University of Groningen A proteogenomic view on antibiotic resistance in pathogenic Enterobacter species Nepal, Suruchi

A proteogenomic view on antibiotic resistance in pathogenic Enterobacter species

Nepal, Suruchi

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10.33612/diss.103413360

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Nepal, S. (2019). A proteogenomic view on antibiotic resistance in pathogenic Enterobacter species. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.103413360

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Chapter 3

Suruchi Nepal, Sandra Maaß, Stefano Grasso, Francis M. Cavallo, Jürgen Bartel, Dörte Becher,Erik Bathoorn, and Jan Maarten van Dijl

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A proteogenomic ‘sneak preview’ on carbapenem

resistance development in the Enterobacter cloacae

complex

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Materials and Methods

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SILAC data analysis

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ϳϬ ƉƌŽƚĞŽŵĞ͕ ͚ĐůƵƐƚĞƌƐ ŽĨ ŽƌƚŚŽůŽŐŽƵƐ ŐƌŽƵƉƐ͛ ;K'Ϳ ĨƵŶĐƟŽŶĂů ĐĂƚĞŐŽƌŝĞƐ ǁĞƌĞ ƉƌĞĚŝĐƚĞĚƵƐŝŶŐĞŐŐEK'ͲŵĂƉƉĞƌǀĞƌƐŝŽŶϭǁŝƚŚƚŚĞ/DKEŵĂƉƉŝŶŐŵŽĚĞ ĂŶĚĚĞĨĂƵůƚƐĞƫŶŐƐϮϯ_{ĂŐĂŝŶƐƚƚŚĞĞŐŐEK'ĚĂƚĂďĂƐĞǀĞƌƐŝŽŶϰ͘ϱ͘ϭ}Ϯϰ_͘ Pathway analyses E. roggenkampii ^dϮϯϮƉƌŽƚĞŝŶƐƉƌĞƐĞŶƚĂƚĚŝīĞƌĞŶƟĂůůĞǀĞůƐŝŶƚŚĞƉƌĞƐĞŶĐĞŽƌ ĂďƐĞŶĐĞŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ͕ĂƐŝĚĞŶƟĮĞĚďLJD^͕ǁĞƌĞĂůůŽĐĂƚĞĚƚŽƉĂƌƟĐƵůĂƌƉĂƚŚǁĂLJƐ ďĂƐĞĚ ŽŶ ƚŚĞ <LJŽƚŽ ŶĐLJĐůŽƉĞĚŝĂ ŽĨ 'ĞŶĞƐ ĂŶĚ 'ĞŶŽŵĞƐ ;<''͖ ŚƩƉ͗ǁǁǁ͘ ŐĞŶŽŵĞ͘ũƉͬŬĞŐŐͬƉĂƚŚǁĂLJ͘Śƚŵů25_{͘ ^ƵďƐĞƋƵĞŶƚůLJ͕ ƚŚĞ ƉĂƚŚǁĂLJƐ ƚŚƵƐ ŝĚĞŶƟĮĞĚ} ǁĞƌĞ ĐŽŵƉůĞŵĞŶƚĞĚ ǁŝƚŚ D^ͲŝĚĞŶƟĮĞĚ ŶŽŶͲƌĞŐƵůĂƚĞĚ ƉƌŽƚĞŝŶƐ ĂŶĚ ƉƌŽƚĞŝŶƐ ƉƌĞĚŝĐƚĞĚďLJin silico ƉƌŽƚĞŽŵĞĂŶŶŽƚĂƟŽŶ͘

/ĚĞŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨfur boxes in ther E. roggenkampii genome sequence

