĚ͘tŚŽůĞŐĞŶŽŵĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶƉƌŽĮůŝŶŐǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚƵƐŝŶŐDŽƵƐĞt'ͲϲǀϮ͘ϬdžƉƌĞƐƐŝŽŶĞĂĚĐŚŝƉƐ;/ůůƵŵŝŶĂͿĂŶĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

ůĞǀĞůƐǁĞƌĞ>ŽŐϮͲƚƌĂŶƐĨŽƌŵĞĚ͕ĂƐƉƌĞǀŝŽƵƐůLJĚĞƐĐƌŝďĞĚ^ϭϱ.

Cell culture

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ZEŝŶĚŝŶŐWƌŽƚĞŝŶ/ŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶ

ZEŝŶĚŝŶŐWƌŽƚĞŝŶŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶ;Z/WͿǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚƵƐŝŶŐƚŚĞDĂŐŶĂZ/WŬŝƚ;DŝůůŝƉŽƌĞͿ͕ĂĐĐŽƌĚŝŶŐƚŽŵĂŶƵĨĂĐƚƵƌĞƌ͛Ɛ

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RNA interference

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CIRBP1: GAGACAGCUAUGACAGUUAUU ĂŶĚCIRBP2: GUGGUAAAGGACAGGGAGA.

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ŝŶĚŝĐĂƚĞĚ͘ĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶŽĨZEŝŶKƉƟͲDDŵĞĚŝƵŵŽĨϰϬϬŶDǁĂƐĞŶƐƵƌĞĚ͕ĨŽůůŽǁŝŶŐŵĂŶƵĨĂĐƚƵƌĞƌ͛ƐŝŶƐƚƌƵĐƟŽŶƐ͘

RT/qPCR

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Immunohistochemical staining

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7

Results

/ŶǀŝǀŽŵŝĐƌŽZEƌĞŐƵůĂƟŽŶ

DŝĐƌŽZEŵŝĐƌŽĂƌƌĂLJǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚŝŶŽƌĚĞƌƚŽĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚŝīĞƌĞŶƟĂůĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝĐƌŽZEƐĂŌĞƌ

ŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶǀŝǀŽ͘DŝĐƌŽZEƐĨƌŽŵƚŚĞϭϰƋϯϮĐůƵƐƚĞƌƐŚŽǁĞĚƚŚƌĞĞĚŝīĞƌĞŶƚƚĞŵƉŽƌĂů

ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶƉĂƩĞƌŶƐĂŌĞƌƐŝŶŐůĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͘KŶĞƚŚŝƌĚŽĨƚŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐǁĞƌĞ

ƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚǁŝƚŚŝŶϮϰŚŽƵƌƐĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ;ĞĂƌůLJƌĞƐƉŽŶĚĞƌƐ͕&ŝŐƵƌĞϭ͕ĂǀĞƌĂŐĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

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ĐŚƌŽŵŽƐŽŵĂůůŽĐĂƟŽŶ;&ŝŐƵƌĞϭ'Ϳ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕ďĂƐĞůŝŶĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐǁĞƌĞ

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ŝƐĐŚĞŵŝĂďƵƚĐŽŶƟŶƵĞĚƚŽĚĞĐƌĞĂƐĞƵŶƟůϳϮŚŽƵƌƐĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ͘džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵĂƚƵƌĞŵŝZͲ ϯϮϵͲϯƉŵŝƌƌŽƌĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵ;&ŝŐƵƌĞϮͿ͘&ŽƌĞĂƌůLJƌĞƐƉŽŶĚĞƌŵŝZͲϰϵϰ͕ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨ

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ǁĞƌĞĞdžŚĂƵƐƚĞĚ͕ǁĞŽďƐĞƌǀĞĚŝŶĐƌĞĂƐĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵĂƚƵƌĞŵŝZůĞǀĞůƐ͕ǁŚŝĐŚǁĂƐĞƐƉĞĐŝĂůůLJƚƌƵĞĨŽƌ

ĞĂƌůLJƌĞƐƉŽŶĚĞƌŵŝZͲϰϵϰĂŶĚůĂƚĞƌĞƐƉŽŶĚĞƌŵŝZͲϯϮϵͲϯƉ͘dŚĞƐĞĚĂƚĂƐƵŐŐĞƐƚƚŚĂƚƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐƚĂŬĞƐƉůĂĐĞƐĂƚƚŚĞĐŽŶǀĞƌƐŝŽŶĨƌŽŵƉƌĞͲŵŝZƚŽŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZE͘

ϭϴϴ

Figure 1. ŝīĞƌĞŶƟĂůĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶƉĂƩĞƌŶƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͘DŝĐƌŽZEĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶǁĂƐĞǀĂůƵĂƚĞĚ

ďĞĨŽƌĞŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ;dϬͿ͕ĚĂLJϭ;dϭͿ͕ĚĂLJϯ;dϯͿĂŶĚĚĂLJϳ;dϳͿĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͘ĂƌůLJƌĞƐƉŽŶĚĞƌϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

ǁĞƌĞƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚǁŝƚŚŝŶϮϰŚŽƵƌƐĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ;Ϳ͘ǀĞƌĂŐĞŝŶƚĞŶƐŝƚLJŽĨĂůůĞĂƌůLJƌĞƐƉŽŶĚĞƌƐ;Ϳ͘>ĂƚĞƌĞƐƉŽŶĚĞƌϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

ǁĞƌĞŶŽƚƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚƵŶƟůϳϮŚŽƵƌƐĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ;Ϳ͘ǀĞƌĂŐĞŝŶƚĞŶƐŝƚLJŽĨĂůůůĂƚĞƌĞƐƉŽŶĚĞƌƐ;Ϳ͘EŽŶͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEƐǁĞƌĞŶŽƚƌĞŐƵůĂƚĞĚĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ;Ϳ͘ǀĞƌĂŐĞŝŶƚĞŶƐŝƚLJŽĨĂůůŶŽŶͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌƐ;&Ϳ͘ŚƌŽŵŽƐŽŵĂůůŽĐĂƟŽŶŽĨĞĂƌůLJ;ƌĞĚͿ͕

ůĂƚĞ;ŐƌĞĞŶͿĂŶĚŶŽŶͲƌĞƐƉŽŶĚĞƌƐ;ďůƵĞͿŽŶƚŚĞŵƵƌŝŶĞϭϮ&ϭůŽĐƵƐ;'Ϳ͘

7

&ŝŐƵƌĞϮ͘WƌŝͲŵŝZ͕ƉƌĞͲŵŝZĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝZĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ͘WĞƌĐĞŶƚĂŐĞŽĨĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ;ƌĞůĂƟǀĞƚŽĚĂLJϬͿ

ŽĨƉƌŝͲŵŝZͲϯϮϵ͕ƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂƚĚĂLJϬ;ŶŽŝƐĐŚĞŵŝĂͿ͕ĚĂLJϭ͕ĚĂLJϯĂŶĚĚĂLJϳĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ;Ϳ͘

WĞƌĐĞŶƚĂŐĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨĚĂLJϬŽĨƉƌŝͲ͕ƉƌĞͲĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϰϵϰͲϯƉĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ;Ϳ͘WĞƌĐĞŶƚĂŐĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨĚĂLJϬŽĨƉƌŝͲ͕ƉƌĞͲ

ĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϰϵϱĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ;Ϳ͘

WƌĞͲŵŝĐƌŽZEƉƵůůĚŽǁŶĨŽůůŽǁĞĚďLJ^/>DĂƐƐ^ƉĞĐƚƌŽŵĞƚƌLJƌĞǀĞĂůƐƉƵƚĂƟǀĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZE

biogenesis factors

hƐŝŶŐƐĞƌƵŵͲƐƚĂƌǀĂƟŽŶŽĨϯdϯĐĞůůƐ͕ǁĞǁĞƌĞĂďůĞƚŽŵŝŵŝĐƚŚĞin vivoƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

ŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉ͕ďƵƚŶŽƚŵŝZͲϰϵϰͲϯƉ in vitro ;&ŝŐƵƌĞϯͿ͘tĞƚŚĞƌĞĨŽƌĞĨŽĐƵƐƐĞĚŽŶŵŝZͲ ϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉ͘dŽŝĚĞŶƟĨLJƚŚĞZWƐƚŚĂƚĂƌĞƌĞƐƉŽŶƐŝďůĞĨŽƌĚŝīĞƌĞŶƟĂůĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƚŚĞƐĞ

ƚǁŽŵŝĐƌŽZEƐǀŝĂƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůƌĞŐƵůĂƟŽŶ͕ǁĞƉĞƌĨŽƌŵĞĚ^ƚĂďůĞ/ƐŽƚŽƉĞ>ĂďĞůůŝŶŐŽĨŵŝŶŽ

ĐŝĚƐ͕ ĨŽůůŽǁĞĚ ďLJ ZE ƉƵůů ĚŽǁŶ ĂŶĚ DĂƐƐ ^ƉĞĐƚƌŽŵĞƚƌLJ ;&ŝŐƵƌĞ ϰͲͿ͘ tĞ ŝĚĞŶƟĮĞĚ ƐĞǀĞƌĂů

ƉƌŽƚĞŝŶƐ͕ǁŚŝĐŚǁĞƌĞƐƉĞĐŝĮĐĂůůLJďŽƵŶĚƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱ͕ŶĂŵĞůLJZDϮϴĂŶĚd>ϯ

;ƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵ ƐƉĞĐŝĮĐͿ͕ ZDϭϱ ;ƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱ ƐƉĞĐŝĮĐͿ ĂƐ ǁĞůů ĂƐ ƉƌŽƚĞŝŶƐ <Wϰ͕ Wϰ,͕ /ZW ĂŶĚ

,,͕ǁŚŝĐŚǁĞƌĞďŽƵŶĚƚŽďŽƚŚƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱ͕ƐŚŽǁŝŶŐĂŶŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶďŝŶĚŝŶŐ

ĂŌĞƌƐĞƌƵŵƐƚĂƌǀĂƟŽŶ͘hƐŝŶŐtĞƐƚĞƌŶůŽƚĂŶĂůLJƐŝƐ͕ǁĞǀĂůŝĚĂƚĞĚďŝŶĚŝŶŐŽĨ,,ĂŶĚ/ZWƚŽ

ŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐ;&ŝŐƵƌĞϰͲ&Ϳ͘tŚŝůĞďŽƚŚƉƌŽƚĞŝŶƐƐĞĞŵĞĚƚŽďŝŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱŝŶ

ďŽƚŚƐĞƌƵŵƐƚĂƌǀĂƟŽŶĂŶĚŶŽŶͲƐƚĂƌǀĂƟŽŶĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͕ďŝŶĚŝŶŐƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵǁĂƐŐƌĞĂƚůLJŝŶĐƌĞĂƐĞĚ

ĨŽůůŽǁŝŶŐƐĞƌƵŵƐƚĂƌǀĂƟŽŶ͘

Figure 3. Levels of mature miR-329 and miR-495 in serum starved 3T3 cells. dŚĞůĞǀĞůƐŽĨŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉǁĞƌĞ

ĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚďLJƌƚͬƋWZ͘ϯdϯĐĞůůƐǁĞƌĞƐĞƌƵŵͲƐƚĂƌǀĞĚĨŽƌϮϰŚĂŶĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐǁĞƌĞĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽŶŽŶͲƐƚĂƌǀĞĚĐĞůůƐ͘

