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The handle http://hdl.handle.net/1887/47467 holds various files of this Leiden University dissertation

Author: Welten, S.M.J.

Title: The role of 14q32 microRNAs in vascular remodelling

Issue Date: 2017-03-09

/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨDĞĨϮĂĞŶŚĂŶĐĞƐƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶǀŝĂϭϰƋϯϮ

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SMJ Welten^1,2 DZĚĞsƌŝĞƐ^1,2 ,WĞƚĞƌƐ^1,2

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ΎƵƚŚŽƌƐĐŽŶƚƌŝďƵƚĞĚĞƋƵĂůůLJƚŽƚŚŝƐǁŽƌŬ

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ϯ/ĚĞƌĂWŚĂƌŵĂĐĞƵƟĐĂůƐ͕ĂŵďƌŝĚŐĞ͕D͕hŶŝƚĞĚ^ƚĂƚĞƐŽĨŵĞƌŝĐĂ

Chapter 6

ϭϲϰ

Abstract

/ŵƉƌŽǀŝŶŐƚŚĞĞĸĐĂĐLJŽĨŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶŝƐĂƉƌŽŵŝƐŝŶŐƐƚƌĂƚĞŐLJƚŽƌĞƐƚŽƌĞƉĞƌĨƵƐŝŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĐ

ƟƐƐƵĞƐ ŝŶ ƉĂƟĞŶƚƐ ǁŝƚŚ ƉĞƌŝƉŚĞƌĂů ĂƌƚĞƌŝĂů ĚŝƐĞĂƐĞ͘ dŚĞ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZE ĐůƵƐƚĞƌ ŝƐ ŚŝŐŚůLJ ŝŶǀŽůǀĞĚ

ŝŶŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘dŚĞDĞĨϮĂƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĨĂĐƚŽƌŚĂƐďĞĞŶƐŚŽǁŶƚŽŝŶĚƵĐĞƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶŽĨƚŚĞ

ŵŝĐƌŽZEƐǁŝƚŚŝŶƚŚŝƐĐůƵƐƚĞƌ͘/ŶƚŚĞƉƌĞƐĞŶƚƐƚƵĚLJ͕ǁĞĞdžĂŵŝŶĞĚƚŚĞƌŽůĞŽĨDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶƉŽƐƚͲ ŝƐĐŚĞŵŝĐŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͕ƉŽƚĞŶƟĂůůLJǀŝĂƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨƚŚĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEĐůƵƐƚĞƌ͘

tĞ ŝŶŚŝďŝƚĞĚ ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶ ŽĨ DĞĨϮĂ ƵƐŝŶŐ ŐĞŶĞ ƐŝůĞŶĐŝŶŐ ŽůŝŐŽŶƵĐůĞŽƟĚĞƐ ;'^KƐͿ ŝŶ ĂŶ in vivo ŚŝŶĚ

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;ϴϬйƌĞĐŽǀĞƌLJǀĞƌƐƵƐϲϬйƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶĐŽŶƚƌŽůͿ͘ŶŝŵĂůƐƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲDĞĨϮĂƐŚŽǁĞĚŝŶĐƌĞĂƐĞĚ

ĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ ĂŶĚ ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ ŝŶ ƚŚĞ ƌĞůĞǀĂŶƚ ŵƵƐĐůĞ ƟƐƐƵĞƐ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ DĞĨϮĂ ĚĞĐƌĞĂƐĞĚ

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KƵƌƐƚƵĚLJĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞƐĂŶŽǀĞůĨƵŶĐƟŽŶĨŽƌDĞĨϮĂŝŶƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶǀŝĂŝŶĚŝƌĞĐƚ

ƌĞŐƵůĂƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ ŵŝZͲϯϮϵ ĂŶĚ ŵŝZͲϰϵϰ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ DĞĨϮĂ ĐŽƵůĚ ďĞ Ă ƉƌŽŵŝƐŝŶŐ

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6

/ŶƚƌŽĚƵĐƟŽŶ

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dŚŝƐ ĐĂŶ ďĞ ĂĐĐŽŵƉůŝƐŚĞĚ ďLJ ƐƟŵƵůĂƟŶŐ ƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐ ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͕ ŝ͘Ğ͘ ĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ ĂŶĚ

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Ăƚ ƚŚĞ ƉŽƐƚͲƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂů ůĞǀĞů

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ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ

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ŝŶ ŵŝĐĞ

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/ŶƚĞƌĞƐƟŶŐůLJ͕D&ϮŝƚƐĞůĨǁĂƐƌĞƉŽƌƚĞĚƚŽƚĂƌŐĞƚŵŝZͲϯϮϵĂŶĚƚŚĞŽƚŚĞƌϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ

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ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĨĂĐƚŽƌƐĂŶĚŝŶƉĂƌƟĐƵůĂƌďLJD&Ϯ