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roggenkampii

^dϮϯϮŝƐŽůĂƚĞǁĂƐĮƌƐƚŐƌŽǁŶ ŽǀĞƌŶŝŐŚƚ Ăƚ ϯϳ Σ ŽŶ ďůŽŽĚ ĂŐĂƌ ƉůĂƚĞƐ͘ dŚĞŶ͕ ϭϱϬ ŵů ZWD/ ŵĞĚŝƵŵ ǁĂƐ ŝŶŽĐƵůĂƚĞĚŝŶƚƌŝƉůŝĐĂƚĞǁŝƚŚĮǀĞĐŽůŽŶŝĞƐĂŶĚƚŚĞƌĞƐƵůƟŶŐĐƵůƚƵƌĞƐǁĞƌĞŐƌŽǁŶ Ăƚ ϯϳ Σ͕ ϮϱϬ ƌƉŵ͘ ŌĞƌ ϰ Ś ŽĨ ŐƌŽǁƚŚ ;K₆₀₀ Ϭ͘ϬϳͿ͕ ƚŚĞ ƚŚƌĞĞ ĐƵůƚƵƌĞƐ ǁĞƌĞ ƉŽŽůĞĚĂŶĚĂŶĂůŝƋƵŽƚŽĨϭϱϬŵůǁĂƐĐŽůůĞĐƚĞĚĨŽƌ/WͲD^ĂŶĂůLJƐŝƐ;ƚсϬƐĂŵƉůĞͿ͘ dŚĞƌĞŵĂŝŶŝŶŐϯϬϬŵůǁĞƌĞƐƉůŝƚŝŶƚŽƚǁŽƐĞƉĂƌĂƚĞĐƵůƚƵƌĞƐŽĨϭϱϬŵů͕ŽŶĞŽĨ ǁŚŝĐŚǁĂƐƐƵƉƉůĞŵĞŶƚĞĚǁŝƚŚϱŵŐͬ>ŝŵŝƉĞŶĞŵǁŚĞƌĞĂƐƚŚĞŽƚŚĞƌƌĞĐĞŝǀĞĚ

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ϳϭ

ŚĂƉƚ

Ğƌϥ

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Results and Discussion

ŶĂůLJƐŝƐŽĨƚŚĞŝŵŝƉĞŶĞŵƐƚƌĞƐƐƌĞƐƉŽŶƐĞŽĨE. roggenkampii ST232 by stable isotope labeling dŽ ĚĞƚĞƌŵŝŶĞ ŚŽǁ ƚŚĞ ĐĂƌďĂƉĞŶĞŵͲƌĞƐŝƐƚĂŶƚ E. roggenkampii ^dϮϯϮ ƐƚƵĚLJ ŝƐŽůĂƚĞ ƌĞƐƉŽŶĚƐ ƚŽ ŝŵŝƉĞŶĞŵ Ăƚ Ă ĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶ ũƵƐƚ ďĞůŽǁ ƚŚĞ D/ ŽĨ ϴ ŵŐͬ>͕ǁĞĞƐƚĂďůŝƐŚĞĚĂ^/>ĂƉƉƌŽĂĐŚĂƐƐĐŚĞŵĂƟĐĂůůLJƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚŝŶ&ŝŐƵƌĞ ϭ͘ dŽ ƚŚŝƐ ĞŶĚ͕ ǁĞ ĮƌƐƚ ƉƌĞƉĂƌĞĚ Ă ƐŽͲĐĂůůĞĚ ͚ŚĞĂǀLJ ƐƚĂŶĚĂƌĚ͛ ƉƌŽƚĞŝŶ ĞdžƚƌĂĐƚ ŽĨE. roggenkampii ŐƌŽǁŶǁŝƚŚŽƌǁŝƚŚŽƵƚŝŵŝƉĞŶĞŵŝŶZWD/ŵĞĚŝƵŵŝŶƚŚĞ