CIRBP and HADHB expression in vivo

tĞŶĞdžƚĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨZEďŝŶĚŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶƐ/ZWĂŶĚ,,in vivo ŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌ

ŵƵƐĐůĞĂƚĚŝīĞƌĞŶƚƟŵĞƉŽŝŶƚƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͘hƐŝŶŐŝŵŵƵŶŽŚŝƐƚŽĐŚĞŵŝƐƚƌLJ͕ǁĞĐŽŶĮƌŵĞĚ

ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨďŽƚŚ/ZWĂŶĚ,,ŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŽĨŵŝĐĞĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ;&ŝŐƵƌĞϱĂŶĚϱ͕

ϭϵϬ

ƌĞƐƉĞĐƟǀĞůLJͿ͘džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨ/ZWŵZEǁĂƐŝŶĐƌĞĂƐĞĚǁŝƚŚŝŶϮϰŚŽƵƌƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͕

ǁŚĞƌĞĂƐ ,, ŵZE ǁĂƐ ŝŶĐƌĞĂƐĞĚ Ăƚ ϯ ĚĂLJƐ ĂŌĞƌ ŝŶĚƵĐƟŽŶ ŽĨ ŝƐĐŚĞŵŝĂ ;&ŝŐƵƌĞƐ ϱ ĂŶĚ ϱͿ͘

&ŝŶĂůůLJ͕ƵƐŝŶŐǁĞƐƚĞƌŶďůŽƚĂŶĂůLJƐŝƐŽĨ/ZWĂŶĚ,,ŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞĂƚĚŝīĞƌĞŶƚƟŵĞƉŽŝŶƚƐ͕

ǁĞŽďƐĞƌǀĞĚĂŶĂĐƵƚĞďƵƚƚƌĂŶƐŝĞŶƚŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶ/ZWƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞůƐĂƚĚĂLJϭĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ͘

,,ƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞůƐǁĞƌĞĂůƐŽƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚǁŝƚŚŝŶϭĚĂLJ͕ďƵƚƚŚĞLJƌĞŵĂŝŶĞĚĞůĞǀĂƚĞĚƵŶƟůϭϬĚĂLJƐ

ĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ;&ŝŐƵƌĞϱĂŶĚϱ&Ϳ͘

&ŝŐƵƌĞϰ͘/ĚĞŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƉƌŽƚĞŝŶƐďŝŶĚŝŶŐƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱ;Ϳ^ĐŚĞŵĂƟĐƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟŽŶŽĨZEƉƵůůĚŽǁŶĐŽŵďŝŶĞĚ

ǁŝƚŚ^/>ŵĂƐƐƐƉĞĐƚƌŽŵĞƚƌLJ;ͿEƵŵďĞƌŽĨƉƌŽƚĞŝŶƐƐŚŽǁŝŶŐŝŶĐƌĞĂƐĞĚĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞĚďŝŶĚŝŶŐƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵ͕ƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱŽƌ

ďŽƚŚ͘tĞƐƚĞƌŶůŽƚǀĂůŝĚĂƟŽŶŽĨ,,;ͿĂŶĚ/ZW;ͿďŝŶĚŝŶŐƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱƵŶĚĞƌĐŽŶĚŝƟŽŶƐŽĨŶŽƌŵĂů

ƐĞƌƵŵĂŶĚƐĞƌƵŵƐƚĂƌǀĂƟŽŶ͘;Ͳ&ͿtĞƐƚĞƌŶůŽƚƋƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨ,,;ͿĂŶĚ/ZW;&ͿďŝŶĚŝŶŐƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱ

ƵŶĚĞƌĐŽŶĚŝƟŽŶƐŽĨŶŽƌŵĂůƐĞƌƵŵĂŶĚƐĞƌƵŵƐƚĂƌǀĞĐŽŶĚŝƟŽŶƐ;ƌĞůĂƟǀĞƚŽŝŶƉƵƚ;ŶсϯͿͿ͘

7

Figure 5. Expression of CIRBP and HADHB in vivo./ŵŵƵŶŽŚŝƐƚŽĐŚĞŵŝĐĂůƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨƚŚĞŵƵƌŝŶĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ

ŝŶĚƵĐƟŽŶƌĞǀĞĂůĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨďŽƚŚ/ZW;ͿĂŶĚ,,;ͿŝŶƚŚĞƐĞƟƐƐƵĞƐ͕ƉƌĞĚŽŵŝŶĂŶƚůLJŝŶƚŚĞĐLJƚŽƉůĂƐŵŽĨĐĞůůƐ͘DŝĐƌŽĂƌƌĂLJ

ĂŶĂůLJƐŝƐ ŽĨ ŵZE ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ /ZW ;Ϳ ĂŶĚ ,, ;Ϳ ŵZE ŝŶ ƚŚĞ ĂĚĚƵĐƚŽƌ ŵƵƐĐůĞ ŽĨ ŵŝĐĞ Ăƚ ƐĞǀĞƌĂů ƟŵĞ ƉŽŝŶƚƐ ĂŌĞƌ

ŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͘;͕&ͿtĞƐƚĞƌŶůŽƚĂŶĂůLJƐŝƐŽĨ/ZWĂŶĚ,,ƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞůƐŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞĂƚƐĞǀĞƌĂůƟŵĞƉŽŝŶƚƐ

ĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ͘

,,ĂŶĚ/ZWďŝŶĚŝŶŐƚŽŵŝZͲϯϮϵƉƌŝͲŵŝZ͕ƉƌĞͲŵŝZĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝZƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐ

Z/WĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐƵƐŝŶŐĂŶƟďŽĚŝĞƐĂŐĂŝŶƐƚ,,ĂŶĚ/ZWŽƌĂŶĞŐĂƟǀĞĐŽŶƚƌŽů/Ő'ǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚ

ƚŽĚĞƚĞƌŵŝŶĞŝŶƚĞƌĂĐƟŽŶďĞƚǁĞĞŶZWƐ,,ĂŶĚ/ZWĂŶĚϭϰƋϯϮŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐ

ŝŶϯdϯĐĞůůĐƵůƚƵƌĞƐ͘tŚĞƌĞĂƐ,,ďŝŶĚƐďŽƚŚƉƌŝͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵ͕/ZWƐŚŽǁĞĚƐƉĞĐŝĮĐ

ďŝŶĚŝŶŐƚŽƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵ͕ŶŽƚƚŽƉƌŝͲŵŝZͲϯϮϵ;&ŝŐƵƌĞϲͿ͘/ZWĂŶĚ,,ďŽƚŚďŝŶĚƚŚĞŵĂƚƵƌĞŵŝZͲ ϯϮϵͲϯƉ͘džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƉƌŝͲŵŝZͲϰϵϱĂŶĚƉƌĞͲŵŝZͲϰϵϱǁĂƐƚŽŽůŽǁƚŽĞŝƚŚĞƌĐŽŶĮƌŵŽƌĞdžĐůƵĚĞďŝŶĚŝŶŐŽĨ

/ZWŽƌ,,͘Z/WĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐƵƐŝŶŐĂŶƵŶƌĞůĂƚĞĚZWƚŚĂƚŚĂƐďĞĞŶƐŚŽǁŶƚŽƌĞŐƵůĂƚĞƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐ

ŽĨƉŽůLJĐŝƐƚƌŽŶŝĐŵŝĐƌŽZEƐ͕ŶĂŵĞůLJ^Eϭ^ϭϴ͕ƐŚŽǁĞĚŶŽƐƉĞĐŝĮĐďŝŶĚŝŶŐƚŽĞŝƚŚĞƌƉƌŝͲŵŝZƐŽƌƉƌĞͲŵŝZƐ

ŽĨŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϭͿ͘

ϭϵϮ

&ŝŐƵƌĞϲ͘ZEďŝŶĚŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶǁŝƚŚ,,ĂŶĚ/ZWĂŶƟďŽĚŝĞƐ͘WƌŝͲŵŝZͲϯϮϵ͕ƉƌĞͲŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵĂƚƵƌĞ

ŵŝZͲϯϮϵĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐǁĞƌĞŵĞĂƐƵƌĞĚŝŶϯdϯĐĞůůůLJƐĂƚĞƐĂŌĞƌŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶǁŝƚŚ,,;ƚŽƉͿĂŶĚ/ZW;ďŽƩŽŵͿ

ĂŶƟďŽĚŝĞƐĂŶĚŶŽŶͲƐƉĞĐŝĮĐ/Ő'ĂŶƟďŽĚLJ͘

džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉĂŌĞƌ/ZWƐŝůĞŶĐŝŶŐ

EĞdžƚ͕ǁĞ ƵƐĞĚƚǁŽĚŝīĞƌĞŶƚƐŝZEƐ;/ZWͲϭĂŶĚ/ZWͲϮͿƚŽŬŶŽĐŬͲĚŽǁŶƚŚĞůĞǀĞůƐŽĨ/ZWŝŶϯdϯ

ĐĞůůƐ͘^ŝůĞŶĐŝŶŐŽĨ/ZWǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚƵƐŝŶŐĞŝƚŚĞƌĂƐŝŶŐůĞŽƌĚŽƵďůĞƚƌĂŶƐĨĞĐƟŽŶǁŝƚŚ/ZWƚĂƌŐĞƟŶŐ

ƐŝZEƐ͘ŽƚŚƐŝŶŐůĞĂŶĚĚŽƵďůĞƚƌĂŶƐĨĞĐƟŽŶƐƌĞĚƵĐĞĚ/ZWƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞůƐ͕ǁŚŝĐŚǁĂƐĐŽŶĮƌŵĞĚƵƐŝŶŐ

tĞƐƚĞƌŶůŽƚĂŶĂůLJƐŝƐ;&ŝŐƵƌĞϳͿ͘EĞdžƚ͕ǁĞŵĞĂƐƵƌĞĚƚŚĞůĞǀĞůƐŽĨŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚ

ŵŝZͲϰϵϱͲϯƉŝŶϯdϯĐĞůůƐĨŽůůŽǁŝŶŐϮϰŚŽƵƌƐƐĞƌƵŵͲƐƚĂƌǀĂƟŽŶ;&ŝŐƵƌĞϳͿ͘&ŽůůŽǁŝŶŐƐĞƌƵŵͲƐƚĂƌǀĂƟŽŶ͕

ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨďŽƚŚŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉǁĂƐĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƚĞĚŝŶ/ZWŬŶŽĐŬͲĚŽǁŶĐĞůůƐ͕ǁŚŝĐŚ

ǁĂƐŶŽƚŽďƐĞƌǀĞĚŝŶĐĞůůƐƚŚĂƚǁĞƌĞĞŝƚŚĞƌŵŽĐŬƚƌĂŶƐĨĞĐƚĞĚŽƌƚƌĂŶƐĨĞĐƚĞĚǁŝƚŚĐŽŶƚƌŽůƐŝZE͘

Figure 7. siRNA mediated knockdown of CIRBP. tĞƐƚĞƌŶůŽƚƐŚŽǁŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞůƐŽĨ/ZW;Ϳ͘dŚĞĮƌƐƚϰůĂŶĞƐƐŚŽǁĚĞĐƌĞĂƐĞĚ

ĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶƐŽĨŵŽĐŬͲƚƌĂŶƐĨĞĐƚĞĚϯdϯĞdžƚƌĂĐƚ͕ƌĞŇĞĐƟŶŐĚĞĐƌĞĂƐĞĚ/ZWĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶƐ͘dŚĞŶĞdžƚůĂŶĞƐƐŚŽǁ/ZWƉƌŽƚĞŝŶ

ůĞǀĞůƐŝŶϯdϯĐĞůůƐĨŽůůŽǁŝŶŐĞŝƚŚĞƌĂƐŝŶŐůĞ;^ͿŽƌĚŽƵďůĞ;ͿƚƌĂŶƐĨĞĐƟŽŶǁŝƚŚƐŝZEƐƚĂƌŐĞƟŶŐ/ZW;/ZWͲϭĂŶĚ/ZWͲϮͿŽƌ

ĐŽŶƚƌŽůƐŝZE;Ϳ͘&ŽůĚĐŚĂŶŐĞŽĨŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϯϮϵͲϯƉŽƌŵŝZͲϰϵϱͲϯƉůĞǀĞůƐŝŶƐƚĂƌǀĞĚĐĞůůƐĂŌĞƌĚŽƵďůĞƚƌĂŶƐĨĞĐƟŽŶǁŝƚŚƐŝZEƐ

ĂŐĂŝŶƐƚ/ZW;Ϳ͘

7

Discussion

/Ŷ ƚŚŝƐ ƐƚƵĚLJ͕ ǁĞ ŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚ ƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů ƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ĚƵƌŝŶŐ ŝƐĐŚĞŵŝĂ͘

hƐŝŶŐƐƉĞĐŝĮĐƉƌŝŵĞƌƐĨŽƌĞĂĐŚŽĨƚŚĞŵŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐƐƚĞƉƐ͕ǁĞĨŽƵŶĚƚŚĂƚŝŶĐƌĞĂƐĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

ŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂŝƐŶŽƚĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚďLJŝŶĐƌĞĂƐĞĚƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶ͕ďƵƚƚŚĂƚŝƚ

ŝƐƚŚĞƌĞƐƵůƚŽĨŝŶĐƌĞĂƐĞĚƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐŽĨƉƌĞͲŵŝĐƌŽZEƚŽŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZE͘dŚĞŽďƐĞƌǀĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

ƉĂƩĞƌŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ in vivo ĂŌĞƌ ŝƐĐŚĞŵŝĂ ǁĂƐ ŵŝŵŝĐŬĞĚ in vitro ƵƐŝŶŐ ƐĞƌƵŵ ƐƚĂƌǀĂƟŽŶ

ŽĨ ϯdϯ ĐĞůůƐ͘ dŚŝƐ ĂůůŽǁĞĚ ƵƐ ƚŽ ŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞ ǁŚŝĐŚ ZWƐ ĐĂŶ ďŝŶĚ ƚŽ ƉƌĞͲŵŝZ ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐ ŽĨ ϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEƐ͕ƵƐŝŶŐ^ƚĂďůĞ/ƐŽƚŽƉĞ>ĂďĞůůŝŶŐŽĨŵŝŶŽĐŝĚƐ;^/>Ϳ͕ĨŽůůŽǁĞĚďLJZEƉƵůůͲĚŽǁŶĂŶĚ

DĂƐƐ^ƉĞĐƚƌŽŵĞƚƌLJ͘dŚĞZEďŝŶĚŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶƐ/ZWĂŶĚ,,ǁĞƌĞƐŚŽǁŶƚŽƐƉĞĐŝĮĐĂůůLJďŝŶĚŵŝZͲ ϯϮϵ ĂŶĚ ŵŝZͲϰϵϱ ƉƌĞĐƵƌƐŽƌƐ͘ tĞ ĐŽŶĮƌŵĞĚ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ĂŶĚ ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ƚŚĞƐĞ ZWƐ ŝŶ ŵƵƌŝŶĞ

ŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞƐĚƵƌŝŶŐŝƐĐŚĞŵŝĂ͕ĂƚŵZEůĞǀĞůĂƐǁĞůůĂƐƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞů͘

WŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů ƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ƉŽůLJĐŝƐƚƌŽŶŝĐ ŵŝĐƌŽZEƐ ŚĂƐ ďĞĞŶ ĚĞƐĐƌŝďĞĚ ƉƌĞǀŝŽƵƐůLJ͘ /Ŷ ĨĂĐƚ͕

ĚŝīĞƌĞŶƟĂůĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂ͕ƐŝŵŝůĂƌƚŽƚŚĂƚŽĨƚŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ͕

ŚĂƐĂůƐŽďĞĞŶƐŚŽǁŶĨŽƌŵŝĐƌŽZEƐŽĨƚŚĞƉŽůLJĐŝƐƚƌŽŶŝĐŵŝZͲϭϳͲϵϮĂĐůƵƐƚĞƌ͘dŚĞŵŝZͲϭϳͲϵϮĂĐůƵƐƚĞƌ

ĞŶĐŽĚĞƐĨŽƌƐĞǀĞŶŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEƐĂŶĚŝƐƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚĂƐŽŶĞƐŝŶŐůĞƉƌŝŵĂƌLJƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚ^ϭϵ͘,ŽǁĞǀĞƌ͕

ŝŶĚŝǀŝĚƵĂů ŵĞŵďĞƌƐ ŽĨ ƚŚĞ ŵŝZͲϭϳͲϵϮĂ ĐůƵƐƚĞƌ ǁĞƌĞ ĚŝīĞƌĞŶƟĂůůLJ ĞdžƉƌĞƐƐĞĚ ĚƵƌŝŶŐ ĞŶĚŽƚŚĞůŝĂů

