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The handle http://hdl.handle.net/1887/47467 holds various files of this Leiden University dissertation

Author: Welten, S.M.J.

Title: The role of 14q32 microRNAs in vascular remodelling

Issue Date: 2017-03-09

dŚĞƌŽůĞŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŝŶƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ͗ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨƚŚĞϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱƌĞĚƵĐĞƐůĞƐŝŽŶĨŽƌŵĂƟŽŶ͕ŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂĂŶĚ

ƉůĂƐŵĂĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůůĞǀĞůƐŝŶĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂůƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ

^ƵďŵŝƩĞĚƚŽƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ

SMJ Welten^1,2Ύ ZDĚĞ:ŽŶŐ^1,2Ύ

tĞnjĞů^ϯ DZĚĞsƌŝĞƐ^1,2 DŽŽŶƐƚĂ¹ ,WĞƚĞƌƐ^1,2 :t:ƵŬĞŵĂ^ϰ dǀĂŶĚĞƌ^ůƵŝƐ^ϱ ZƌĞŶƐ^ϱ /Žƚ^ϯ

^ŐƌĂǁĂů^ϲ W,YƵĂdž^{1,2 †}

zEŽƐƐĞŶƚ^{1,2 †}

ΎƵƚŚŽƌƐĐŽŶƚƌŝďƵƚĞĚĞƋƵĂůůLJƚŽƚŚŝƐǁŽƌŬ

†ƵƚŚŽƌƐĐŽŶƚƌŝďƵƚĞĚĞƋƵĂůůLJƚŽƚŚŝƐǁŽƌŬ

1ĞƉĂƌƚŵĞŶƚŽĨ^ƵƌŐĞƌLJĂŶĚ²ŝŶƚŚŽǀĞŶ>ĂďŽƌĂƚŽƌLJĨŽƌdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂůsĂƐĐƵůĂƌDĞĚŝĐŝŶĞ͕

>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJDĞĚŝĐĂůĞŶƚĞƌ͕>ĞŝĚĞŶ͕ƚŚĞEĞƚŚĞƌůĂŶĚƐ

ϯŝǀŝƐŝŽŶŽĨŝŽƉŚĂƌŵĂĐĞƵƟĐ͕>Z͕>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJ͕>ĞŝĚĞŶ͕ƚŚĞEĞƚŚĞƌůĂŶĚƐ

ϰĞƉĂƌƚŵĞŶƚŽĨĂƌĚŝŽůŽŐLJĂŶĚ^ϱĞƉĂƌƚŵĞŶƚŽĨ/ŵŵƵŶŽŚĞŵĂƚŽůŽŐLJĂŶĚůŽŽĚdƌĂŶƐĨƵƐŝŽŶ͕

>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJDĞĚŝĐĂůĞŶƚĞƌ͕>ĞŝĚĞŶ͕ƚŚĞEĞƚŚĞƌůĂŶĚƐ

ϲ/ĚĞƌĂWŚĂƌŵĂĐĞƵƟĐĂůƐ͕ĂŵďƌŝĚŐĞ͕D͕hŶŝƚĞĚ^ƚĂƚĞƐŽĨŵĞƌŝĐĂ

Chapter 5

ϭϯϴ

Abstract

ŝŵƐ͗dŽŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞƚŚĞƌŽůĞŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŝŶŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂĂŶĚĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͖

ƚǁŽŵĂũŽƌĐŽŶƚƌŝďƵƚŽƌƐƚŽƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ͘ZĞƐƚĞŶŽƐŝƐŽĐĐƵƌƐƌĞŐƵůĂƌůLJŝŶƉĂƟĞŶƚƐƚƌĞĂƚĞĚĨŽƌĐŽƌŽŶĂƌLJĂƌƚĞƌLJ

ĚŝƐĞĂƐĞĂŶĚƉĞƌŝƉŚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝĂůĚŝƐĞĂƐĞ͘tĞŚĂǀĞƉƌĞǀŝŽƵƐůLJƐŚŽǁŶƚŚĂƚŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

ůĞĂĚƐ ƚŽ ŝŶĐƌĞĂƐĞĚ ƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐ ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZE ŵŝZͲϰϵϰ ĂůƐŽ

ĚĞĐƌĞĂƐĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͕ǁŚŝůĞŝŶĐƌĞĂƐŝŶŐƉůĂƋƵĞƐƚĂďŝůŝƚLJ͘tĞŚLJƉŽƚŚĞƐŝnjĞĚƚŚĂƚϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZE

ŝŶŚŝďŝƟŽŶŚĂƐďĞŶĞĮĐŝĂůĞīĞĐƚƐŽŶŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͕ĂƐǁĞůůĂƐĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͘

DĞƚŚŽĚƐ ĂŶĚ ZĞƐƵůƚƐ͗ EŽŶͲĐŽŶƐƚƌŝĐƟǀĞ ĐƵīƐ ǁĞƌĞ ƉůĂĐĞĚ ĂƌŽƵŶĚ ďŽƚŚ ĨĞŵŽƌĂů ĂƌƚĞƌŝĞƐ ŽĨ

ŶŽƌŵŽĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŵŝĐ ϱϳ>ͬϲ: ŵŝĐĞ ƚŽ ŝŶĚƵĐĞ ŝŶƟŵĂů ŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͘ ĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐ

ƉůĂƋƵĞ ĨŽƌŵĂƟŽŶ ǁĂƐ ŝŶĚƵĐĞĚ ŝŶ ŚLJƉĞƌĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŵŝĐ ƉŽ

 ŵŝĐĞ ďLJ ƉůĂĐŝŶŐ ƐĞŵŝͲĐŽŶƐƚƌŝĐƟǀĞ

ĐŽůůĂƌƐĂƌŽƵŶĚďŽƚŚĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐ͘ϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĞƌĞŝŶŚŝďŝƚĞĚ

in vivo  ƵƐŝŶŐ 'ĞŶĞ ^ŝůĞŶĐŝŶŐ KůŝŐŽŶƵĐůĞŽƟĚĞƐ ;'^KƐͿ͘ īĞĐƚƐ ŽĨ ŵŝĐƌŽZE ŝŶŚŝďŝƟŽŶ ŽŶ ŝŶƟŵĂů

ŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͕ĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐĂŶĚǀĞƐƐĞůǁĂůůƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐǁĞƌĞŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚĂŌĞƌϮϭĚĂLJƐ

ŝŶƚŚĞĐƵīŵŽĚĞůĂŶĚĂŌĞƌϮϴĚĂLJƐŝŶƚŚĞĐŽůůĂƌŵŽĚĞů͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱůĞĚƚŽĂϯϮйƌĞĚƵĐƟŽŶ

ŽĨŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͘DŽƌĞŽǀĞƌ͕ƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐŝŶƚŚĞĂƌƚĞƌŝĂůǁĂůůŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚ

ǁŝƚŚ'^KͲϰϵϱǁĂƐƌĞĚƵĐĞĚďLJϱϱй͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϰŚĂĚůĞƐƐƉƌŽĨŽƵŶĚĞīĞĐƚƐŽŶ

ŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱĂůƐŽĚĞĐƌĞĂƐĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐƉůĂƋƵĞĨŽƌŵĂƟŽŶďLJϱϮйĂŶĚ

ƉůĂƋƵĞƐŽĨ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐƐŚŽǁĞĚĂŵŽƌĞƐƚĂďůĞƉŚĞŶŽƚLJƉĞ͘&ŝŶĂůůLJ͕ĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůůĞǀĞůƐǁĞƌĞ

ĂůƐŽĚĞĐƌĞĂƐĞĚŝŶ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͕ǀŝĂƌĞĚƵĐƟŽŶŽĨƚŚĞs>>ͲĨƌĂĐƟŽŶ͘

ŽŶĐůƵƐŝŽŶƐ͗ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ŵŝZͲϰϵϱ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ŽƵƌ ƉƌŝŵĂƌLJ ŽƵƚĐŽŵĞƐ͕ ŶĂŵĞůLJ ŝŶƟŵĂů ŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ

ĂŶĚ ĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͕ ďŽƚŚ ŵĂũŽƌ ĐŽŶƚƌŝďƵƚŽƌƐ ƚŽ ƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ŵŝZͲϰϵϱ ĂůƐŽ

ĨĂǀŽƵƌĂďůLJĂīĞĐƚĞĚŵƵůƟƉůĞƐĞĐŽŶĚĂƌLJŽƵƚĐŽŵĞƐ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞŝŶŇƵdž͕ƉůĂƋƵĞƐƚĂďŝůŝƚLJĂŶĚ

ƚŽƚĂůƉůĂƐŵĂĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůůĞǀĞůƐ͘tĞĐŽŶĐůƵĚĞƚŚĂƚϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱŝƐĂƉƌŽŵŝƐŝŶŐƚĂƌŐĞƚĨŽƌ

ƉƌĞǀĞŶƟŽŶŽĨƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ͘

5

/ŶƚƌŽĚƵĐƟŽŶ

^ĞǀĞƌĞ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ ĐĂŶ ĐĂƵƐĞ ŶĂƌƌŽǁŝŶŐ ĂŶĚ ŽĐĐůƵƐŝŽŶƐ ŽĨ ĂīĞĐƚĞĚ ĂƌƚĞƌŝĞƐ͕ ƚŚĂƚ ƌĞƋƵŝƌĞ

ĞŶĚŽǀĂƐĐƵůĂƌ ŝŶƚĞƌǀĞŶƟŽŶ ;ƐƵĐŚ ĂƐ ďĂůůŽŽŶ ĂŶŐŝŽƉůĂƐƚLJ ǁŝƚŚ Žƌ ǁŝƚŚŽƵƚ ƐƚĞŶƟŶŐͿ ƚŽ ƌĞƐƚŽƌĞ ĂŶĚ

ŵĂŝŶƚĂŝŶ ďůŽŽĚ ŇŽǁ͘ hŶĨŽƌƚƵŶĂƚĞůLJ͕ ǀĂƐĐƵůĂƌ ĚĂŵĂŐĞ ŝŶŇŝĐƚĞĚ ďLJ ƚŚĞƐĞ ŝŶƚĞƌǀĞŶƟŽŶƐ ĐĂŶ ůĞĂĚ ƚŽ

ƌĂƉŝĚƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐŽĨƚŚĞĂƌƚĞƌLJ

͘/ŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂŝƐĂŶŝŵƉŽƌƚĂŶƚĐŽŶƚƌŝďƵƚŽƌƚŽƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ͕ǁŚŝĐŚ

ŝƐ ĐŚĂƌĂĐƚĞƌŝnjĞĚ ďLJ ĞdžƚƌĂĐĞůůƵůĂƌ ŵĂƚƌŝdž ƌĞĂƌƌĂŶŐĞŵĞŶƚƐ͕ ƐŵŽŽƚŚ ŵƵƐĐůĞ ĐĞůů ;^DͿ ƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ

ĂŶĚ ŝŶŇĂŵŵĂƟŽŶ͘ KŶ ƚŽƉ ŽĨ ƚŚĂƚ͕ ĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ ŝƐ ŽďƐĞƌǀĞĚ͕ ĞƐƉĞĐŝĂůůLJ ƵŶĚĞƌ

ŚLJƉĞƌĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŵŝĐ ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͘ /ŶƟŵĂů ŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ ŝƐ ŝŶŝƟĂƚĞĚ ďLJ ĚĂŵĂŐĞ ƚŽ ƚŚĞ ĞŶĚŽƚŚĞůŝƵŵ

ĐĂƵƐĞĚďLJǀĂƐĐƵůĂƌŝŶƚĞƌǀĞŶƟŽŶƐĂŶĚƌĞƐƵůƚƐŝŶƚŚĞĂĐƟǀĂƟŽŶŽĨĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĐĞůůƐ;ƐͿ͘^ƵďƐĞƋƵĞŶƚůLJ͕

ůĞƵŬŽĐLJƚĞƐĂĚŚĞƌĞƚŽĂŶĚŝŶĮůƚƌĂƚĞƚŚĞǀĞƐƐĞůǁĂůů͘dŚĞƐĞůĞƵŬŽĐLJƚĞƐƐĞĐƌĞƚĞŝŶŇĂŵŵĂƚŽƌLJĐLJƚŽŬŝŶĞƐ

ĂŶĚĐŚĞŵŽŬŝŶĞƐƉƌŽŵŽƟŶŐŝŶŇĂŵŵĂƟŽŶĂŶĚƌĞůĞĂƐĞŵĂƚƌŝdžŵĞƚĂůůŽƉƌŽƚĞŝŶĂƐĞƐĂŶĚŐƌŽǁƚŚĨĂĐƚŽƌƐ

ůĞĂĚŝŶŐ ƚŽ ĞdžƚƌĂĐĞůůƵůĂƌ ŵĂƚƌŝdž ƌĞŵŽĚĞůŝŶŐ ĂƐ ǁĞůů ĂƐ ƐŵŽŽƚŚ ŵƵƐĐůĞ ĐĞůů ;^DͿ ƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ ĂŶĚ

ŵŝŐƌĂƟŽŶ͘ ĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ ŝƐ ŝŶŝƟĂƚĞĚ ďLJ ƐĞǀĞƌĞ ŇŽǁ ĚŝƐƚƵƌďĂŶĐĞ ĐŽŵďŝŶĞĚ ǁŝƚŚ ƚŚĞ

ƵƉƚĂŬĞŽĨůŝƉŝĚƐďLJŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐŝŶƚŚĞǀĞƐƐĞůǁĂůůĂŶĚƐƵďƐĞƋƵĞŶƚĨŽƌŵĂƟŽŶŽĨĨŽĂŵĐĞůůƐƵŶĚĞƌ

ŚLJƉĞƌĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŵŝĐĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͘

DŝĐƌŽZEƐĂƌĞƐŚŽƌƚĞŶĚŽŐĞŶŽƵƐZEŵŽůĞĐƵůĞƐǁŚŝĐŚ͕ƚŚƌŽƵŐŚďŝŶĚŝŶŐƚŽƚŚĞϯ͛hdZŽĨƚŚĞŝƌƚĂƌŐĞƚ

ŵZE͕ƌĞŐƵůĂƚĞŐĞŶĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶďLJŝŶŚŝďŝƟŶŐƚƌĂŶƐůĂƟŽŶŽĨƚŚĞŵZEŝŶƚŽƉƌŽƚĞŝŶ͘ƐŝŶŐůĞŵŝĐƌŽZE

ŝƐĂďůĞƚŽƌĞŐƵůĂƚĞŶƵŵĞƌŽƵƐ͕ƵƉƚŽƐĞǀĞƌĂůŚƵŶĚƌĞĚ͕ƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ

͘dŚĞĨĂĐƚƚŚĂƚĂƐŝŶŐůĞŵŝĐƌŽZE

ĐĂŶ ĮŶĞͲƚƵŶĞ ƚŚĞ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ ůĂƌŐĞ ƐĞƚƐ ŽĨ ƚĂƌŐĞƚ ŐĞŶĞƐ ĂŶĚ ƚŚƵƐ ŐĞŶĞƟĐ ƉƌŽŐƌĂŵƐ ĨŽƌ ƐƉĞĐŝĮĐ

ƉŚLJƐŝŽůŽŐŝĐĂůƉƌŽĐĞƐƐĞƐŵĂŬĞƐŵŝĐƌŽZEƐĂŶŝŶƚĞƌĞƐƟŶŐƚŚĞƌĂƉĞƵƟĐƚŽŽůĨŽƌĐŽŵƉůĞdžĚŝƐĞĂƐĞƐ

. tĞ ŚĂǀĞ ƉƌĞǀŝŽƵƐůLJ ƐŚŽǁŶ ƚŚĂƚ ƐĞǀĞƌĂů ŵĞŵďĞƌƐ ŽĨ Ă ůĂƌŐĞ ŵŝĐƌŽZE ŐĞŶĞ ĐůƵƐƚĞƌ ŽŶ ŚƵŵĂŶ

ĐŚƌŽŵŽƐŽŵĞ ϭϰ ;ϭϰƋϯϮͿ ĂƌĞ ŚŝŐŚůLJ ŝŶǀŽůǀĞĚ ŝŶ ǀĂƐĐƵůĂƌ ƌĞŵŽĚĞůŝŶŐ͕ ƚĂƌŐĞƟŶŐ ŵƵůƟƉůĞ ƉƌŽĐĞƐƐĞƐ

ŝŵƉŽƌƚĂŶƚĨŽƌŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶĂŶĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ

͘dŚĞϭϰƋϯϮĐůƵƐƚĞƌĞŶĐŽĚĞƐŽǀĞƌϱϰŵŝĐƌŽZE

ŐĞŶĞƐ ĂŶĚ ŝƐ ŚŝŐŚůLJ ĐŽŶƐĞƌǀĞĚ ďĞƚǁĞĞŶ ŵĂŵŵĂůƐ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ŵŝZͲϯϮϵ͕ ŵŝZͲ ϰϴϳď͕ ŵŝZͲϰϵϰ ĂŶĚ ŵŝZͲϰϵϱ ŝŵƉƌŽǀĞĚ ƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐ ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ ŝŶ ĂŶ ŚŝŶĚ ůŝŵď ŝƐĐŚĞŵŝĂ

ŵŽĚĞů

͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϰĂůƐŽƌĞĚƵĐĞĚĐŽůůĂƌͲŝŶĚƵĐĞĚƉůĂƋƵĞƐŝnjĞ;ĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ

ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐͿ͕ ŝŶĐƌĞĂƐĞĚ ƉůĂƋƵĞ ƐƚĂďŝůŝƚLJ ĂŶĚ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ƉůĂƐŵĂ ĐŚŽůĞƐƚĞƌŽů ůĞǀĞůƐ

͘ ,ĂŶ Ğƚ͘ Ăů͘

ĂůƐŽ ŽďƐĞƌǀĞĚ ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ŽƚŚĞƌ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ;ŶĂŵĞůLJ ŵŝZͲϰϯϭ͕ ŵŝZͲϲϲϴ ĂŶĚ ŵŝZͲϳϱϴͿ

ŝŶ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐ ĂŽƌƚĂƐ ŽĨ ƉŽ

 ŵŝĐĞ ĐŽŵƉĂƌĞĚ ƚŽ ŚĞĂůƚŚLJ ĂŽƌƚĂƐ ŽĨ ϱϳ>ͬϲ ŵŝĐĞ

. Moreover, ŚLJƉŽŵĞƚŚLJůĂƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ǁĂƐ ŽďƐĞƌǀĞĚ ŝŶ ŚƵŵĂŶ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐ ƉůĂƋƵĞƐ͕ ƌĞƐƵůƟŶŐ

ŝŶƚŚĞƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨƐĞǀĞƌĂůϭϰƋϯϮĐůƵƐƚĞƌŵĞŵďĞƌƐ

͘dŚĞƌŽůĞŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŝŶƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ

ŚŽǁĞǀĞƌ͕ŝƐƵŶŬŶŽǁŶ͘

dŚĞ ŝŶǀŽůǀĞŵĞŶƚ ŽĨ ŵŝĐƌŽZEƐ ŝŶ ƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ ŚĂƐ ďĞĞŶ ĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞĚ ŝŶ ƐĞǀĞƌĂů ƐƚƵĚŝĞƐ ĂŶĚ ǁĂƐ

ƌĞĐĞŶƚůLJƌĞǀŝĞǁĞĚ

͘&ŽƌĞdžĂŵƉůĞ͕ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϮϭĚĞĐƌĞĂƐĞĚŶĞŽŝŶƟŵĂĨŽƌŵĂƟŽŶŝŶƌĂƚĐĂƌŽƟĚ

ĂƌƚĞƌŝĞƐĂŌĞƌĂŶŐŝŽƉůĂƐƚLJ͕ǁŚĞƌĞĂƐŽǀĞƌĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝZͲϮϵďŝŶŚŝďŝƚĞĚƚŚĞĨŽƌŵĂƟŽŶŽĨŶĞŽŝŶƟŵĂ