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ůƚŚŽƵŐŚ ŵĂŝŶůLJ ƐƚƵĚŝĞĚ ĨŽƌ ƚŚĞŝƌ ƌŽůĞ ŝŶ ŵƵƐĐůĞ ĚĞǀĞůŽƉŵĞŶƚ ĂŶĚ ĚŝīĞƌĞŶƟĂƟŽŶ͕ D&Ϯ ĨĂŵŝůLJ

ŵĞŵďĞƌƐĂƌĞĂůƐŽĞdžƉƌĞƐƐĞĚŝŶƐĂŶĚǀĂƐĐƵůĂƌ^DƐ

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ŽĨ ϭϰƋϯϮ ŵŝĐƌŽZEƐ͘ tĞ ƐŚŽǁ ŚĞƌĞ ƚŚĂƚ ŝŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ DĞĨϮĂ͕ ǀŝĂ ƐƵďƐĞƋƵĞŶƚ ŝŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ ϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϰ͕ďƵƚŶŽƚŽƚŚĞƌϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ͕ŝŶĚĞĞĚŝŵƉƌŽǀĞƐƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐ

ϭϲϲ

ďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJin vivo.

Methods

Mef2a inhibitors

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Hind limb ischemia model

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WĂƌůŝĂŵĞŶƚ͘ůůĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐǁĞƌĞĂƉƉƌŽǀĞĚďLJƚŚĞĐŽŵŵŝƩĞĞŽŶĂŶŝŵĂůǁĞůĨĂƌĞŽĨƚŚĞ>ĞŝĚĞŶhŶŝǀĞƌƐŝƚLJDĞĚŝĐĂůĞŶƚĞƌ;>ĞŝĚĞŶ͕

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ϰŽƌϱŵŝĐĞǁŝƚŚĨƌĞĞĂĐĐĞƐƐƚŽǁĂƚĞƌĂŶĚƌĞŐƵůĂƌĐŚŽǁ͘&ŽƌDĞĨϮĂͲŝŶŚŝďŝƟŽŶĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐ͕ŵŝĐĞǁĞƌĞŐŝǀĞŶŝŶƚƌĂƉĞƌŝƚŽŶĞĂů;ŝ͘ƉͿ

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KƌŝŽŶͿĂŶĚďƵƉƌĞŶŽƌƉŚŝŶĞ;Ϭ͘ϮŵŐͬŬŐ͕D^ŶŝŵĂů,ĞĂůƚŚͿ͘

Laser Doppler perfusion measurements

ůŽŽĚ ŇŽǁ ƌĞĐŽǀĞƌLJ ƚŽ ƚŚĞ ůŝŐĂƚĞĚ ŚŝŶĚ ůŝŵď ǁĂƐ ŵĞĂƐƵƌĞĚ ŽǀĞƌ ƟŵĞ ƵƐŝŶŐ >ĂƐĞƌ ŽƉƉůĞƌ WĞƌĨƵƐŝŽŶ /ŵĂŐŝŶŐ ;>W/Ϳ ;DŽŽƌ

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ĂŶĞƐƚŚĞƟnjĞĚ ďLJ ŝ͘Ɖ͘ ŝŶũĞĐƟŽŶ ŽĨ ŵŝĚĂnjŽůĂŵ ;ϴ ŵŐͬŬŐ͕ ZŽĐŚĞ ŝĂŐŶŽƐƟĐƐͿ ĂŶĚ ŵĞĚĞƚŽŵŝĚŝŶĞ ;Ϭ͘ϰ ŵŐͬŬŐ͕ KƌŝŽŶͿ͘ ĞĨŽƌĞ ĞĂĐŚ

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ĮdžĞĚŝŶϰйW&͘

Cell culture

Primary murine smooth muscle cells.WƌŝŵĂƌLJŵƵƌŝŶĞƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƐǁĞƌĞŝƐŽůĂƚĞĚĨƌŽŵŵŽƵƐĞĂŽƌƚĂĞŽĨϱϳůͬϲŵŝĐĞ͘ŽƌƚĂĞ

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ƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƐŽĐĐƵƌƌĞĚǁŝƚŚŝŶŽŶĞǁĞĞŬ͕ĂŌĞƌǁŚŝĐŚĐĞůůƐǁĞƌĞƉĂƐƐĞĚƵƐŝŶŐdƌLJƉƐŝŶͲd;^ŝŐŵĂͿĂŶĚƚƌĂŶƐĨĞƌƌĞĚƚŽĨƌĞƐŚ

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3T3 cells. ϯdϯĐĞůůƐǁĞƌĞĐƵůƚƵƌĞĚĂƚϯϳǑŝŶĂŚƵŵŝĚŝĮĞĚϱйK2ĞŶǀŝƌŽŶŵĞŶƚ͘ƵůƚƵƌĞŵĞĚŝƵŵĐŽŶƐŝƐƚĞĚŽĨDD'ůƵƚĂDy

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6

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6

Results

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ĞdžƉƌĞƐƐĞĚŝŶƚŚŝƐƟƐƐƵĞ͕ƉĂƌƟĐƵůĂƌůLJŝŶƚŚĞŶƵĐůĞŝŽĨĐĞůůƐ;&ŝŐ͘ϮͿ͘džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨDĞĨϮĂǁĂƐŵĞĂƐƵƌĞĚ