ĚŝīĞƌĞŶƟĂƟŽŶŽĨŵƵƌŝŶĞĞŵďƌLJŽŶŝĐƐƚĞŵĐĞůůƐ²⁰͘dŚĞ^EϭƉƌŽƚĞŝŶ͕ǁŚŝĐŚŝƐĂĐŽŵƉŽŶĞŶƚŽĨƚŚĞZ/^͕

ǁĂƐĨŽƵŶĚƚŽďŝŶĚƚŽƉƌŝͲŵŝZƐ͕ƉƌĞͲŵŝZƐĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEƐŽĨƚŚĞŵŝZͲϭϳͲϵϮĂĐůƵƐƚĞƌ͘^ŝůĞŶĐŝŶŐŽĨ

^EϭƌĞĚƵĐĞĚƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐŽĨŵŝZͲϭϳͲϵϮĂĐůƵƐƚĞƌŵĞŵďĞƌƐ͕ĞƐƉĞĐŝĂůůLJƵŶĚĞƌŚLJƉŽdžŝĐĐŽŶĚŝƟŽŶƐ^ϭϴ͘,ĞƌĞ͕

ǁĞĐŽƵůĚŶŽƚĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞďŝŶĚŝŶŐŽĨ^EϭƚŽĞŝƚŚĞƌƉƌŝͲŵŝZƐŽƌƉƌĞͲŵŝZƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲ ϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱƵƐŝŶŐZ/WĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐ͘KƵƌĚĂƚĂĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞƚŚĂƚƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

ŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝƐŝŶĚĞƉĞŶĚĞŶƚŽĨ^EϭďŝŶĚŝŶŐ͕ďƵƚŝŶƐƚĞĂĚƌĞůŝĞƐŽŶ/ZWĂŶĚ,,͘

/ZW ŝƐ ĂŶ ĞǀŽůƵƟŽŶĂƌLJ ĐŽŶƐĞƌǀĞĚ ZW ƚŚĂƚ ŝƐ ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůůLJ ƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚ ŝŶ ůŽǁ ƚĞŵƉĞƌĂƚƵƌĞ

ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ Žƌ ŽƚŚĞƌ ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ ŽĨ ƐƚƌĞƐƐ͕ ŝŶĐůƵĚŝŶŐ ŝƐĐŚĞŵŝĂ^{21, 22}͘ /ZW ƉƌŽƚĞŝŶ ŝƐ ƉƌĞĚŽŵŝŶĂŶƚůLJ

ĞdžƉƌĞƐƐĞĚŝŶƚŚĞŶƵĐůĞƵƐ͕ďƵƚĐĂŶĂůƐŽďĞƚƌĂŶƐƉŽƌƚĞĚƚŽƚŚĞĐLJƚŽƉůĂƐŵƵŶĚĞƌƉŚLJƐŝŽůŽŐŝĐĂůŽƌƐƚƌĞƐƐĨƵů

ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ^Ϯϯ͘DŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐĨƌŽŵƉƌĞͲŵŝZƚŽŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEĂůƐŽŽĐĐƵƌƐŝŶƚŚĞĐLJƚŽƉůĂƐŵ͘

/ZWŝƐŝŶǀŽůǀĞĚŝŶƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨŵZEƐ͘,ĞƌĞŚŽǁĞǀĞƌ͕ǁĞƐŚŽǁĨŽƌƚŚĞĮƌƐƚƟŵĞ

ƚŚĂƚ/ZWŝƐĂůƐŽŝŶǀŽůǀĞĚŝŶƉŽƐƩƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨŵŝĐƌŽZEƐ͘&ƵƚƵƌĞĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐǁŝůů

ŚĂǀĞƚŽĚĞƚĞƌŵŝŶĞǁŚĞƚŚĞƌ/ZWĐĂŶĂůƐŽƌĞŐƵůĂƚĞŽƚŚĞƌŵŝĐƌŽZEƐĚƵƌŝŶŐŝƐĐŚĞŵŝĂ͘

,,ĨŽƌŵƐƚŚĞďĞƚĂƐƵďƵŶŝƚŽĨƚŚĞŵŝƚŽĐŚŽŶĚƌŝĂůƚƌŝĨƵŶĐƟŽŶĂůƉƌŽƚĞŝŶ͕ǁŚŝĐŚĐĂƚĂůLJnjĞƐƚŚĞůĂƐƚ

ƐƚĞƉƐŽĨŵŝƚŽĐŚŽŶĚƌŝĂůďĞƚĂͲŽdžŝĚĂƟŽŶŽĨůŽŶŐĐŚĂŝŶĨĂƩLJĂĐŝĚƐ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕,,ǁĂƐĨŽƵŶĚƚŽĂĐƚĂƐ

ĂŶZWĂŶĚďŝŶĚƌĞŶŝŶŵZE͕ůĞĂĚŝŶŐƚŽĚĞƐƚĂďŝůŝnjĂƟŽŶŽĨƌĞŶŝŶŵZE^Ϯϰ͘>ŽĐĂůŝnjĂƟŽŶŽĨ,,ǁĂƐ

ĨŽƵŶĚƚŽďĞƉƌĞĚŽŵŝŶĂŶƚůLJŝŶŵŝƚŽĐŚŽŶĚƌŝĂ͕ďƵƚĂůƐŽŝŶƚŚĞĐLJƚŽƉůĂƐŵĂŶĚŶƵĐůĞŽůŝŽĨĂůƵͲϲĐĞůůƐ^Ϯϱ. In ƚŚŝƐƐƚƵĚLJ͕ǁĞŽďƐĞƌǀĞĚďŽƚŚĐLJƚŽƉůĂƐŵŝĐĂƐǁĞůůĂƐŶƵĐůĞĂƌĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨďŽƚŚ,,ĂŶĚ/ZWŝŶ

ŵƵƌŝŶĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕ǁĞŚĂǀĞŶŽǁƐŚŽǁŶƚŚĂƚ,,ĐĂŶĂůƐŽ

ďŝŶĚƉƌŝͲŵŝZƐ͕ƉƌĞͲŵŝZƐĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEƐŽĨƚŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEĐůƵƐƚĞƌ͕ŝŶĚŝĐĂƟŶŐŝƚƐƌŽůĞŝŶ

ϭϵϰ

ZĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ŵŝĐƌŽZE ƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐ ƵŶĚĞƌ ƐƚƌĞƐƐ ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ ƐƵĐŚ ĂƐ ŚLJƉŽdžŝĂ ŚĂƐ ďĞĞŶ ƉƌĞǀŝŽƵƐůLJ

ƌĞƉŽƌƚĞĚďLJƐĞǀĞƌĂůƐƚƵĚŝĞƐ^ϮϲͲϮϴ͘/ŶĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĐĞůůƐ͕ŚLJƉŽdžŝĂǁĂƐƐŚŽǁŶƚŽďŽƚŚŝŶĐƌĞĂƐĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

ŽĨ ĐĞƌƚĂŝŶ ŵŝĐƌŽZEƐ ;ƐƵĐŚ ĂƐ ŵŝZͲϮϭϬͿ²⁷ ĂƐ ǁĞůů ĂƐ ƚŽ ƌĞĚƵĐĞ ŵŝĐƌŽZE ƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐ^Ϯϴ͘ &ƵƌƚŚĞƌ

ĞdžĂŵŝŶĂƟŽŶƌĞǀĞĂůĞĚƚŚĂƚĐŚƌŽŶŝĐŚLJƉŽdžŝĂĚŽǁŶͲƌĞŐƵůĂƚĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŝĐĞƌ͕ƌĞĚƵĐŝŶŐƐƵďƐĞƋƵĞŶƚ

ŵŝĐƌŽZE ƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐ^Ϯϴ͘ DŽƌĞ ƌĞĐĞŶƚůLJ͕ ƚŚĞ ŝŶǀŽůǀĞŵĞŶƚ ŽĨ ƚŚĞ ƉŝĚĞƌŵĂů 'ƌŽǁƚŚ &ĂĐƚŽƌ ZĞĐĞƉƚŽƌ

;'&ZͿŝŶŵŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐƵŶĚĞƌŚLJƉŽdžŝĐĐŽŶĚŝƟŽŶƐǁĂƐƌĞƉŽƌƚĞĚ͘'&ZǁĂƐƐŚŽǁŶƚŽŝŶĐƌĞĂƐĞ

ƉŚŽƐƉŚŽƌLJůĂƟŽŶ ŽĨ 'KϮ ƵŶĚĞƌ ŚLJƉŽdžŝĐ ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͕ ǁŚŝĐŚ ƌĞĚƵĐĞĚ 'KϮ ďŝŶĚŝŶŐ ƚŽ ŝĐĞƌ ĂŶĚ

ƐƵďƐĞƋƵĞŶƚŵŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐĨƌŽŵƉƌĞͲŵŝĐƌŽZEƚŽŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZEďLJŝĐĞƌ^Ϯϵ͘ůƚŚŽƵŐŚǁĞ

ĚŝĚŶŽƚƐƚƵĚLJƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐƵŶĚĞƌƚƌƵĞŚLJƉŽdžŝĐĐŽŶĚŝƟŽŶƐ in vitro͕ǁĞ

ǁĞƌĞĂďůĞƚŽĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞŝŶĐƌĞĂƐĞĚƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐƵŶĚĞƌĐŽŶĚŝƟŽŶƐŽĨƐĞƌƵŵƐƚĂƌǀĂƟŽŶ͘

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7

References

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2. zĂŶŐy͕Ƶtt͕>ŝ,͕>ŝƵ&͕<ŚŽƌƐŚŝĚŝ͕ZƵƚŶĂŵ:͕ĞƚĂů͘ŽƚŚŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϭϳͲϱƉĂŶĚƉĂƐƐĞŶŐĞƌƐƚƌĂŶĚŵŝZͲϭϳͲϯƉƚĂƌŐĞƚ

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10. &ƵŬƵĚĂd͕zĂŵĂŐĂƚĂ<͕&ƵũŝLJĂŵĂ^͕DĂƚƐƵŵŽƚŽd͕<ŽƐŚŝĚĂ/͕zŽƐŚŝŵƵƌĂ<͕ĞƚĂů͘ͲďŽdžZEŚĞůŝĐĂƐĞƐƵďƵŶŝƚƐŽĨƚŚĞƌŽƐŚĂ

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11. ĂǀŝƐE͕,ŝůLJĂƌĚ͕>ĂŐŶĂ'͕,ĂƚĂ͘^DƉƌŽƚĞŝŶƐĐŽŶƚƌŽůZK^,ͲŵĞĚŝĂƚĞĚŵŝĐƌŽZEŵĂƚƵƌĂƟŽŶ͘EĂƚƵƌĞϮϬϬϴ:Ƶů

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12. ,ĞŽ/͕:ŽŽ͕<ŝŵz<͕,ĂD͕zŽŽŶD:͕ŚŽ:͕ĞƚĂů͘dhdϰŝŶĐŽŶĐĞƌƚǁŝƚŚ>ŝŶϮϴƐƵƉƉƌĞƐƐĞƐŵŝĐƌŽZEďŝŽŐĞŶĞƐŝƐƚŚƌŽƵŐŚƉƌĞͲ ŵŝĐƌŽZEƵƌŝĚLJůĂƟŽŶ͘ĞůůϮϬϬϵƵŐϮϭ͖ϭϯϴ;ϰͿ͗ϲϵϲͲϳϬϴ͘