ŝŶ ďĂůůŽŽŶͲŝŶũƵƌĞĚ ƌĂƚ ĐĂƌŽƟĚ ĂƌƚĞƌŝĞƐ

͘ ĂƐĞĚ ŽŶ ŽƵƌ ƉƌĞǀŝŽƵƐ ĮŶĚŝŶŐƐ͕ ǁĞ ŚLJƉŽƚŚĞƐŝnjĞĚ ƚŚĂƚ

ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZE ŝŶŚŝďŝƟŽŶ ǁŽƵůĚ ƌĞĚƵĐĞ ůĞƐŝŽŶ ĨŽƌŵĂƟŽŶ ŝŶ ĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂů ŵŽĚĞůƐ ĨŽƌ ƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ͘

/ŶƚŚŝƐƐƚƵĚLJ͕ǁĞŝŶŚŝďŝƚĞĚϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶĂŵŽĚĞůĨŽƌŝŶƟŵĂů

ŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂĂŶĚƐƵďƐĞƋƵĞŶƚůLJ͕ǁĞŝŶŚŝďŝƚĞĚŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶĂŶĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ

ϭϰϬ

ŵŽĚĞůĂŶĚĞdžĂŵŝŶĞĚƚŚĞĞīĞĐƚƐŽŶƉƌŝŵĂƌLJŽƵƚĐŽŵĞƐŽĨǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůŝŶŐŽƌĂƌƚĞƌŝĂůƐƚĞŶŽƐŝƐ͘/Ŷ

ĂĚĚŝƟŽŶ͕ǁĞƐƚƵĚŝĞĚƚŚĞĞīĞĐƚƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶƐĞĐŽŶĚĂƌLJŽƵƚĐŽŵĞƐƐƵĐŚĂƐƚĂƌŐĞƚ

ŐĞŶĞƌĞŐƵůĂƟŽŶ͕ǀĂƐĐƵůĂƌĐĞůůƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͕ƉůĂƋƵĞƐƚĂďŝůŝƚLJĂŶĚĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůŚŽŵĞŽƐƚĂƐŝƐ͘

5

Methods

Mice

dŚŝƐ ƐƚƵĚLJ ǁĂƐ ƉĞƌĨŽƌŵĞĚ ŝŶ ĐŽŵƉůŝĂŶĐĞ ǁŝƚŚ ƵƚĐŚ ŐŽǀĞƌŶŵĞŶƚ ŐƵŝĚĞůŝŶĞƐ ĂŶĚ ƚŚĞ ŝƌĞĐƟǀĞ ϮϬϭϬͬϲϯͬh ŽĨ ƚŚĞ ƵƌŽƉĞĂŶ

WĂƌůŝĂŵĞŶƚ͘ůůĂŶŝŵĂůĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐǁĞƌĞĂƉƉƌŽǀĞĚďLJƚŚĞ/ŶƐƟƚƵƟŽŶĂůŽŵŵŝƩĞĞĨŽƌŶŝŵĂůtĞůĨĂƌĞŽĨƚŚĞ>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJ

DĞĚŝĐĂů ĞŶƚĞƌ;ĂƉƉƌŽǀĂů ƌĞĨĞƌĞŶĐĞŶƵŵďĞƌƐ ϭϯϭϭϵĂŶĚ ϭϮϭϲϱͿ͘DĂůĞ ϱϳ>ͬϲ: ;ϭϬǁĞĞŬƐ ŽůĚͿ ĂŶŝŵĂůƐ ǁĞƌĞƉƵƌĐŚĂƐĞĚ ĨƌŽŵ

ƚŚĞ:ĂĐŬƐŽŶ>ĂďŽƌĂƚŽƌLJ͘DĂůĞƉŽ^ͲͬͲ;ϳͲϭϰǁĞĞŬƐŽůĚĂƚƐƚĂƌƚŽĨĚŝĞƚͿǁĞƌĞďƌĞĚŝŶƚŚĞůŽĐĂůĂŶŝŵĂůďƌĞĞĚŝŶŐĨĂĐŝůŝƚLJ;'ŽƌůĂĞƵƐ

>ĂďŽƌĂƚŽƌŝĞƐ͕>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJ͕>ĞŝĚĞŶ͕ƚŚĞEĞƚŚĞƌůĂŶĚƐͿ͘ϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞƌĞĐĞŝǀĞĚĐŚŽǁĚŝĞƚĚƵƌŝŶŐƚŚĞǁŚŽůĞĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚ͘ƉŽ^Ͳ

ͬͲŵŝĐĞǁĞƌĞĨĞĚĂtĞƐƚĞƌŶͲƚLJƉĞĚŝĞƚ͕ĐŽŶƚĂŝŶŝŶŐϬ͘ϮϱйĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĂŶĚϭϱйĐĂĐĂŽďƵƩĞƌ;^ƉĞĐŝĂůŝĞƚ^ĞƌǀŝĐĞƐͿĨŽƌƐŝdžǁĞĞŬƐ͕ƚǁŽ

ǁĞĞŬƐƉƌŝŽƌƚŽƐƵƌŐĞƌLJ͘ůůĂŶŝŵĂůƐƌĞĐĞŝǀĞĚĨŽŽĚĂŶĚǁĂƚĞƌĂĚůŝďŝƚƵŵĚƵƌŝŶŐƚŚĞĞŶƟƌĞĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚ͘ƵƌŝŶŐƐƵƌŐĞƌLJ͕ŵŝĐĞǁĞƌĞ

ĂŶĞƐƚŚĞƟnjĞĚďLJŝŶƚƌĂƉĞƌŝƚŽŶĞĂů;ŝ͘ƉͿŝŶũĞĐƟŽŶŽĨŵŝĚĂnjŽůĂŵ;ϴŵŐͬŬŐ͕ZŽĐŚĞŝĂŐŶŽƐƟĐƐͿ͕ŵĞĚĞƚŽŵŝĚŝŶĞ;Ϭ͘ϰŵŐͬŬŐ͕KƌŝŽŶͿĂŶĚ

ĨĞŶƚĂŶLJů;Ϭ͘ϬϴŵŐͬŬŐ͕:ĂŶƐƐĞŶWŚĂƌŵĂĐĞƵƟĐĂͿ͘dŚĞĂĚĞƋƵĂĐLJŽĨƚŚĞĂŶĂĞƐƚŚĞƐŝĂǁĂƐŵŽŶŝƚŽƌĞĚďLJŬĞĞƉŝŶŐƚƌĂĐŬŽĨƚŚĞďƌĞĂƚŚŝŶŐ

ĨƌĞƋƵĞŶĐLJĂŶĚƚŚĞƌĞƐƉŽŶƐĞƚŽƚŽĞƉŝŶĐŚŝŶŐŽĨƚŚĞŵŝĐĞ͘ŌĞƌƐƵƌŐĞƌLJ͕ŵŝĐĞǁĞƌĞĂŶƚĂŐŽŶŝnjĞĚǁŝƚŚĂƐƵďĐƵƚĂŶĞŽƵƐŝŶũĞĐƟŽŶŽĨ

ŇƵŵĞŶĂnjĞŶŝů;Ϭ͘ϱŵŐͬŬŐ͖&ƌĞƐĞŶŝƵƐ<ĂďŝͿ͕ĂŶƚĞƐĞĚĂŶ;Ϯ͘ϱŵŐͬŬŐ͖^dWŚĂƌŵĂͿĂŶĚďƵƉƌĞŶŽƌƉŚŝŶĞ;Ϭ͘ϭŵŐͬŬŐ͖D^ŶŝŵĂů,ĞĂůƚŚͿ͘

&ĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJĐƵīŵŽƵƐĞŵŽĚĞů

/ŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂǁĂƐŝŶĚƵĐĞĚďLJƉůĂĐĞŵĞŶƚŽĨĂŶŽŶͲĐŽŶƐƚƌŝĐƟǀĞĐƵīĂƌŽƵŶĚƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJŽĨϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ;ŶсϭϬƉĞƌ

ŐƌŽƵƉͿ͘dŚĞůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐǁĞƌĞŝƐŽůĂƚĞĚĂŶĚĂƌŝŐŝĚ͕ŶŽŶͲĐŽŶƐƚƌŝĐƟǀĞƉŽůLJĞƚŚLJůĞŶĞĐƵīǁĂƐƉůĂĐĞĚĂƌŽƵŶĚƚŚĞ

ĂƌƚĞƌLJ͘dŚĞƌĞĂŌĞƌ͕ƚŚĞǁŽƵŶĚǁĂƐĐůŽƐĞĚďLJĂĐŽŶƟŶƵŽƵƐƐƵƚƵƌĞ͘ŌĞƌϮϭĚĂLJƐ͕ŵŝĐĞǁĞƌĞĂŶĞƐƚŚĞƟnjĞĚĂŶĚƐĂĐƌŝĮĐĞĚǀŝĂƉĞƌĨƵƐŝŽŶ͘

sĞŶŽƵƐďůŽŽĚǁĂƐĚƌĂǁŶŝŶdĐŽůůĞĐƟŽŶƚƵďĞƐĂŶĚĐĞŶƚƌŝĨƵŐĞĚ;ϲϬϬϬƌƉŵĨŽƌϭϬŵŝŶĂƚϰΣͿƚŽŽďƚĂŝŶƉůĂƐŵĂ͘dŚĞƚŚŽƌĂdžǁĂƐ

ŽƉĞŶĞĚĂŶĚŵŝůĚƉƌĞƐƐƵƌĞͲƉĞƌĨƵƐŝŽŶ;ϭϬϬŵŵ,ŐͿǁŝƚŚW^ǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚĨŽƌϰŵŝŶƵƚĞƐďLJĐĂƌĚŝĂĐƉƵŶĐƚƵƌĞŝŶƚŚĞůĞŌǀĞŶƚƌŝĐůĞ͘