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ϳϮ ƉƌĞƐĞŶĐĞ ŽĨ ŚĞĂǀLJ ŝƐŽƚŽƉĞͲůĂďĞůĞĚ ůLJƐŝŶĞ ĂŶĚ ĂƌŐŝŶŝŶĞ͘ EĞdžƚ͕ ǁĞ ƉĞƌĨŽƌŵĞĚ ƚŚĞĂĐƚƵĂůĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚ͕ǁŚĞƌĞĂĐƵůƚƵƌĞǁŝƚŚĞdžƉŽŶĞŶƟĂůůLJŐƌŽǁŝŶŐďĂĐƚĞƌŝĂŝŶ ƌĞŐƵůĂƌZWD/ŵĞĚŝƵŵǁĂƐĚŝǀŝĚĞĚŝŶƚŽƚǁŽŵŽŝĞƟĞƐ͕ǁŚĞƌĞŽŶĞǁĂƐĐŚĂůůĞŶŐĞĚ ǁŝƚŚĂƐƵďͲŝŶŚŝďŝƚŽƌLJĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ;ϱŵŐͬ>ͿĨŽƌϯϬŵŝŶǁŚĞƌĞĂƐ ƚŚĞŽƚŚĞƌǁĂƐŶŽƚĞdžƉŽƐĞĚƚŽŝŵŝƉĞŶĞŵ͘^ĂŵƉůĞƐǁĞƌĞĐŽůůĞĐƚĞĚƉƌŝŽƌƚŽƚŚĞ ĂĚĚŝƟŽŶŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ;ƚсϬͿĂŶĚĂŌĞƌϯϬŵŝŶŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵĞdžƉŽƐƵƌĞ;ƚсϯϬн/_Ϳ͕Žƌ ƵƉŽŶĐŽŶƟŶƵĞĚŐƌŽǁƚŚŝŶƚŚĞĂďƐĞŶĐĞŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ;ƚсϯϬͲ/_{Ϳ͘&ŽƌƌĞƉƌŽĚƵĐŝďŝůŝƚLJ͕} ƚŚĞĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚǁĂƐƉĞƌĨŽƌŵĞĚŝŶƚƌŝƉůŝĐĂƚĞƐŽƚŚĂƚĨŽƌĞĂĐŚƐĂŵƉůŝŶŐĐŽŶĚŝƟŽŶ͕ ƚŚƌĞĞďŝŽůŽŐŝĐĂůƌĞƉůŝĐĂƚĞƐĂŵƉůĞƐǁĞƌĞŽďƚĂŝŶĞĚ͕ƌĞƐƵůƟŶŐŝŶŶŝŶĞƐĂŵƉůĞƐŝŶ ƚŽƚĂů͘^ƵďƐĞƋƵĞŶƚůLJ͕ƚŚĞƐĞƐĂŵƉůĞƐǁĞƌĞƐƉŝŬĞĚǁŝƚŚƚŚĞŚĞĂǀLJƉƌŽƚĞŝŶĞdžƚƌĂĐƚ ĂŶĚƚŚĞƉƌŽƚĞŝŶĐŽŶƚĞŶƚǁĂƐĂŶĂůLJnjĞĚďLJƋƵĂŶƟƚĂƟǀĞD^͘KĨŶŽƚĞ͕ǁĞƐĞůĞĐƚĞĚ ƚŚĞĐĞůůĐƵůƚƵƌĞŵĞĚŝƵŵZWD/ĨŽƌƚŚŝƐĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂƐƉƌĞǀŝŽƵƐƐƚƵĚŝĞƐŚĂǀĞƐŚŽǁŶ ƚŚĂƚ͕ ĨƌŽŵ Ă ďĂĐƚĞƌŝĂů ƉĞƌƐƉĞĐƟǀĞ͕ ZWD/ ĐůŽƐĞůLJ ƌĞƐĞŵďůĞƐ ƚŚĞ ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ ŝŶ ŚƵŵĂŶƉůĂƐŵĂϯϬ_{͘,ĞŶĐĞƚŚĞŐƌŽǁƚŚŽŶZWD/ŵŝŵŝĐƐƚŚĞƐŝƚƵĂƟŽŶĞŶĐŽƵŶƚĞƌĞĚ} ďLJ E. roggenkampii ƵƉŽŶŝŶǀĂƐŝǀĞŐƌŽǁƚŚ͘&ƵƌƚŚĞƌ͕ǁĞŽƉƚĞĚĨŽƌĂƌĞůĂƟǀĞůLJƐŚŽƌƚ ŝŵŝƉĞŶĞŵĞdžƉŽƐƵƌĞƟŵĞŽĨϯϬŵŝŶŝŶŽƌĚĞƌƚŽĐĂƉƚƵƌĞƚŚĞŝŶŝƟĂůƌĞƐƉŽŶƐĞŽĨE. roggenkampii ƚŽƚŚĞƉƌĞƐĞŶĐĞŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ͕ƌĂƚŚĞƌƚŚĂŶůĂƚĞƌĞƐƉŽŶƐĞƐǁŚĞƌĞ ŵĂŶLJĐŚĂŶŐĞƐŝŶƉƌŽƚĞŝŶĐŽŵƉŽƐŝƟŽŶŵĂLJƌĞůĂƚĞƚŽƐĞĐŽŶĚĂƌLJĞīĞĐƚƐĞůŝĐŝƚĞĚďLJ ƚŚĞƉƌŝŵĂƌLJƌĞƐƉŽŶƐĞƐ͘ĚĚŝƟŽŶĂůůLJ͕ŝŵŝƉĞŶĞŵŝƐĨĂŝƌůLJƌĂƉŝĚůLJĞůŝŵŝŶĂƚĞĚĨƌŽŵ ƚŚĞŚƵŵĂŶďŽĚLJǁŝƚŚĂŶĞƐƟŵĂƚĞĚŚĂůĨͲůŝĨĞŽĨΕϲϬŵŝŶŝŶĂĚƵůƚƐ͕ǁŚŝĐŚĨŽĐƵƐĞƐ ĂƩĞŶƟŽŶŽŶƚŚĞďĂĐƚĞƌŝĂůƌĞƐƉŽŶƐĞƐǁŝƚŚŝŶƚŚŝƐƟŵĞĨƌĂŵĞϯϭ_͘ /ŶƚŽƚĂů͕ϴϲϰE. roggenkampii ƉƌŽƚĞŝŶƐǁĞƌĞŝĚĞŶƟĮĞĚďLJD^ĂŶĂůLJƐŝƐŽĨƚŚĞ^/> ƐĂŵƉůĞƐ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂƌLJdĂďůĞ^ϭͿ͘dŚĞƐĞŝŶĐůƵĚĞĚϮϴ͚ŽŶͲŽī͛ƉƌŽƚĞŝŶƐƚŚĂƚǁĞƌĞ ĚĞƚĞĐƚĂďůĞŝŶŽŶůLJŽŶĞĐŽŶĚŝƟŽŶŽǀĞƌĂůů͘ƐƐĞƐƐŵĞŶƚŽĨƉƌŽƚĞŝŶƐǁŝƚŚůŽŐϮĨŽůĚ ĐŚĂŶŐĞƐŚŝŐŚĞƌƚŚĂŶϬ͘ϴƐŚŽǁĞĚƚŚĂƚƚŚĞĂďƵŶĚĂŶĐĞŽĨƌĞůĂƟǀĞůLJĨĞǁƉƌŽƚĞŝŶƐ ǁĂƐ ƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJ ĐŚĂŶŐĞĚ ĚƵĞ ƚŽ ƚŚĞ ƉƌĞƐĞŶĐĞ ŽĨ ŝŵŝƉĞŶĞŵ͕ ĂƐ ƐƵŵŵĂƌŝnjĞĚ ŝŶƚŚĞsĞŶŶĚŝĂŐƌĂŵƐƉƌĞƐĞŶƚĞĚŝŶ&ŝŐƵƌĞϮ͘^ƉĞĐŝĮĐĂůůLJ͕ƵƉŽŶĐŽŵƉĂƌŝƐŽŶŽĨ ƚŚĞƚсϯϬн/_{ĂŶĚƚŚĞƚсϯϬ}Ͳ/_{ƐĂŵƉůĞƐ͕ǁĞŽďƐĞƌǀĞĚƚŚĂƚƚŚĞůĞǀĞůƐŽĨĞŝŐŚƚƉƌŽƚĞŝŶƐ} ǁĞƌĞ ĐŽŶƐŝƐƚĞŶƚůLJ ŝŶĐƌĞĂƐĞĚ͕ ǁŚŝůĞ ƚŚĞ ůĞǀĞůƐ ŽĨ ϱϲ ƉƌŽƚĞŝŶƐ ǁĞƌĞ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ ;ƉфϬ͘ϬϭͿ͘dŽĂƐƐĞƐƐƉƌŽƚĞŽŵŝĐĐŚĂŶŐĞƐƌĞůĂƚĞĚƚŽŐƌŽǁƚŚŽĨE. roggenkampii ŽǀĞƌ ϯϬŵŝŶ͕ƚŚĞƚсϬĂŶĚƚсϯϬͲ/ _{ƐĂŵƉůĞƐǁĞƌĞĐŽŵƉĂƌĞĚ͕ƐŚŽǁŝŶŐŝŶĐƌĞĂƐĞĚůĞǀĞůƐ} ŽĨϭϮƉƌŽƚĞŝŶƐĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞĚůĞǀĞůƐŽĨϮϰƉƌŽƚĞŝŶƐ͘&ƵƌƚŚĞƌ͕ĐŽŵƉĂƌŝƐŽŶŽĨƚŚĞ ƚсϬĂŶĚƚсϯϬн/_{ƐĂŵƉůĞƐƌĞǀĞĂůĞĚŝŶĐƌĞĂƐĞĚůĞǀĞůƐŽĨϭϱƉƌŽƚĞŝŶƐĂŶĚĚĞĐƌĞĂƐĞĚ}