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170

Figure 2. In vivoŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨDĞĨϮĂďLJ'^KͲDĞĨϮĂ. (A) /ŵŵƵŶŽŚŝƐƚŽĐŚĞŵŝĐĂůƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨD&ϮŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŽĨ'^KͲ DĞĨϮĂĂŶĚ'^KͲŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ͘ (B)džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨDĞĨϮĂŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŽĨϱϳůͬϲŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲDĞĨϮĂŽƌ

'^KͲĐŽŶƚƌŽů͕ϭϰĚĂLJƐĂŌĞƌĚŽƵďůĞůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞůĞŌĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨϭϬĂŶŝŵĂůƐǁĂƐƵƐĞĚ͘(C)

džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨDĞĨϮĂŝŶƚŚĞŐĂƐƚƌŽĐŶĞŵŝƵƐŵƵƐĐůĞŽĨϱϳůͬϲŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲDĞĨϮĂŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽů͕ϭϰĚĂLJƐĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ

ŝŶĚƵĐƟŽŶ͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ŐĂƐƚƌŽĐŶĞŵŝƵƐŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨϭϬĂŶŝŵĂůƐǁĂƐƵƐĞĚ͘DĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐƌĞůĂƟǀĞƚŽ,WZdĂƌĞƐŚŽǁŶ

ŚĞƌĞ;ц^DͿ͘(D)D&ϮĂŶĚĐƟŶƉƌŽƚĞŝŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶĂŶĚƋƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞůLJƐĂƚĞƐŽĨ'^KͲDĞĨϮĂ;DͿĂŶĚ'^KͲ

ŽŶƚƌŽů;ͿƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ;ŶсϮĂŶŝŵĂůƐƉĞƌŐƌŽƵƉͿ͘DĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶĂƐƉĞƌĐĞŶƚĂŐĞŽĨĐŽŶƚƌŽůŝƐƐŚŽǁŶŚĞƌĞ;ц^DͿ͘ΎΎΎƉфϬ͕ϬϬϭ͕

ΎΎΎΎƉфϬ͕ϬϬϬϭ͘

/ŵƉƌŽǀĞĚďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJƵƉŽŶDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶ

dŚĞĞīĞĐƚŽĨDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJǁĂƐĞǀĂůƵĂƚĞĚĂƚĚŝīĞƌĞŶƚƟŵĞƉŽŝŶƚƐĂŌĞƌ

ůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ;ƉƌĞͲŽƉĞƌĂƟǀĞ͕ƉŽƐƚͲŽƉĞƌĂƟǀĞ͕ĚĂLJϯ͕ĚĂLJϳ͕ĚĂLJϭϬĂŶĚĚĂLJϭϰĂŌĞƌ

ŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ͕&ŝŐ͘ϯͿ͘ůƌĞĂĚLJǁŝƚŚŝŶϯĚĂLJƐĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂ͕ĂŶŝŵĂůƐŝŶũĞĐƚĞĚǁŝƚŚ'^KƐ

ĂŐĂŝŶƐƚDĞĨϮĂƐŚŽǁĞĚŝŵƉƌŽǀĞĚďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJ;ϰϰйƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶ'^KͲDĞĨϮĂĂŶŝŵĂůƐǀĞƌƐƵƐ

6

ϮϱйƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶ'^KͲĐŽŶƚƌŽůĂŶŝŵĂůƐ͕&ŝŐ͘ϯͿ͘dŚŝƐŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶƉĞƌĨƵƐŝŽŶƉĞƌƐŝƐƚĞĚŽǀĞƌƟŵĞ͘ƚƟŵĞŽĨ

ƐĂĐƌŝĮĐĞ͕'^KͲDĞĨϮĂƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐƐŚŽǁĞĚϴϬйƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶďůŽŽĚŇŽǁĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽϲϬйƌĞĐŽǀĞƌLJ

ŽĨƉĞƌĨƵƐŝŽŶŝŶ'^KͲŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͘

&ŝŐƵƌĞϯ͘ůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJĂŌĞƌin vivoDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶ͘ (A)>ĂƐĞƌŽƉƉůĞƌƉĞƌĨƵƐŝŽŶŝŵĂŐĞƐ;>W/ͿĨƌŽŵƉĂǁƐŽĨŵŝĐĞƐƵďũĞĐƚĞĚ

ƚŽƵŶŝůĂƚĞƌĂůŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂ͕ƐŚŽǁŝŶŐďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJŝŶƚŚĞƐĞĂŶŝŵĂůƐŽǀĞƌƟŵĞ͘(B)YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨ>W/ŵĞĂƐƵƌĞŵĞŶƚƐ

ŽǀĞƌƟŵĞŝŶŵŝĐĞ;ϭϭƉĞƌŐƌŽƵƉͿƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲDĞĨϮĂŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽů;ϭŵŐƉĞƌŵŽƵƐĞŝŶũĞĐƚĞĚŝ͘Ɖ͘ĂƚĚŝīĞƌĞŶƚƟŵĞƉŽŝŶƚƐĂƐ