>LJŵƉŚŶŽĚĞƐĂŶĚƐƉůĞĞŶǁĞƌĞŝƐŽůĂƚĞĚĨŽƌ&^ĂŶĂůLJƐŝƐ͘ŌĞƌƉĞƌĨƵƐŝŽŶǁŝƚŚϯ͘ϳйĨŽƌŵĂůĚĞŚLJĚĞ͕ĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐǁĞƌĞ

ŚĂƌǀĞƐƚĞĚ͕ĮdžĞĚϱŚŽƵƌƐŝŶĨŽƌŵĂůĚĞŚLJĚĞĂŶĚƉĂƌĂĸŶͲĞŵďĞĚĚĞĚ͘

ĂƌŽƟĚĐŽůůĂƌŵŽƵƐĞŵŽĚĞů

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Treatment with GSOs in in vivo models

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ĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůŽdžŝĚĂƐĞ;^ŝŐŵĂͿĂŶĚϬ͘ϬϲϱhͬŵůƉĞƌŽdžŝĚĂƐĞĂŶĚϭϱђŐͬŵ>ĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞƐƚĞƌĂƐĞ;ZŽĐŚĞŝĂŐŶŽƐƟĐƐͿŝŶƉŽůLJŽdžLJĞƚŚLJůĞŶĞͲ ϵͲůĂƵƌLJůĞƚŚĞƌ͕ĂŶĚϳ͘ϱйŵĞƚŚĂŶŽů͘WƌĞĐŝƉĂƚŚ;ƐƚĂŶĚĂƌĚŝnjĞĚƐĞƌƵŵ͖ZŽĐŚĞŝĂŐŶŽƐƟĐƐͿǁĂƐƵƐĞĚĂƐĂŶŝŶƚĞƌŶĂůƐƚĂŶĚĂƌĚ͘ďƐŽƌďĂŶĐĞ

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Cell culture

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5

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ŵĞƚŚŽĚ͘ ZE ǁĂƐ ƌĞǀĞƌƐĞ ƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚ ƵƐŝŶŐ ŚŝŐŚͲĐĂƉĂĐŝƚLJ ZE ƚŽ ĐE Zd ŬŝƚƐ ;>ŝĨĞ ƚĞĐŚŶŽůŽŐŝĞƐͿ ĂŶĚ ƵƐĞĚ ĨŽƌ ƋƵĂŶƟƚĂƟǀĞ

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ŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŋƵdžĂƐƐĂLJ

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ŵĞĚŝƵŵǁĂƐĐŚĂŶŐĞĚǁŝƚŚDDĐŽŶƚĂŝŶŝŶŐϭϬй^ĂŶĚϭʅŝͬŵ>^ϯ,ͲĐŚŽůĞƐƚĞƌŽů;ůŽĂĚŝŶŐŵĞĚŝƵŵͿƚŽǁŚŝĐŚĞŝƚŚĞƌ'^KͲĐŽŶƚƌŽů

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ĐŽƌƌĞĐƚĞĚĨŽƌŶŽŶͲƐƉĞĐŝĮĐĞŋƵdžƚŽĐŽŶƚƌŽůŵĞĚŝƵŵ͘

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ϭϰϰ

Results

In vivo ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱĂŌĞƌ'^KƚƌĞĂƚŵĞŶƚŝŶƚŚĞĐƵīŵŽĚĞů

džƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĞƌĞŵĞĂƐƵƌĞĚŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂů

ĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨǁŝůĚƚLJƉĞϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞĂŶĚƚŚĞĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨƉŽ

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ŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĂƐĂůƐŽŵĞĂƐƵƌĞĚŝŶƚŚĞĂŽƌƚĂŽĨƉŽ

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ŽĨǁŝůĚƚLJƉĞŵŝĐĞ͕ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĂƐŚŝŐŚĞƐƚ͕ĨŽůůŽǁĞĚďLJŵŝZͲϰϵϰĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

;&ŝŐƵƌĞϭ;ĂďƐŽůƵƚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿĂŶĚ&ŝŐƵƌĞϭ͕ůĞŌƉĂŶĞů;ƌĞůĂƟǀĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿͿ͘ƐǁĞŚĂǀĞƉƌĞǀŝŽƵƐůLJ

ĞƐƚĂďůŝƐŚĞĚ͕ƚŚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱǁĂƐŚŝŐŚĞƐƚŝŶƚŚĞĂŽƌƚĂŽĨƉŽ

ŵŝĐĞ;&ŝŐƵƌĞϭ;ĂďƐŽůƵƚĞ

ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿĂŶĚ&ŝŐƵƌĞϭ͕ŵŝĚĚůĞƉĂŶĞů;ƌĞůĂƟǀĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿͿ͕ǁŚĞƌĞĂƐŝŶƚŚĞĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨƚŚĞƐĞ

ĂŶŝŵĂůƐ͕ďŽƚŚŵŝZͲϰϵϱĂŶĚŵŝZͲϰϵϰǁĞƌĞŚŝŐŚůLJĞdžƉƌĞƐƐĞĚ;&ŝŐƵƌĞϭ;ĂďƐŽůƵƚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿĂŶĚ&ŝŐƵƌĞ

ϭ͕ƌŝŐŚƚƉĂŶĞů;ƌĞůĂƟǀĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿͿ

.

EĞdžƚ͕ǁĞŵĞĂƐƵƌĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƚŚĞƐĞŵŝĐƌŽZEƐĂŌĞƌ'^KƚƌĞĂƚŵĞŶƚŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĐƵīŵŽĚĞů͘

džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĂƐŵĞĂƐƵƌĞĚĂƚĂƐŝŶŐůĞƟŵĞƉŽŝŶƚŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ

ŽĨŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ͕ϯĚĂLJƐĂŌĞƌĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚ͕ϰĚĂLJƐĂŌĞƌ'^KŝŶũĞĐƟŽŶ͘DŝZͲϯϮϵǁĂƐƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJ

ĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƚĞĚďLJϱϮйŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚ

ĂŶŝŵĂůƐ͘ůƚŚŽƵŐŚŶŽƚƐƚĂƟƐƟĐĂůůLJƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚĂƚƚŚŝƐƐƉĞĐŝĮĐƟŵĞƉŽŝŶƚ͕ŵŝĐƌŽZEŝŶŚŝďŝƟŽŶŝƐĂƟŵĞͲ ĚĞƉĞŶĚĞŶƚƉƌŽĐĞƐƐ

ĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĂƐĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƚĞĚďLJϯϰйŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ

;ƉсϬ͘ϮϮͿ͘ &Žƌ ŵŝZͲϰϵϰ͕ ǁĞ ĐŽƵůĚ ŶŽƚ ŽďƐĞƌǀĞ ĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƟŽŶ Ăƚ ƚŚŝƐ ƐƉĞĐŝĮĐ ƟŵĞƉŽŝŶƚ ;&ŝŐƵƌĞ ϭ

;ĂďƐŽůƵƚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿĂŶĚϭ;ƌĞůĂƟǀĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶͿͿ͘

hƉƚĂŬĞŽĨ'^KƐĂƚƐŝƚĞŽĨĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚ

dŽǀŝƐƵĂůŝnjĞƵƉƚĂŬĞŽĨ'^KƐŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͕ϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞǁĞƌĞŝŶũĞĐƚĞĚǁŝƚŚĞŝƚŚĞƌ/ZLJĞͲ ϴϬϬtͲůĂďĞůůĞĚ'^KͲϯϮϵ͕Žƌ/ZLJĞͲϴϬϬtͲƵŶůĂďĞůůĞĚĐŽŶƚƌŽů͕ŽŶĞĚĂLJƉƌŝŽƌƚŽĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚ͘Ɛ

ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵǁĂƐŚŝŐŚĞƐƚŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͕ǁĞŝŶũĞĐƚĞĚŵŝĐĞǁŝƚŚ/ZLJĞϴϬϬtͲůĂďĞůůĞĚ

'^KͲϯϮϵ͘^ŝŶĐĞƚŚĞ'^KĐŚĞŵŝƐƚƌLJŝƐĐŽŵƉĂƌĂďůĞĨŽƌ'^KͲϯϮϵ͕'^KͲϰϵϰĂŶĚ'^KͲϰϵϱ͕ǁĞĂƐƐƵŵĞ

ƐŝŵŝůĂƌƵƉƚĂŬĞŽĨƚŚĞŽƚŚĞƌ'^KƐ͘hƉƚĂŬĞŽĨůĂďĞůůĞĚ'^KͲϯϮϵǁĂƐŽďƐĞƌǀĞĚŝŶďŽƚŚĐƵīĞĚ;ůĞŌͿĂŶĚ

ŶŽŶͲĐƵīĞĚ;ƌŝŐŚƚͿĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͕ǁŚĞƌĞĂƐŵŝŶŝŵĂůƵƉƚĂŬĞǁĂƐĚĞƚĞĐƚĞĚŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨ

ŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ/ZLJĞͲϴϬϬtĐŽŶƚƌŽů;&ŝŐƵƌĞϭͿ͘dŚĞƐĞĚĂƚĂĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞĞīĞĐƟǀĞƵƉƚĂŬĞŽĨ'^KƐ

ŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͘WƌĞǀŝŽƵƐůLJ͕ǁĞŚĂǀĞƐŚŽǁŶƚŚĂƚ'^KƐĂƌĞĂůƐŽƚĂŬĞŶƵƉƐƉĞĐŝĮĐĂůůLJŝŶƚŚĞ

ĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨƉŽ

ŵŝĐĞ͕ϰĚĂLJƐĂŶĚϮϴĚĂLJƐĂŌĞƌĐŽůůĂƌƉůĂĐĞŵĞŶƚ

.