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ϳϯ

ŚĂƉƚ

Ğƌϥ

ůĞǀĞůƐŽĨϵϰƉƌŽƚĞŝŶƐĂƐĂĐŽŶƐĞƋƵĞŶĐĞŽĨŐƌŽǁƚŚŽǀĞƌϯϬŵŝŶŝŶƚŚĞƉƌĞƐĞŶĐĞ ŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ͘/ŵƉŽƌƚĂŶƚůLJ͕ƚŚĞƉƌŽƚĞŝŶƐĨŽƌǁŚŝĐŚĚŝīĞƌĞŶƚůĞǀĞůƐǁĞƌĞĞǀŝĚĞŶƚ ƵƉŽŶĐŽŵƉĂƌŝƐŽŶŽĨƚŚĞƚсϬĂŶĚƚсϯϬн/_{ƐĂŵƉůĞƐŝŶĐůƵĚĞǀĂƌŝŽƵƐƉƌŽƚĞŝŶƐƚŚĂƚ} ƉƌĞƐĞŶƚĂůƚĞƌĞĚĂďƵŶĚĂŶĐĞĚƵĞƚŽϯϬŵŝŶŐƌŽǁƚŚ͘dŚĞƌĞĨŽƌĞ͕ǁĞĨŽĐƵƐĞĚŽƵƌ ĨƵƌƚŚĞƌĂŶĂůLJƐŝƐŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵͲƐƉĞĐŝĮĐƌĞƐƉŽŶƐĞƐŝŶŽƵƌE. roggenkampii ^dϮϯϮ ƐƚƵĚLJŝƐŽůĂƚĞŽŶƚŚĞƌĞŐƵůĂƚĞĚƉƌŽƚĞŝŶƐŝĚĞŶƟĮĞĚďLJĐŽŵƉĂƌŝƐŽŶŽĨƚŚĞƚсϯϬн/ ĂŶĚƚсϯϬͲ/_{ƐĂŵƉůĞƐ͘} &ŝŐƵƌĞϮ͘sĞŶŶĚŝĂŐƌĂŵƐŽĨĚŝīĞƌĞŶƟĂůůLJƌĞŐƵůĂƚĞĚƉƌŽƚĞŝŶƐ E. roggenkampii ^dϮϯϮƵƉŽŶ ĂŶŝŵŝƉĞŶĞŵĐŚĂůůĞŶŐĞŽĨϯϬŵŝŶ͘;ͿhŶŝƋƵĞĂŶĚƐŚĂƌĞĚƵƉƌĞŐƵůĂƚĞĚĐĞůůƵůĂƌƉƌŽƚĞŝŶƐ ŝŶƚŚĞƚŚƌĞĞŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͗;ŝͿƚсϯϬн/_{ǀƐƚсϯϬ}Ͳ/_{͖;ŝŝͿƚсϯϬ}н/_{ǀƐƚсϬ͖ĂŶĚ;ŝŝŝͿƚсϯϬ}Ͳ/ ǀƐƚсϬ͘;ͿhŶŝƋƵĞĂŶĚƐŚĂƌĞĚĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƚĞĚĐĞůůƵůĂƌƉƌŽƚĞŝŶƐŝŶƚŚĞƚŚƌĞĞŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚ ĐŽŶĚŝƟŽŶƐ͗;ŝͿƚсϯϬн/_{ǀƐƚсϯϬ}Ͳ/_{͖;ŝŝͿƚсϯϬ}н/_{ǀƐƚсϬ͖ĂŶĚ;ŝŝŝͿƚсϯϬ}Ͳ/_{ǀƐƚсϬ͘}