ĚĞƐĐƌŝďĞĚŝŶŵĂƚĞƌŝĂůƐĂŶĚŵĞƚŚŽĚƐͿ͘ĂƚĂĂƌĞĐĂůĐƵůĂƚĞĚĂƐƚŚĞƌĂƟŽŽĨƚŚĞůĞŌ;ŝƐĐŚĞŵŝĐͿŽǀĞƌƚŚĞƌŝŐŚƚ;ŶŽŶͲŝƐĐŚĞŵŝĐͿƉĂǁĂŶĚ

ƉƌĞƐĞŶƚĞĚĂƐŵĞĂŶц^D͘WͲǀĂůƵĞƐĂƌĞƐŚŽǁŶĨŽƌĞĂĐŚƟŵĞƉŽŝŶƚ͘

/ŶǀŝǀŽŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨDĞĨϮĂŝŶĐƌĞĂƐĞƐĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐ

ůƉŚĂƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĂĐƟŶ;ɲͲ^D

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ŵƵƐĐůĞ͘^ŝŐŶŝĮĐĂŶƚŝŶĐƌĞĂƐĞƐŝŶĂƌƚĞƌŝŽůĞĚŝĂŵĞƚĞƌƐǁĞƌĞŽďƐĞƌǀĞĚďĞƚǁĞĞŶƚŚĞůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚĂĚĚƵĐƚŽƌ

ŵƵƐĐůĞƐĨŽƌ'^KͲDĞĨϮĂƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲĐŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ;ŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶĂƌƚĞƌŝŽůĞ

ĚŝĂŵĞƚĞƌŝŶůĞŌŽǀĞƌƌŝŐŚƚĂĚĚƵĐƚŽƌ;>ͬZƌĂƟŽͿǁĂƐϮ͘ϬϱϳĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ>ͬZƌĂƟŽŽĨϭ͘ϭϲŝŶĐŽŶƚƌŽůƐ͕

ƉсϬ͘ϬϬϲϬ͕&ŝŐ͘ϰͿ͘ŽƚŚƚŽƚĂůɲͲ^D

ĂƌĞĂƉĞƌƐĞĐƟŽŶ;>'^KͲDĞĨϮĂϴϰϲцϵϵʅŵ

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ϰϬϰцϯϳʅŵ

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ǀƐZ'^KͲŽŶƚƌŽůϰϴϬцϮϳʅŵ

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ĂƐŵĞĂŶůƵŵĞŶĂƌĞĂƉĞƌɲͲ^D

ĐŽůůĂƚĞƌĂů;>'^KͲDĞĨϮĂϯϰϮцϮϱʅŵ

ǀƐZ'^KͲDĞĨϮĂϭϳϬцϵʅŵ

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ǀƐZ'^KͲŽŶƚƌŽůϮϭϳцϭϴʅŵ

͕ƉсϬ͘ϱϰͿǁĞƌĞŝŶĐƌĞĂƐĞĚŝŶ

ƚŚĞůĞŌĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐŽĨ'^KͲDĞĨϮĂƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽƚŚĞƌŝŐŚƚĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐ

ǁŚŝĐŚǁĂƐŶŽƚƚŚĞĐĂƐĞĨŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ;&ŝŐ͘ϰĂŶĚϰ͕ƌĞƐƉĞĐƟǀĞůLJͿ͘DŽƌĞŽǀĞƌ͕

ɲͲ^D

ĂƌĞĂƉĞƌĐŽůůĂƚĞƌĂůǁĂƐŝŶĐƌĞĂƐĞĚŝŶƚŚĞůĞŌĂĚĚƵĐƚŽƌŽĨ'^KͲDĞĨϮĂƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐĐŽŵƉĂƌĞĚ

ƚŽĐŽŶƚƌŽůƐ;'^KͲDĞĨϮĂϯϰϮцϮϱʅŵ

ǀƐ'^KͲŽŶƚƌŽůϮϯϳцϰϳʅŵ

͕ƉсϬ͘Ϭϯ͕&ŝŐ͘ϰĂŶĚƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ

ŝŵĂŐĞƐŝŶ&ŝŐ͘ϰͿ͘dŚĞŶƵŵďĞƌŽĨɲͲ^D

ǀĞƐƐĞůƐďĞƚǁĞĞŶƚŚĞůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚƉĂǁǁĞƌĞƐŝŵŝůĂƌŝŶƚŚĞ

'^KͲDĞĨϮĂŐƌŽƵƉ;>ͬZƌĂƟŽϭ͘ϬϰͿ͕ǁŚĞƌĞĂƐ'^KͲŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐŚĂĚŵŽƌĞɲͲ^D

ǀĞƐƐĞůƐ

172

ŝŶƚŚĞůĞŌĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽƚŚĞƌŝŐŚƚƉĂǁ;>ͬZƌĂƟŽϭ͘Ϯϳ͕&ŝŐ͘ϰͿ͘ƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐŝƐƚŚĞĞŶůĂƌŐĞŵĞŶƚŽĨ

ƉƌĞͲĞdžŝƐƟŶŐĂƌƚĞƌŝŽůĞƐƚŽĨŽƌŵĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝĞƐ͘dŚĞƌĞĨŽƌĞ͕ŶŽƚƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶŶƵŵďĞƌŽĨĐŽůůĂƚĞƌĂů

ĂƌƚĞƌŝĞƐďƵƚƌĂƚŚĞƌƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶĂƌƚĞƌŝŽůĞĚŝĂŵĞƚĞƌƐĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞŝŶĐƌĞĂƐĞĚĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐŝŶ'^KͲ DĞĨϮĂ ƚƌĞĂƚĞĚ ŵŝĐĞ͘ &ƵƌƚŚĞƌŵŽƌĞ͕ ĂƐ ĂŶ ŝŶŇĂŵŵĂƚŽƌLJ ĞŶǀŝƌŽŶŵĞŶƚ ĨĂĐŝůŝƚĂƚĞƐ ĞdžƚƌĂĐĞůůƵůĂƌ ŵĂƚƌŝdž

ƌĞĂƌƌĂŶŐĞŵĞŶƚĂŶĚŽƵƚǁĂƌĚƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐŽĨĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐ͕ǁĞĂůƐŽůŽŽŬĞĚĂƚƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨ

ŝŶŇĂŵŵĂƚŽƌLJĐĞůůƐƐƵƌƌŽƵŶĚŝŶŐƚŚĞĐŽůůĂƚĞƌĂůƐ͘dŚĞƌĞǁĂƐĂƚƌĞŶĚƚŽǁĂƌĚƐĂŶŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶƚŚĞŶƵŵďĞƌ

ŽĨƉĞƌŝǀĂƐĐƵůĂƌϰϱ

ůĞƵŬŽĐLJƚĞƐĂƌŽƵŶĚƚŚĞƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐĐŽůůĂƚĞƌĂůƐŽĨ'^KͲDĞĨϮĂƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ

ĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽĐŽŶƚƌŽůƐ;ϲϰйŝŶĐƌĞĂƐĞĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ'^KͲŽŶƚƌŽůĂŶŝŵĂůƐ͕ƉсϬ͘Ϭϵ͕&ŝŐ͘ϰ&Ϳ͘

Figure 4. In vivoĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŌĞƌDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶ͘/ŵŵƵŶŽŇƵŽƌĞƐĐĞŶĐĞƐƚĂŝŶŝŶŐŽĨƉĂƌĂĸŶͲĞŵďĞĚĚĞĚĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŐƌŽƵƉ

ŽĨϱϳůͬϲŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚĞŝƚŚĞƌ'^KͲĐŽŶƚƌŽů;ŶсϭϭĂŶŝŵĂůƐͿĂŶĚ'^KͲDĞĨϮĂ;ŶсϭϬĂŶŝŵĂůƐͿ͕ϭϰĚĂLJƐĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂŝŶĚƵĐƟŽŶ͕

ƵƐŝŶŐĂŶƟͲɲ^D;ƚƵƌƋƵŽŝƐĞͿĂŶƟďŽĚŝĞƐ͘(A)YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶĚŝĂŵĞƚĞƌŽĨɲͲ^D^нĂƌƚĞƌŝŽůĞƐďĞƚǁĞĞŶƚŚĞůĞŌĂŶĚ

ƚŚĞƌŝŐŚƚĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐŽĨŵŝĐĞ͘(B)dŽƚĂůɲͲ^D^нĂƌĞĂƉĞƌƐĞĐƟŽŶĂƐǁĞůůĂƐ(C)ŵĞĂŶůƵŵĞŶĂƌĞĂƉĞƌɲͲ^D^нĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌĞ

ƐŚŽǁŶ͘(D)ZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐŽĨɲͲ^DƐƚĂŝŶŝŶŐŝŶƵŶůŝŐĂƚĞĚĂŶĚůŝŐĂƚĞĚĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞƐŽĨŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲ DĞĨϮĂŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽů͘ (E)EƵŵďĞƌŽĨƚŽƚĂůĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐŝŶůĞŌ;ůŝŐĂƚĞĚͿŽǀĞƌƌŝŐŚƚ;ƵŶůŝŐĂƚĞĚͿĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƐŽĨŵŝĐĞ͘(F) YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨϰϱ^нĐĞůůƐĂƌŽƵŶĚƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌŝŽůĞƐŝŶƚŚĞĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞŽĨ'^KͲŽŶƚƌŽůŽƌ'^KͲ DĞĨϮĂƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ͕ϭϰĚĂLJƐĂŌĞƌŝŶĚƵĐƟŽŶŽĨŝƐĐŚĞŵŝĂ͘&ƌŽŵĞĂĐŚŵƵƐĐůĞ͕ϴƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞŝŵĂŐĞƐǁĞƌĞƵƐĞĚĨŽƌƋƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶ͘

ĂƚĂĂƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚĂƐŵĞĂŶц^D͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͕ΎƉфϬ͘ϬϬϭ͕ΎΎΎƉфϬ͘ϬϬϬϱ͘

/ŶǀŝǀŽĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐƵƉŽŶDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶ

ĂƉŝůůĂƌLJĨŽƌŵĂƟŽŶǁĂƐĞǀĂůƵĂƚĞĚŝŶƚŚĞůĞŌ;ŝƐĐŚĞŵŝĐͿĂŶĚƌŝŐŚƚ;ŶŽƌŵŽdžŝĐͿƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐŽĨ'^KͲ ƚƌĞĂƚĞĚ ŵŝĐĞ͕ ϭϰ ĚĂLJƐ ĂŌĞƌ ŝŶĚƵĐƟŽŶ ŽĨ ŝƐĐŚĞŵŝĂ͘ DƵƐĐůĞ ƟƐƐƵĞƐ ǁĞƌĞ ƐƚĂŝŶĞĚ ǁŝƚŚ ĂŶƟͲϯϭ ƚŽ

ǀŝƐƵĂůŝnjĞĐĂƉŝůůĂƌŝĞƐ͘/ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨDĞĨϮĂŝŶĐƌĞĂƐĞĚĐĂƉŝůůĂƌLJĨŽƌŵĂƟŽŶŝŶƚŚĞƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐŽĨƚŚĞƐĞ

ŵŝĐĞ;ϭ͘ϰĨŽůĚ͕ƉсϬ͘ϬϰͿĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽƚŚĞƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐŽĨ'^KͲĐŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚŵŝĐĞ;&ŝŐ͘ϱͿ͘tĞĂůƐŽ

6

ŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞĚƚŚĞĞīĞĐƚŽĨDĞĨϮĂŝŶŚŝďŝƟŽŶŽŶex vivo ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐƵƐŝŶŐĂŽƌƟĐĞdžƉůĂŶƚƐ͘'^KŵĞĚŝĂƚĞĚ

ŝŶŚŝďŝƟŽŶŽĨDĞĨϮĂůĞĚƚŽĂŵŝůĚŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶƚŚĞŶƵŵďĞƌŽĨƐƉƌŽƵƚƐĨƌŽŵĂŽƌƟĐĞdžƉůĂŶƚƐ͕ĐŽŵƉĂƌĞĚƚŽ

'^KͲŽŶƚƌŽů;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐ͘ϭͿ͘

Figure 5. In vivo ĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ ĂŌĞƌ DĞĨϮĂ ŝŶŚŝďŝƟŽŶ͘ ;Ϳ ZĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ ŝŵĂŐĞƐ ŽĨ ϯϭ ƐƚĂŝŶŝŶŐ ŝŶ ƚŚĞ ƌŝŐŚƚ ;ŶŽŶͲŝƐĐŚĞŵŝĐͿ

ĂŶĚůĞŌ;ŝƐĐŚĞŵŝĐͿƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞƐŽĨϱϳůͬϲŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲDĞĨϮĂ;ŶсϭϬĂŶŝŵĂůƐͿŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽů;ŶсϭϭĂŶŝŵĂůƐͿ͘(B) YƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶŽĨƚŚĞĐĂƉŝůůĂƌLJĚĞŶƐŝƚLJŝŶƚŚĞƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞ͕ĚĞĮŶĞĚĂƐƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶϯϭ^нĂƌĞĂďĞƚǁĞĞŶůĞŌĂŶĚƌŝŐŚƚƐŽůĞƵƐ

ŵƵƐĐůĞƐ͕ƐŚŽǁŶĂƐƉĞƌĐĞŶƚĂŐĞƌĞůĂƟǀĞƚŽƚŚĞŝŶĐƌĞĂƐĞŝŶŵŝĐĞƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲŽŶƚƌŽů͘&ƌŽŵĞĂĐŚƐŽůĞƵƐŵƵƐĐůĞ͕ϲƌĞƉƌĞƐĞŶƚĂƟǀĞ

ƉŚŽƚŽŐƌĂƉŚƐǁĞƌĞƵƐĞĚĨŽƌƋƵĂŶƟĮĐĂƟŽŶ͘ĂƚĂĂƌĞƉƌĞƐĞŶƚĞĚĂƐŵĞĂŶц^D͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ͘

Mef2a targets miR-329 of the 14q32 microRNA cluster

tĞĚĞƚĞƌŵŝŶĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϴϳď͕ŵŝZͲϰϵϰ͕ŵŝZͲϰϵϱĂŶĚŵŝZͲϰϭϬ

ŝŶ ƚŚĞ ĂĚĚƵĐƚŽƌ ŵƵƐĐůĞƐ ŽĨ '^KͲDĞĨϮĂ ĂŶĚ '^KͲŽŶƚƌŽů ƚƌĞĂƚĞĚ ŵŝĐĞ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ DĞĨϮĂ ůĞĚ ƚŽ

ƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϯϮϵ;&ŝŐ͘ϲ͕ƉсϬ͘ϬϬϮϲͿĂŶĚĂďŽƌĚĞƌůŝŶĞƐŝŐŶŝĮĐĂŶƚ

ĚŽǁŶƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨŵŝZͲϰϵϰ;&ŝŐ͘ϲ͕ƉсϬ͘ϬϲͿ͘,ŽǁĞǀĞƌ͕ĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϰϴϳď͕

ŵŝZͲϰϭϬĂŶĚŵŝZͲϰϵϱǁĂƐŶŽƚŝŶŚŝďŝƚĞĚŝŶĂŶŝŵĂůƐƚƌĞĂƚĞĚǁŝƚŚ'^KͲDĞĨϮĂ;&ŝŐ͘ϲͲͿ͘DŝĐƌŽZEƐ

ĂƌĞƚƌĂŶƐĐƌŝďĞĚĂƐƉƌŝŵĂƌLJŵŝĐƌŽZEƐ;ƉƌŝͲŵŝZƐͿďĞĨŽƌĞďĞŝŶŐƉƌŽĐĞƐƐĞĚŝŶƚŽƉƌĞͲŵŝĐƌŽZEƐ;ƉƌĞͲ ŵŝZƐͿ ĂŶĚ ƐƵďƐĞƋƵĞŶƚůLJ ŝŶƚŽ ŵĂƚƵƌĞ ŵŝĐƌŽZEƐ͘ dŽ ĚĞƚĞƌŵŝŶĞ ǁŚĞƚŚĞƌ DĞĨϮĂ ĚŽĞƐ ŝŶŇƵĞŶĐĞ

ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶŽĨŵƵůƟƉůĞϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ͕ǁĞĂůƐŽŵĞĂƐƵƌĞĚĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƚŚĞƉƌŝͲŵŝZƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐ

ĂŶĚƚŚĞŝŶƚĞƌŵĞĚŝĂƚĞƉƌĞͲŵŝZƐŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨ'^KͲƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͘EŽĚŝīĞƌĞŶĐĞƐǁĞƌĞ

ϭϳϰ

ŽďƐĞƌǀĞĚŝŶƉƌŝͲŵŝZĂŶĚƉƌĞͲŵŝZůĞǀĞůƐŽĨĂŶLJŽĨƚŚĞŵŝĐƌŽZEƐďĞƚǁĞĞŶ'^KͲDĞĨϮĂĂŶĚ'^KͲĐŽŶƚƌŽů

ƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐ͕ŝŶĚŝĐĂƟŶŐƚŚĂƚƚŚĞƌĞŐƵůĂƟŽŶŽĨŵĂƚƵƌĞŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϰůĞǀĞůƐǁĂƐŝŶĚŝƌĞĐƚ

;&ŝŐ͘ϳͿ͘

&ŝŐƵƌĞϲ͘ZĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶin vivo.džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ(A)͕ŵŝZͲϰϵϰ(B), ŵŝZͲϰϴϳď

(C)͕ŵŝZͲϰϭϬ(D)ĂŶĚŵŝZͲϰϵϱ(E)ŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨ'^KͲDĞĨϮĂŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐĂƚϭϰĚĂLJƐĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵď

ŝƐĐŚĞŵŝĂ͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨϰŵŝĐĞǁĂƐƵƐĞĚ͘DĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞƌĞůĂƟǀĞƚŽĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨ

ůĞƚͲϳĐ;ц^DͿ͘ΎƉфϬ͘Ϭϱ

DĞĨϮĂďŝŶĚƐƚŽƚŚĞƉƌŝͲŵŝZƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEŵŝZͲϰϵϰ͕ďƵƚŶŽƚŵŝZͲϰϴϳď

dŽŝŶǀĞƐƟŐĂƚĞǁŚĞƚŚĞƌDĞĨϮĂĐŽƵůĚƌĞŐƵůĂƚĞƉŽƐƚͲƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůƉƌŽĐĞƐƐŝŶŐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐ͕ǁĞ

ƉĞƌĨŽƌŵĞĚZEďŝŶĚŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶ;Z/WͿĂƐƐĂLJƐ͘Z/WĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚƐŽŶϯdϯĐĞůůůLJƐĂƚĞƐ

ƉĞƌĨŽƌŵĞĚǁŝƚŚĂŶƟͲD&ϮĂŶƟďŽĚŝĞƐĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞĚƐƉĞĐŝĮĐďŝŶĚŝŶŐŽĨD&ϮƚŽƚŚĞƉƌŝͲŵŝZͲϰϵϰ

ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚ͕ďƵƚŶŽƚƚŽƚŚĞƉƌŝͲŵŝZͲϰϴϳďƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚ;^ƵƉƉůĞŵĞŶƚĂů&ŝŐ͘ϮͿ͘džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƉƌŝͲŵŝZͲϯϮϵǁĂƐ