5

&ŝŐƵƌĞϭ͘džƉƌĞƐƐŝŽŶĂŶĚŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱ͘;ͿŶĞƐƟŵĂƟŽŶŽĨĂďƐŽůƵƚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

;ц^DͿŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJŽĨϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ;ŶсϯƉŽŽůĞĚƐĂŵƉůĞƐ͕ϯĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐǁĞƌĞ

ƉŽŽůĞĚĨŽƌϭƐĂŵƉůĞͿ͕ĂŶĚŝŶƚŚĞĂŽƌƚĂ;ŶсϲͿĂŶĚĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌLJ;ŶсϰƉŽŽůĞĚƐĂŵƉůĞƐ͕ϯĐĂƌŽƟĚƐǁĞƌĞƉŽŽůĞĚĨŽƌϭƐĂŵƉůĞͿŽĨƉŽ^Ͳ

ͬͲŵŝĐĞ͘;ͿZĞůĂƟǀĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐ;ц^DͿŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJŽĨϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞĂŶĚƚŚĞ

ĂŽƌƚĂĂŶĚĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌLJŽĨƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞ;ĚĂƚĂŽŶŵŝĐƌŽZEĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŝŶƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞǁĂƐĂĚĂƉƚĞĚǁŝƚŚƉĞƌŵŝƐƐŝŽŶĨƌŽŵtĞnjĞů

et.al^ϱ͘Ϳ͘͘;ͿďƐŽůƵƚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ;ц^DͿŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͕ϰĚĂLJƐĂŌĞƌ'^KƚƌĞĂƚŵĞŶƚ

;ŶсϯƉŽŽůĞĚƐĂŵƉůĞƐ͕ϯĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐǁĞƌĞƉŽŽůĞĚĨŽƌϭƐĂŵƉůĞͿ͘;ͿDĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐ͕ƌĞůĂƟǀĞƚŽhϲ͕ŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰ

ĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞϰĚĂLJƐĂŌĞƌ'^KƚƌĞĂƚŵĞŶƚ;ц^DͿ͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘;ͿhƉƚĂŬĞŽĨ/ZLJĞͲϴϬϬtͲ ůĂďĞůůĞĚ'^KͲϯϮϵŝŶƚŚĞĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͘/ŶĞĂĐŚŵŝĐƌŽŐƌĂƉŚƚŚĞĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ;ĐƵīƌĞŵŽǀĞĚ͖ůĞŌͿĂŶĚĐŽŶƚƌĂͲůĂƚĞƌĂů

ŶŽŶͲĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ;ƌŝŐŚƚͿĂƌĞĚŝƐƉůĂLJĞĚ͘hƉƉĞƌƉĂŶĞůƐƐŚŽǁĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨ/ZLJĞͲϴϬϬtͲƵŶůĂďĞůůĞĚĐŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚ

ĂŶŝŵĂůƐĂŶĚůŽǁĞƌƉĂŶĞůƐĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐŽĨ/ZLJĞͲϴϬϬtͲůĂďĞůůĞĚ'^KͲϯϮϵƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͕ϮϰŚŽƵƌƐĂŌĞƌĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚĂŶĚϰϴ

ŚŽƵƌƐĂŌĞƌ'^KͲŝŶũĞĐƟŽŶ͘ŽůŽƵƌŝŵĂŐĞƐĂƌĞƐŚŽǁŶŽŶƚŚĞůĞŌ͕ŶĞĂƌͲŝŶĨƌĂƌĞĚ;E/ZͿŝŵĂŐĞƐŝŶƚŚĞŵŝĚĚůĞĂŶĚĂŶŽǀĞƌůĂLJŽĨĐŽůŽƵƌ

ĂŶĚE/ZŝŵĂŐĞƐŝƐƐŚŽǁŶŽŶƚŚĞƌŝŐŚƚ͘

ϭϰϲ

īĞĐƚƐŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ

ƚ Ϯϭ ĚĂLJƐ ĂŌĞƌ ĐƵī ƉůĂĐĞŵĞŶƚ͕ ŝŶƟŵĂů ŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ ǁĂƐ ƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJ ƌĞĚƵĐĞĚ ďLJ ϯϯй ĨŽůůŽǁŝŶŐ

ƚƌĞĂƚŵĞŶƚǁŝƚŚ'^KͲϰϵϱĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘ůƚŚŽƵŐŚŶŽƚƐƚĂƟƐƟĐĂůůLJƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ͕ƚƌĞĂƚŵĞŶƚ

ǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵĂůƐŽĚĞĐƌĞĂƐĞĚŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂďLJϮϰй;ƉсϬ͘ϬϵͿ͕ǁŚĞƌĞĂƐ'^KͲϰϵϰƚƌĞĂƚŵĞŶƚŚĂĚ

ŶŽĞīĞĐƚŽŶŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ;&ŝŐƵƌĞϮĂŶĚƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŝŶ&ŝŐƵƌĞϮͿ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕Ă

ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ŝŶƟŵĂͬŵĞĚŝĂ ƌĂƟŽ ǁĂƐ ŽďƐĞƌǀĞĚ ĨŽůůŽǁŝŶŐ '^KͲϰϵϱ ƚƌĞĂƚŵĞŶƚ ;ϯϱй ƌĞĚƵĐƟŽŶͿ͘ dŚŝƐ

ƌĂƟŽ ǁĂƐ ŶŽƚ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ŝŶ '^KͲϯϮϵ ĂŶĚ '^KͲϰϵϰ ƚƌĞĂƚĞĚ ĂŶŝŵĂůƐ ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů &ŝŐƵƌĞ ϭͿ͘ EŽ

ĚŝīĞƌĞŶĐĞƐ ǁĞƌĞ ĨŽƵŶĚ ƌĞŐĂƌĚŝŶŐ ůƵŵŝŶĂů ĂƌĞĂ ĂŶĚ ůƵŵĞŶƐƚĞŶŽƐŝƐ ĨŽůůŽǁŝŶŐ '^KͲϰϵϰ Žƌ '^KͲϰϵϱ

ƚƌĞĂƚŵĞŶƚ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϭĂŶĚϭͿ͘'^KͲϯϮϵƚƌĞĂƚŵĞŶƚƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJŝŶĐƌĞĂƐĞĚůƵŵŝŶĂůĂƌĞĂ

ĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞĚůƵŵĞŶƐƚĞŶŽƐŝƐŝŶƚŚĞƐĞĂŶŝŵĂůƐ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϭĂŶĚϭͿ͘dŚĞƐĞĚĂƚĂƐŚŽǁĂ

ďĞŶĞĮĐŝĂůĞīĞĐƚŽĨ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚŵĞŶƚŽŶŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ͘

&ŝŐƵƌĞϮ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱƌĞĚƵĐĞƐŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͘;ͿYƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂϮϭĚĂLJƐĂŌĞƌ

ĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ;ŶсϭϬƉĞƌŐƌŽƵƉͿƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐ;ц^DͿ͘ΎƉфϬ͘ϬϱĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘;ͿZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ

ŝŵĂŐĞƐŽĨĞůĂƐƟŶƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͕ĚĂƐŚĞĚůŝŶĞƌĞƉƌĞƐĞŶƚƐůĂŵŝŶĂĞůĂƐƟĐŝŶƚĞƌŶĂ;ƐĐĂůĞďĂƌсϱϬʅŵͿ͘

5

&ŝŐƵƌĞϯ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱƌĞĚƵĐĞƐǀĂƐĐƵůĂƌƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͘YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨŝŶƟŵĂů;Ϳ

ĂŶĚŵĞĚŝĂů;ͿƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůĂƌĞĂ;йͿϮϭĚĂLJƐĂŌĞƌĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ;ŶсϭϬƉĞƌŐƌŽƵƉͿƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐ

;ц^DͿ͘;ͿZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŽĨ^DƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ;ƐĐĂůĞďĂƌсϱϬʅŵͿ͘YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨŝŶƟŵĂů;ͿĂŶĚ

ŵĞĚŝĂů;ͿƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶϮϭĚĂLJƐĂŌĞƌĐƵīƉůĂĐĞŵĞŶƚŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ;ŶсϭϬƉĞƌŐƌŽƵƉͿƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϰϵϱ

;ц^DͿ͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘;&ͿZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŽĨ<ŝϲϳͬ^DƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͕ĂƌƌŽǁƐŝŶĚŝĐĂƚĞ<ŝϲϳͬ^DƉŽƐŝƟǀĞ

ĐĞůůƐ͕ĚĂƐŚĞĚůŝŶĞƐŝŶĚŝĐĂƚĞƚŚĞĞůĂƐƟĐůĂŵŝŶĂĞ;ƐĐĂůĞďĂƌсϱϬʅŵͿ͘EƵĐůĞŝĂƌĞƐŚŽǁŶŝŶďůƵĞ͕^DƐƚĂŝŶŝŶŐŝŶŐƌĞĞŶĂŶĚ<ŝϲϳŝŶƌĞĚ͘

īĞĐƚƐŽĨŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶǀĞƐƐĞůǁĂůůĐŽŵƉŽƐŝƟŽŶŝŶϱϳ>ͬϲ:ŵŝĐĞ dŽ ĂƐƐĞƐƐ ƚŚĞ ĞīĞĐƚ ŽĨ ŵŝĐƌŽZE ŝŶŚŝďŝƟŽŶ ŽŶ ǀĞƐƐĞů ǁĂůů ĐŽŵƉŽƐŝƟŽŶ ĨŽůůŽǁŝŶŐ ĐƵī ƉůĂĐĞŵĞŶƚ͕

ǁĞ;ŝŵŵƵŶŽͲͿƐƚĂŝŶĞĚƐĞƌŝĂůƐĞĐƟŽŶƐǁŝƚŚ^D͕DĂĐͲϯŽƌ^ŝƌŝƵƐƌĞĚ͘EŽĚŝīĞƌĞŶĐĞƐǁĞƌĞŽďƐĞƌǀĞĚ

ƌĞŐĂƌĚŝŶŐ^DĐŽŶƚĞŶƚŝŶƚŚĞŝŶƟŵĂĂŶĚŵĞĚŝĂŽĨ'^KƚƌĞĂƚĞĚŐƌŽƵƉƐ;&ŝŐƵƌĞϯĂŶĚϯ͕ƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ

ŝŵĂŐĞƐŝŶ&ŝŐƵƌĞϯͿ͘^ŝŶĐĞ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚŵĞŶƚƌĞĚƵĐĞĚŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂ͕ǁĞĞdžĂŵŝŶĞĚƚŚĞŶƵŵďĞƌ

ŽĨƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŶŐ^DƐŝŶƚŚŝƐŐƌŽƵƉďLJƐƚĂŝŶŝŶŐĨŽƌ<ŝϲϳĂŶĚ^DĂŶĚĐŽŵƉĂƌĞĚƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨĚŽƵďůĞ

ƉŽƐŝƟǀĞĐĞůůƐ;<ŝϲϳ

ͬ^D

ĐĞůůƐͿŝŶ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐǁŝƚŚ'^KͲĐŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ;&ŝŐƵƌĞ

ϯĂŶĚϯͿ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱƌĞĚƵĐĞĚƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŶŐ^DƐďLJϰϳйŝŶƚŚĞŵĞĚŝĂŽĨ

ƚŚĞƐĞĂŶŝŵĂůƐ͕ďƵƚŶŽƚŝŶƚŚĞŝŶƟŵĂ;&ŝŐƵƌĞϯĂŶĚϯ͕ƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŝŶ&ŝŐƵƌĞϯ&Ϳ

ϭϰϴ

&ŽůůŽǁŝŶŐ'^KͲϰϵϰĂŶĚ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚŵĞŶƚ͕ŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞŝŶŇƵdžǁĂƐƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJƌĞĚƵĐĞĚďLJϯϱйĂŶĚ

ϳϴйƌĞƐƉĞĐƟǀĞůLJŝŶƚŚĞŝŶƟŵĂůĂƌĞĂĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽů;&ŝŐƵƌĞϰͿ͘DĂĐƌŽƉŚĂŐĞŝŶŇƵdžŝŶƚŚĞ

ŵĞĚŝĂůĂƌĞĂǁĂƐƌĞĚƵĐĞĚ͕ĂůƚŚŽƵŐŚŶŽƚƐƚĂƟƐƟĐĂůůLJƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ͕ďLJϯϱйĨŽůůŽǁŝŶŐ'^KͲϰϵϰ;ƉсϬ͘ϭϯͿ

ƚƌĞĂƚŵĞŶƚĂŶĚďLJϮϳйĨŽůůŽǁŝŶŐ'^KͲϰϵϱ;ƉсϬ͘ϮϯͿƚƌĞĂƚŵĞŶƚ;&ŝŐƵƌĞϰ͕ƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŝŶ

&ŝŐƵƌĞϰͿ͘DŝĐƌŽZEŝŶŚŝďŝƟŽŶĚŝĚŶŽƚĂůƚĞƌĐŽůůĂŐĞŶĐŽŶƚĞŶƚŝŶĞŝƚŚĞƌƚŚĞŝŶƟŵĂŽƌƚŚĞŵĞĚŝĂŽĨ'^K

ƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϮĂŶĚϮ͕ƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŝŶ^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϮͿ͘

&ŝŐƵƌĞ ϰ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZE ŵŝZͲϰϵϱ ƌĞĚƵĐĞƐ ŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞ ŝŶŇƵdž͘ YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶ ŽĨ ŝŶƟŵĂů ;Ϳ ĂŶĚ ŵĞĚŝĂů ;Ϳ

ŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞ ŝŶŇƵdž ;йͿ Ϯϭ ĚĂLJƐ ĂŌĞƌ ĐƵī ƉůĂĐĞŵĞŶƚ ŝŶ ϱϳ>ͬϲ: ŵŝĐĞ ;ŶсϭϬ ƉĞƌ ŐƌŽƵƉͿ ƚƌĞĂƚĞĚ ǁŝƚŚ '^KƐ ;ц^DͿ͘ ΎƉфϬ͘Ϭϱ͕

ΎΎƉфϬ͘ϬϭĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘;ͿZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŽĨDĂĐϯƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨĐƵīĞĚĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ;ƐĐĂůĞďĂƌсϱϬʅŵͿ͘

īĞĐƚƐŽĨŵŝZͲϰϵϱĂŶĚŵŝZͲϯϮϵŝŶŚŝďŝƟŽŶŝŶƚŚĞĐĂƌŽƟĚĐŽůůĂƌŵŽƵƐĞŵŽĚĞůŝŶƉŽ

mice EĞdžƚ͕ǁĞĂƐƐĞƐƐĞĚƚŚĞĞīĞĐƚƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶ ŽŶĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ

ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐ ƉůĂƋƵĞ ĨŽƌŵĂƟŽŶ͘ ƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐ ƉůĂƋƵĞ ƐŝnjĞƐ ǁĞƌĞ ƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ǁŝƚŚ

ϱϯй ŝŶ '^KͲϰϵϱ ƚƌĞĂƚĞĚ ĂŶŝŵĂůƐ ;&ŝŐƵƌĞ ϱ ĂŶĚ ƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ ŝŵĂŐĞƐ ŝŶ &ŝŐƵƌĞ ϱͿ͘ /Ŷ '^KͲϯϮϵ

ƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͕ĂƚƌĞŶĚƚŽǁĂƌĚƐĂϰϯйĚĞĐƌĞĂƐĞŝŶĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƟĐƉůĂƋƵĞƐŝnjĞĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲ ĐŽŶƚƌŽůĂŶŝŵĂůƐ;ƉсϬ͘Ϭϵ͕&ŝŐƵƌĞϱ͕ƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐ&ŝŐƵƌĞϱͿǁĂƐŽďƐĞƌǀĞĚ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶƚŽƚŚĞ

ĚĞĐƌĞĂƐĞĚƉůĂƋƵĞƐŝnjĞ͕ĐŽŵƉŽƐŝƟŽŶŽĨƚŚĞůĞƐŝŽŶƐǁĂƐĂůƐŽĂīĞĐƚĞĚďLJ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚŵĞŶƚ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶ

ŽĨŵŝZͲϰϵϱƌĞƐƵůƚĞĚŝŶƐŵĂůůĞƌŶĞĐƌŽƟĐĐŽƌĞƐŝnjĞƐ;ϲϬйƌĞĚƵĐƟŽŶͿ͕ǁŚĞƌĞĂƐŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϯϮϵŚĂĚ

ŶŽƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚĞīĞĐƚƐŽŶŶĞĐƌŽƟĐĐŽƌĞƐŝnjĞ;&ŝŐƵƌĞϲͿ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕ƚŚĞƉĞƌĐĞŶƚĂŐĞŽĨŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞ

ĐŽŶƚĞŶƚ ŝŶ ƚŚĞ ůĞƐŝŽŶƐ ǁĂƐ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ďLJ ϯϬй ŝŶ '^KͲϰϵϱ ƚƌĞĂƚĞĚ ĂŶŝŵĂůƐ ;&ŝŐƵƌĞ ϲͿ͕ ďƵƚ ŶŽƚ ŝŶ

'^KͲϯϮϵƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͘EŽĚŝīĞƌĞŶĐĞǁĂƐŽďƐĞƌǀĞĚŝŶƚŚĞƉĞƌĐĞŶƚĂŐĞŽĨ^DƉŽƐŝƟǀĞůĞƐŝŽŶĂƌĞĂ

ďĞƚǁĞĞŶŐƌŽƵƉƐ;&ŝŐƵƌĞϲͿ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱ͕ďƵƚŶŽƚŵŝZͲϯϮϵ͕ŝŶĐƌĞĂƐĞĚĐŽůůĂŐĞŶĐŽŶƚĞŶƚďLJ

ϭϯϵй;&ŝŐƵƌĞϲͿ͕ĨƵƌƚŚĞƌŝŶĐƌĞĂƐŝŶŐƉůĂƋƵĞƐƚĂďŝůŝƚLJ͘

WůĂƐŵĂĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůůĞǀĞůƐŝŶ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐǁĞƌĞƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJĚĞĐƌĞĂƐĞĚǁŝƚŚϭϯй;&ŝŐƵƌĞ

ϱͿ͘>ŝƉŝĚƉƌŽĮůŝŶŐƵƐŝŶŐ<dͲ&W>ƌĞǀĞĂůĞĚĂƌĞĚƵĐƟŽŶŝŶƚŚĞs>>ĨƌĂĐƟŽŶĂŌĞƌƚƌĞĂƚŵĞŶƚǁŝƚŚŵŝZͲ

ϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶ;&ŝŐƵƌĞϱͿ͘dŚŝƐƌĞĚƵĐƟŽŶŝŶƉůĂƐŵĂĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĂŶĚs>>ůĞǀĞůƐǁĂƐŶŽƚŽďƐĞƌǀĞĚŝŶ

5

ĂŶŝŵĂůƐƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲϯϮϵ;&ŝŐƵƌĞϱĂŶĚϱͿ͘/ŶŽƌĚĞƌƚŽĞůƵĐŝĚĂƚĞƚŚĞŵĞĐŚĂŶŝƐŵďĞŚŝŶĚƚŚĞs>>

ƌĞĚƵĐƟŽŶŝŶ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͕ǁĞŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚƚŚĞin vitroĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŋƵdžŝŶŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐ͘

tĞĨŽƵŶĚƚŚĂƚƚƌĞĂƚŵĞŶƚŽĨŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐǁŝƚŚ'^KͲϰϵϱƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJŝŶĐƌĞĂƐĞĚĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŋƵdžin vitroďLJϵϲй;&ŝŐƵƌĞϱͿ͘

&ŝŐƵƌĞϱ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱƌĞĚƵĐĞƐƉůĂƋƵĞƐŝnjĞĂŶĚĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůůĞǀĞůƐ͘;ͿYƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƉůĂƋƵĞƐŝnjĞϮϴ

ĚĂLJƐĂŌĞƌĐŽůůĂƌƉůĂĐĞŵĞŶƚŝŶƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞ;ŶсϭϱƉĞƌŐƌŽƵƉͿƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͕'^KͲϯϮϵŽƌ'^KͲϰϵϱ͘ΎƉфϬ͘ϬϱĐŽŵƉĂƌĞĚ

ƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘;ͿZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŽĨ,W^ƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐ;ƐĐĂůĞďĂƌсϭϬϬʅŵͿ͘;ͿdŽƚĂůĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůůĞǀĞůƐŽĨ

ƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲĐŽŶƚƌŽů͕'^KͲϯϮϵŽƌ'^KͲϰϵϱ͕ϲǁĞĞŬƐĂŌĞƌƐƚĂƌƚŽĨƚŚĞǁĞƐƚĞƌŶƚLJƉĞĚŝĞƚ͘ΎƉфϬ͘ϬϱĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ

'^KͲĐŽŶƚƌŽů͘;ͿŚŽůĞƐƚĞƌŽůƉƌŽĮůĞŽĨ'^KƚƌĞĂƚĞĚƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞ;ŶсϱƉŽŽůĞĚƐĂŵƉůĞƐƉĞƌŐƌŽƵƉ͕ƉůĂƐŵĂƐĂŵƉůĞƐŽĨϯĂŶŝŵĂůƐǁĞƌĞ

ƉŽŽůĞĚƉĞƌƐĂŵƉůĞͿĂŶĂůLJƐĞĚƵƐŝŶŐ<dͲ&W>͘;ͿYƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůĞŋƵdž;йͿĨƌŽŵŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲ ĐŽŶƚƌŽůŽƌ'^KͲϰϵϱ͘ΎΎƉфϬ͘Ϭϭ͘

ϭϱϬ

&ŝŐƵƌĞϲ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱŝŶĐƌĞĂƐĞƐƉůĂƋƵĞƐƚĂďŝůŝƚLJϮϴĚĂLJƐĂŌĞƌĐŽůůĂƌƉůĂĐĞŵĞŶƚŝŶƉŽ^-/- mice.

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DĂĐϯƐƚĂŝŶŝŶŐ͕;Ϳ^DƐƚĂŝŶŝŶŐĂŶĚ;Ϳ^ŝƌŝƵƐƌĞĚƐƚĂŝŶŝŶŐĂƌĞƐŚŽǁŶ;ŶсϭϱŵŝĐĞƉĞƌŐƌŽƵƉ͕ƐĐĂůĞďĂƌсϭϬϬʅŵͿ͘

dĂƌŐĞƚŐĞŶĞƌĞŐƵůĂƟŽŶĂŌĞƌŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶ

tĞŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚƚŚĞĞīĞĐƚƐŽĨŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƌĞŐƵůĂƟŽŶ͘tĞŵĂĚĞĂƐĞůĞĐƟŽŶŽĨ

ƉƵƚĂƟǀĞƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ͕ƚŚĂƚŚĂǀĞƉƌĞĚŝĐƚĞĚďŝŶĚŝŶŐƐŝƚĞƐĨŽƌŵŝZͲϰϵϱŝŶƚŚĞŝƌϯ͛hdZ͘dƌĞĂƚŵĞŶƚǁŝƚŚ

'^KͲϰϵϱ ŝŶ ƚŚĞ ĐŽůůĂƌ ŵŽĚĞů ƌĞƐƵůƚĞĚ ŝŶ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ ŵŝZͲϰϵϱ  ŝŶ ƚŚĞ ĐĂƌŽƟĚƐ͕ ϯ ĚĂLJƐ

ĂŌĞƌ'^KŝŶũĞĐƟŽŶ;ϮϯйĚĞĐƌĞĂƐĞĚ͕ƉсϬ͘Ϯϱ͕&ŝŐƵƌĞϳͿ͘ůƚŚŽƵŐŚin vivo ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱǁĂƐŶŽƚ

ƐƚĂƟƐƟĐĂůůLJ ƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ Ăƚ ƚŚŝƐ ƐƉĞĐŝĮĐ ƟŵĞƉŽŝŶƚ͕ ǁĞ ĐŽƵůĚ ŽďƐĞƌǀĞ ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ŵŝZͲϰϵϱ ƚĂƌŐĞƚ

ŐĞŶĞƐdŐĨɴϮĂŶĚ/ůϭϯƌĂϭŝŶƚŚĞĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐ;&ŝŐƵƌĞϳͿ͘&ƵƌƚŚĞƌŵŽƌĞ͕ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐ

Đǀƌϭ;ƉсϬ͘ϬϳͿŝŶƚŚĞĐĂƌŽƟĚƐĂŶĚ/ůϭϬ;ƉсϬ͘ϬϱͿŝŶƚŚĞƐƉůĞĞŶǁĞƌĞƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚŝŶ'^KͲϰϵϱƚƌĞĂƚĞĚ

ĂŶŝŵĂůƐ;&ŝŐƵƌĞϳͿ͘/ŶĂĚĚŝƟŽŶ͕ǁĞĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚƚŚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨŵƵůƟƉůĞĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůŵĞƚĂďŽůŝƐŵ

ƌĞůĂƚĞĚƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐŽĨŵŝZͲϰϵϱŝŶƚŚĞůŝǀĞƌďƵƚŶŽĚŝīĞƌĞŶĐĞƐǁĞƌĞŽďƐĞƌǀĞĚŝŶƚŚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨ>ƌƉϲ͕

DƩƉ͕>ĚůƌĂŶĚďĐĂϭ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐƵƌĞϯͿ͘

dŽŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞƚŚĞĞīĞĐƚƐŽĨŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶǀĂƌŝŽƵƐŝŶĚŝǀŝĚƵĂůĐĞůůƚLJƉĞƐŝŶǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐ͕

,ϱsĞŶĚŽƚŚĞůŝĂůĐĞůůƐ͕ǀ^DƐ͕ϯdϯĮďƌŽďůĂƐƚƐĂŶĚDDƐǁĞƌĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐĂŐĂŝŶƐƚŵŝZͲϰϵϱ͘

DƵůƟƉůĞƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐǁŝƚŚƉƌĞĚŝĐƚĞĚďŝŶĚŝŶŐƐŝƚĞƐĨŽƌŵŝZͲϰϵϱǁĞƌĞĞdžĂŵŝŶĞĚ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐĐLJƚŽŬŝŶĞƐ͕

5

ĐŽŵƉůĞŵĞŶƚ ĐŽŵƉŽŶĞŶƚƐ͕ ůŝƉŝĚͲƌĞůĂƚĞĚ ƚĂƌŐĞƚ ŐĞŶĞƐ ĂŶĚ ƟƐƐƵĞ ŝŶŚŝďŝƚŽƌƐ ŽĨ ŵĞƚĂůůŽƉƌŽƚĞŝŶĂƐĞƐ

;d/DWƐͿ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱůĞĚƚŽƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨdůƌϳŝŶ,ϱsĐĞůůƐĂŶĚǀ^DƐ;ƉсϬ͘ϬϱͿ͕ǁŚĞƌĞĂƐ

ƚŚĞĂŶƟͲŝŶŇĂŵŵĂƚŽƌLJ/ůϭϬǁĂƐƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚŝŶϯdϯĐĞůůƐ;ƉсϬ͘ϬϲͿĂŶĚ,ϱsĐĞůůƐ;ƉсϬ͘ϭϭͿ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů

&ŝŐƵƌĞϰͿ͘KƚŚĞƌŐĞŶĞƐƚŚĂƚǁĞƌĞƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚĂŌĞƌŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶŝŶĐůƵĚĞĚĚŬŶďϭ;ƉсϬ͘ϬϵͿŝŶϯdϯ

ĐĞůůƐ͕Ěϱϵ;ƉсϬ͘ϬϴͿĂŶĚĐƌϮ;ƉсϬ͘ϬϲͿŝŶDDƐ͘

Figure 7. In vivo ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϱŝŶĐƌĞĂƐĞƐƉƵƚĂƟǀĞƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ͘;ͿDĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨŵŝZͲϰϵϱŝŶĐĂƌŽƟĚ

ĂƌƚĞƌŝĞƐ͕ƌĞůĂƟǀĞƚŽůĞƚϳĐ͕ĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞϯĚĂLJƐĂŌĞƌ'^KƚƌĞĂƚŵĞŶƚŝŶƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞ;ŶсϰƉŽŽůĞĚƐĂŵƉůĞƐƉĞƌŐƌŽƵƉ͕ϯĐĂƌŽƟĚƐǁĞƌĞ

ƉŽŽůĞĚƉĞƌƐĂŵƉůĞͿ͘;ͿDĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐŽĨƉƵƚĂƟǀĞŵŝZͲϰϵϱƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐdŐĨɴϮ͕/ůϭϯƌĂϭĂŶĚĐǀƌϭŝŶĐĂƌŽƟĚƐ;ŶсϱƐĂŵƉůĞƐ

ƉĞƌŐƌŽƵƉ͖ϯĐĂƌŽƟĚƐǁĞƌĞƉŽŽůĞĚƉĞƌƐĂŵƉůĞͿ͕ĂŶĚ/ůϭϬŝŶƐƉůĞĞŶ;ŶсϱƉĞƌŐƌŽƵƉͿ͕ƌĞůĂƟǀĞƚŽ,ƉƌƚĂŶĚZƉůϮϳ͕ĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞϯĚĂLJƐ

ĂŌĞƌ'^KƚƌĞĂƚŵĞŶƚŝŶƉŽ^ͲͬͲŵŝĐĞ͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘

ϭϱϮ

Discussion

,ĞƌĞ͕ ǁĞ ŚLJƉŽƚŚĞƐŝnjĞĚ ƚŚĂƚ ŝŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ǁŽƵůĚ ƌĞĚƵĐĞ ƌĞƐƚĞŶŽƐŝƐ ƚŚƌŽƵŐŚ

ĚĞĐƌĞĂƐĞĚŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞĚĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͘tĞƐŚŽǁƚŚĂƚŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨ

ŵŝZͲϰϵϱůĞĂĚƐƚŽůĞƐƐŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂĨŽůůŽǁŝŶŐǀĂƐĐƵůĂƌŝŶũƵƌLJĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞĚƉůĂƋƵĞĨŽƌŵĂƟŽŶ