Biological processes adapted in response to imipenem challenge

dŽ ƵŶĚĞƌƐƚĂŶĚ ǁŚŝĐŚ ďŝŽůŽŐŝĐĂů ƉƌŽĐĞƐƐĞƐ ĂƌĞ ŵŽĚƵůĂƚĞĚ ďLJ Ă ƐƵďͲŝŶŚŝďŝƚŽƌLJ ĐŽŶĐĞŶƚƌĂƟŽŶŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵ͕ǁĞĮƌƐƚĂƩƌŝďƵƚĞĚĂůůŝĚĞŶƟĮĞĚƉƌŽƚĞŝŶƐ;ŝ͘Ğ͘ƚŚĞ ƌĞŐƵůĂƚĞĚplusƚŚĞŶŽŶͲƌĞŐƵůĂƚĞĚƉƌŽƚĞŝŶƐͿƚŽďŝŽůŽŐŝĐĂůƉƌŽĐĞƐƐĞƐĂĐĐŽƌĚŝŶŐƚŽ ŐĞŶĞŽŶƚŽůŽŐLJĂŶĚŐƌĂƉŚŝĐĂůůLJŐƌŽƵƉĞĚƚŚĞŵŝŶƌĞůĂƚĞĚĐůƵƐƚĞƌƐƵƐŝŶŐsŽƌŽŶŽŝ ƚƌĞĞŵĂƉƐ͘dŚŝƐĂůůŽǁƐƚŚĞŝƌŝŶƐƉĞĐƟŽŶĂƚĚŝīĞƌĞŶƚĨƵŶĐƟŽŶĂůůĞǀĞůƐĂƐƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚ ŝŶ&ŝŐƵƌĞϯĂŶĚ^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂƌLJ&ŝŐƵƌĞ^ϭ͘dŚŝƐĂƉƉƌŽĂĐŚƐŚŽǁĞĚƚŚĂƚ͕ĂƉĂƌƚĨƌŽŵ ƉƌŽƚĞŝŶƐŽĨƵŶŬŶŽǁŶĨƵŶĐƟŽŶ͕ƚŚĞŚŝŐŚĞƐƚŶƵŵďĞƌƐŽĨŝĚĞŶƟĮĞĚƉƌŽƚĞŝŶƐĂƌĞ ŝŶǀŽůǀĞĚŝŶƚƌĂŶƐůĂƟŽŶĂŶĚƚŚĞŵĞƚĂďŽůŝƐŵŽĨĐĂƌLJĚƌĂƚĞƐ͕ĂŵŝŶŽĂĐŝĚƐĂŶĚ

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ϳϰ ŶƵĐůĞŽƟĚĞƐ͘KƚŚĞƌǁĞůůͲƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚĨƵŶĐƟŽŶĂůƉƌŽƚĞŝŶĐĂƚĞŐŽƌŝĞƐƌĞůĂƚĞƚŽĐĞůů ǁĂůůďŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͕ŝŽŶŚŽŵĞŽƐƚĂƐŝƐĂŶĚĐĞůůƵůĂƌƐƚƌĞƐƐƌĞƐƉŽŶƐĞƐ͘/ŶƚĞƌĞƐƟŶŐůLJ͕ƚŚĞ ƉƌŽƚĞŝŶƐĚŝƐƉůĂLJŝŶŐƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚůLJĐŚĂŶŐĞĚůĞǀĞůƐŝŶƚŚĞƉƌĞƐĞŶĐĞŽĨŝŵŝƉĞŶĞŵƚƵƌŶĞĚ ŽƵƚƚŽďĞĂƐƐŽĐŝĂƚĞĚǁŝƚŚĂůůŽĨƚŚĞƐĞĨƵŶĐƟŽŶĂůĐĂƚĞŐŽƌŝĞƐĂƐƐŚŽǁŶŝŶ&ŝŐƵƌĞϰ͘

A

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