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17. ŚŽƵĚŚƵƌLJEZ͕ĚĞ>ŝŵĂ&͕ĚĞŶĚƌĞƐͲŐƵĂLJŽ>͕'ƌĂĨd͕ĂĐĞƌĞƐ:&͕ZĂƉƉƐŝůďĞƌ:͕ĞƚĂů͘dŝƐƐƵĞͲƐƉĞĐŝĮĐĐŽŶƚƌŽůŽĨďƌĂŝŶͲĞŶƌŝĐŚĞĚ

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20. dƌĞŐƵĞƌ<͕,ĞŝŶƌŝĐŚD͕KŚƚĂŶŝ<͕ŽŶĂƵĞƌ͕ŝŵŵĞůĞƌ^͘ZŽůĞŽĨƚŚĞŵŝĐƌŽZEͲϭϳͲϵϮĐůƵƐƚĞƌŝŶƚŚĞĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĚŝīĞƌĞŶƟĂͲ ƟŽŶŽĨƐƚĞŵĐĞůůƐ͘:sĂƐĐZĞƐϮϬϭϮ͖ϰϵ;ϱͿ͗ϰϰϳͲϲϬ͘

21. tĞůůŵĂŶŶ^͕ƵŚƌĞƌ͕DŽĚĞƌĞŐŐĞƌ͕ĞůŵĞƌ͕<ŝƌƐĐŚŶĞƌZ͕<ŽĞŚŶĞW͕ĞƚĂů͘KdžLJŐĞŶͲƌĞŐƵůĂƚĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƚŚĞZEͲďŝŶĚŝŶŐ

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22. :ĂĐŬƐŽŶd͕DĂŶŽůĞD͕<ŽƚĞƌŵĂŶƐŬŝ^͕:ĂĐŬƐŽŶ<͕ůĂƌŬZ^͕<ŽĐŚĂŶĞŬWD͘ŽůĚƐƚƌĞƐƐƉƌŽƚĞŝŶZDϯƌĞƐƉŽŶĚƐƚŽƚĞŵƉĞƌĂͲ ƚƵƌĞĐŚĂŶŐĞŝŶĂŶƵůƚƌĂͲƐĞŶƐŝƟǀĞŵĂŶŶĞƌŝŶLJŽƵŶŐŶĞƵƌŽŶƐ͘EĞƵƌŽƐĐŝĞŶĐĞϮϬϭϱKĐƚϭ͖ϯϬϱ͗ϮϲϴͲϳϴ͘

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Ϯϱ͘ DŽƌƌŝƐ:͕ĚĂŵƐ:͕ĞǀĞƌŝĚŐĞ:͕ǀĂŶĚĞƌtĞLJĚĞŶ>͕DĂŶŐƐ,͕>ĞĞĚŵĂŶW:͘ĐDWĐŽŶƚƌŽůƐŚƵŵĂŶƌĞŶŝŶŵZEƐƚĂďŝůŝƚLJǀŝĂ

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27. &ĂƐĂŶĂƌŽW͕͛ůĞƐƐĂŶĚƌĂz͕ŝ^͕s͕DĞůĐŚŝŽŶŶĂZ͕ZŽŵĂŶŝ^͕WŽŵƉŝůŝŽ'͕ĞƚĂů͘DŝĐƌŽZEͲϮϭϬŵŽĚƵůĂƚĞƐĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĐĞůů

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Ϯϴ͘ ,Ž::͕DĞƚĐĂůĨ:>͕zĂŶD^͕dƵƌŐĞŽŶW:͕tĂŶŐ::͕ŚĂůƐĞǀD͕ĞƚĂů͘&ƵŶĐƟŽŶĂůŝŵƉŽƌƚĂŶĐĞŽĨŝĐĞƌƉƌŽƚĞŝŶŝŶƚŚĞĂĚĂƉƟǀĞĐĞůůƵůĂƌ

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ƚŚƌŽƵŐŚƉŚŽƐƉŚŽƌLJůĂƟŽŶŽĨ'KϮ͘EĂƚƵƌĞϮϬϭϯDĂLJϭϲ͖ϰϵϳ;ϳϰϰϵͿ͗ϯϴϯͲϳ͘

ϭϵϲ

Supplemental Material

^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂƌLJdĂďůĞϭ͘>ŝƐƚŽĨƉƌŝŵĞƌƐƵƐĞĚ͘

^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϭ͘ZEďŝŶĚŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶǁŝƚŚ^EϭĂŶƟďŽĚLJ͘WƌŝͲŵŝZ͕ƉƌĞͲŵŝZĂŶĚŵĂƚƵƌĞŵŝĐƌŽZE

ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨŵŝZͲϯϮϵͲϯƉĂŶĚŵŝZͲϰϵϱͲϯƉǁĞƌĞŵĞĂƐƵƌĞĚŝŶϯdϯĐĞůůůLJƐĂƚĞƐĂŌĞƌŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶǁŝƚŚ^EϭĂŶƟďŽĚLJ

ĂŶĚĂŶŽŶͲƐƉĞĐŝĮĐ/Ő'ĂŶƟďŽĚLJ͘

Gene Forward Primer Reverse Primer

primiR-329 AAGGTCACGTTGGGGAATTA ACCACGAAGCCTCCAAGAT premiR-329 TGGTACCGGAAGAGAGGTTTT AGGTTAGCTGGGTGTGTTTCA primiR-495 AGCATCCCTTCACACTCAGG GAGCTCTCCAAGGTGAGATTTG premiR-495 GTTGCCCATGTTATTTTTCG AGTGCACCATGTTTGTTTCG

CIRBP TTTTCGTGGGAGGACTCAGC CCCTGTCCTTTACCACCACC

HADHB CAGCGCCTGTCCTTACTCAG CAGAGTGGCCCATGGTCTC

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Part III