ŝŶ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ ƉƌŽŶĞ ŵŝĐĞ͕ ǁŚŝůƐƚ ŝŶĐƌĞĂƐŝŶŐ ƉůĂƋƵĞ ƐƚĂďŝůŝƚLJ ŝŶ ƚŚĞƐĞ ĂŶŝŵĂůƐ͘ /Ŷ ĂĚĚŝƟŽŶ͕ ǁĞ

ŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚƚŚĞĞīĞĐƚƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϱŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶƐĞĐŽŶĚĂƌLJŽƵƚĐŽŵĞƐƐƵĐŚĂƐƚĂƌŐĞƚ

ŐĞŶĞƌĞŐƵůĂƟŽŶ͕ƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͕ƉůĂƋƵĞƐƚĂďŝůŝƚLJĂŶĚĐŚŽůĞƐƚĞƌŽůŚŽŵĞŽƐƚĂƐŝƐ͘dŚĞ

ϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌŝƐƚŚĞůĂƌŐĞƐƚŬŶŽǁŶŵĂŵŵĂůŝĂŶŵŝĐƌŽZEŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌƚŽĚĂƚĞĂŶĚ

ŵĂŶLJϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŚĂǀĞďĞĞŶŝŵƉůŝĐĂƚĞĚǁŝƚŚŝŶŚƵŵĂŶĚŝƐĞĂƐĞ

͘ZĞĐĞŶƚůLJ͕ǁĞŚĂǀĞƌĞƉŽƌƚĞĚ

ƚŚĞƌŽůĞŽĨŵƵůƟƉůĞŵŝĐƌŽZEƐĨƌŽŵƚŚŝƐĐůƵƐƚĞƌŝŶƐĞǀĞƌĂůĂƐƉĞĐƚƐŽĨǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐ͕ŝŶĐůƵĚŝŶŐ

ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͕ĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŶĚĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ

.

DŝĐƌŽZEƐ ĂƌĞ ŬŶŽǁŶ ĨŽƌ ƚŚĞŝƌ ĂďŝůŝƚLJ ƚŽ ƌĞŐƵůĂƚĞ ƚŚĞ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ ŶƵŵĞƌŽƵƐ ŐĞŶĞƐ

͘ ƐƉĞĐŝĂůůLJ

ŵŝZͲϰϵϱŵĂLJŚĂǀĞƚŚĞĂďŝůŝƚLJƚŽƚĂƌŐĞƚĂůĂƌŐĞŶƵŵďĞƌŽĨŐĞŶĞƐ͖ďŝŽŝŶĨŽƌŵĂƟĐƐĂŶĂůLJƐŝƐƵƐŝŶŐǁǁǁ͘

ƚĂƌŐĞƚƐĐĂŶ͘ŽƌŐ;dĂƌŐĞƚ^ĐĂŶϳ͘Ϭ͕ĐŽŶƐƵůƚĞĚ:ĂŶƵĂƌLJϮϬϭϲͿƌĞǀĞĂůĞĚŽǀĞƌϱϭϬϯƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐǁŝƚŚŝŶƚŽƚĂů

ϳϵϵϴ ƉƵƚĂƟǀĞ ďŝŶĚŝŶŐ ƐŝƚĞƐ ĨŽƌ ŚƵŵĂŶ ŵŝZͲϰϵϱ ;ŽĨ ǁŚŝĐŚ ϭϬϭϱ ĐŽŶƐĞƌǀĞĚ ƐŝƚĞƐ ĂŶĚ ϲϵϴϯ ƉŽŽƌůLJ

ĐŽŶƐĞƌǀĞĚƐŝƚĞƐͿĂŶĚϰϴϳϵƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐǁŝƚŚƉƵƚĂƟǀĞďŝŶĚŝŶŐƐŝƚĞƐĨŽƌŵƵƌŝŶĞŵŝZͲϰϵϱ;ĂŶĚĂƚŽƚĂůŽĨ

ϳϴϴϲƐŝƚĞƐͿ͘/ƚŝƐƚŚĞƌĞĨŽƌĞƵŶůŝŬĞůLJƚŚĂƚƚŚĞŽďƐĞƌǀĞĚĞīĞĐƚƐĂƌĞĂƩƌŝďƵƚĂďůĞƚŽƐƚƌŽŶŐƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨŽŶĞ

ƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞŝŶƉĂƌƟĐƵůĂƌ͕ďƵƚĂƌĞƌĂƚŚĞƌƚŚĞƐƵŵŽĨŵŽĚĞƐƚƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨŵƵůƟƉůĞƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƐŝŶǀŽůǀĞĚ

ŝŶĂůůĂƐƉĞĐƚƐŽĨƚŚĞƉƌŽĐĞƐƐĞƐŽĨǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐƐƚƵĚŝĞĚŚĞƌĞ͕ŶĂŵĞůLJŝŶƟŵĂůŚLJƉĞƌƉůĂƐŝĂĂŶĚ

ĂĐĐĞůĞƌĂƚĞĚ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͘ DŽƌĞŽǀĞƌ͕ ďŝŶĚŝŶŐ ŽĨ Ă ĐĞƌƚĂŝŶ ŵŝĐƌŽZE ƚŽ ŝƚƐ ƚĂƌŐĞƚ ŐĞŶĞ ĚŽĞƐ ŶŽƚ

ĐŽŵƉůĞƚĞůLJ ƐŝůĞŶĐĞ ŝƚƐ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ͕ ďƵƚ ƌĂƚŚĞƌ ĚŽǁŶƚƵŶĞƐ ŝƚƐ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ

͘ dŚŝƐ ĐŽƌƌĞƐƉŽŶĚƐ ƚŽ ƚŚĞ

ŵŽĚĞƐƚĞīĞĐƚƐƚŚĂƚǁĞŽďƐĞƌǀĞĚŽŶŵŝZͲϰϵϱƚĂƌŐĞƚŐĞŶĞƌĞŐƵůĂƟŽŶ͘

In vivo ͕ ƚƌĞĂƚŵĞŶƚ ǁŝƚŚ '^KͲϰϵϱ ůĞĚ ƚŽ ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ƚĂƌŐĞƚ ŐĞŶĞƐ dŐĨɴϮ ĂŶĚ /ůϭϯƌĂϭ ĂŶĚ ŵŽƌĞ

ŵŽĚĞƐƚ ƵƉƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ Đǀƌϭ ĂŶĚ /ůϭϬ ƚĂƌŐĞƚƐ͘ />Ͳϭϯ͕ ŽŶĞ ŽĨ ƚŚĞ ĐLJƚŽŬŝŶĞƐ ƐĞĐƌĞƚĞĚ ďLJ ϰ

 dŚϮͲ ĐĞůůƐ͕ŝŶŚŝďŝƚƐŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞĂĐƟǀĂƟŽŶĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞƐƚŚĞƉƌŽĚƵĐƟŽŶŽĨƉƌŽͲŝŶŇĂŵŵĂƚŽƌLJĐLJƚŽŬŝŶĞƐďLJ

ĂĐƟǀĂƚĞĚŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐ͘

DŽƌĞƐƉĞĐŝĮĐĂůůLJ͕ƚŚĞ/>ͲϭϯƌĞĐĞƉƚŽƌĂůƉŚĂϭĐŚĂŝŶ;/ůϭϯƌĂϭͿŝƐŝŵƉůŝĐĂƚĞĚ

ǁŝƚŚŝŶ ƚŚĞ ƐŝŐŶĂů ƚƌĂŶƐĚƵĐƟŽŶ ƌŽƵƚĞ ŽĨ />Ͳϭϯ ĂŶĚ ŝŶŚŝďŝƚƐ ŝŶƚĞƌĨĞƌŽŶͲɶ ŝŶĚƵĐĞĚ ŐĞŶĞ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŝŶ

ŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞƐ

͘>ŝŬĞǁŝƐĞ͕/>ͲϭϬ͕ǁŚŝĐŚŝƐĂůƐŽĂdŚϮĐLJƚŽŬŝŶĞŚĂƐĂŶƟͲŝŶŇĂŵŵĂƚŽƌLJƉƌŽƉĞƌƟĞƐĂŶĚ

ƉƌŽƚĞĐƚƐ ĂŐĂŝŶƐƚ ĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ ĂŶĚ ŶĞŽŝŶƟŵĂ ĨŽƌŵĂƟŽŶ ďLJ ŝŶŚŝďŝƟŶŐ ŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞ ĂĐƟǀĂƟŽŶ ĂŶĚ

ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨŵĂƚƌŝdžŵĞƚĂůůŽƉƌŽƚĞŝŶĂƐĞƐ

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ƚƌĞĂƚŵĞŶƚĚĞĐƌĞĂƐĞƐŵĂĐƌŽƉŚĂŐĞŶƵŵďĞƌƐǁŝƚŚŝŶƚŚĞĂƌƚĞƌŝĂůůĞƐŝŽŶƐŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚ͘dŐĨɴϮŝƐŬŶŽǁŶƚŽ

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͘dŚŝƐŝƐŝŶůŝŶĞǁŝƚŚƚŚĞŽďƐĞƌǀĞĚŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶĐŽůůĂŐĞŶ

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ŽĨdŐĨɴϭ͕ͲɴϮĂŶĚͲɴϯĂĐƟǀŝƚLJŝŶĚƵĐĞƐĂƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐĂŶĚĨĂǀŽƵƌƐĚĞǀĞůŽƉŵĞŶƚŽĨĂŶƵŶƐƚĂďůĞƉůĂƋƵĞ

ƉŚĞŶŽƚLJƉĞ͕ǁŚŝĐŚƐƵŐŐĞƐƚƐdŐĨɴϮŚĂƐĂƚŚĞƌŽƉƌŽƚĞĐƟǀĞƉƌŽƉĞƌƟĞƐĂŶĚĐŽƵůĚƚŚĞƌĞĨŽƌĞĐŽŶƚƌŝďƵƚĞƚŽ

ƚŚĞƌĞĚƵĐĞĚƉůĂƋƵĞĨŽƌŵĂƟŽŶƐĞĞŶŝŶƚŚŝƐƐƚƵĚLJ

.