ƚŽŽůŽǁƚŽĐŽŶĮƌŵŽƌĞdžĐůƵĚĞD&ϮďŝŶĚŝŶŐŝŶƚŚĞƐĞĐĞůůƐ͘

6

&ŝŐƵƌĞϳ͘ZĞŐƵůĂƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮƉƌŝͲŵŝZĂŶĚƉƌĞͲŵŝZĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶin vivo. (A) džƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƉƌŝͲŵŝZĂŶĚƉƌĞͲŵŝZƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐŽĨϭϰƋϯϮ

ŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϴϳď͕ŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨ'^KͲDĞĨϮĂŽƌ'^KͲŽŶƚƌŽůƚƌĞĂƚĞĚĂŶŝŵĂůƐĂƚ

ϭϰĚĂLJƐĂŌĞƌŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂ͘WĞƌŐƌŽƵƉ͕ĂĚĚƵĐƚŽƌŵƵƐĐůĞƟƐƐƵĞŽĨϭϭŵŝĐĞǁĂƐƵƐĞĚ͘DĞĂŶĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶůĞǀĞůƐĂƌĞƐŚŽǁŶŚĞƌĞ

ƌĞůĂƟǀĞƚŽĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨƐŶZEͲhϲ;ц^DͿ͘(B) ZEďŝŶĚŝŶŐƉƌŽƚĞŝŶŝŵŵƵŶŽƉƌĞĐŝƉŝƚĂƟŽŶǁŝƚŚĞŝƚŚĞƌD&ϮĂŶƟďŽĚŝĞƐŽƌŶĞŐĂƟǀĞ

ĐŽŶƚƌŽůƌĂďďŝƚ/Ő'ĨŽůůŽǁĞĚďLJƌƚͬƋWZŽŶƉƌŝͲŵŝZƚƌĂŶƐĐƌŝƉƚƐŽĨϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϰϵϰĂŶĚŵŝZͲϰϴϳď͘ĂƚĂĂƌĞŶŽƌŵĂůŝnjĞĚ

ĂŐĂŝŶƐƚϭϬйŝŶƉƵƚ͘

ϭϳϲ

Discussion

tĞ ĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞ ŚĞƌĞ ƚŚĂƚ ƚŚĞ DĞĨϮĂ ƚƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶ ĨĂĐƚŽƌ ƉůĂLJƐ Ă ƌŽůĞ ŝŶ ƉŽƐƚͲŝƐĐŚĞŵŝĐ

ŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶ͘ /ŶŚŝďŝƟŽŶ ŽĨ D&Ϯ ŝŵƉƌŽǀĞĚ ďůŽŽĚ ŇŽǁ ƌĞĐŽǀĞƌLJ ŝŶ ĂŶŝŵĂůƐ ĂŌĞƌ ƵŶŝůĂƚĞƌĂů

ůŝŐĂƟŽŶŽĨƚŚĞĨĞŵŽƌĂůĂƌƚĞƌLJ͘WƌĞǀŝŽƵƐƌĞƉŽƌƚƐŚĂǀĞĚĞŵŽŶƐƚƌĂƚĞĚƚŚĞƌŽůĞŽĨDĞĨϮĂŝŶŽƚŚĞƌĨŽƌŵƐŽĨ

ǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞůůŝŶŐĂƐǁĞůů͘KŶĞƐƚƵĚLJƐŚŽǁĞĚƚŚĂƚƚŚĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŽĨD&ϮŵĞŵďĞƌƐDĞĨϮĂ͕DĞĨϮď

ĂŶĚDĞĨϮĚǁĂƐŝŶĐƌĞĂƐĞĚŝŶƚŚĞŶĞŽŝŶƟŵĂŽĨƌĂƚĐĂƌŽƟĚĂƌƚĞƌŝĞƐĂŌĞƌďĂůůŽŽŶŝŶũƵƌLJ

͘/ŶĂŶŽƚŚĞƌ

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6

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ĂŶĚƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶĂƐǁĞůůĂƐƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͘

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ĂŶĚƉƌŽǀŝĚĞƐĂůŝŶŬďĞƚǁĞĞŶD&Ϯ͕ϭϰƋϯϮŵŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵĂŶĚŵŝZͲϰϵϰĂŶĚĂƌƚĞƌŝŽŐĞŶĞƐŝƐĂŶĚ

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D&ϮĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŵĂLJďĞĂƉƌŽŵŝƐŝŶŐƚŚĞƌĂƉĞƵƟĐƐƚƌĂƚĞŐLJƚŽŝŶĐƌĞĂƐĞŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌŝnjĂƟŽŶĂŶĚďůŽŽĚ

ŇŽǁƚŽǁĂƌĚƐƚŚĞĞdžƚƌĞŵŝƟĞƐŝŶƉĂƟĞŶƚƐǁŝƚŚW͘

Acknowledgements

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References

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Ϯ͘ ZŝƐĂƵt͘DĞĐŚĂŶŝƐŵƐŽĨĂŶŐŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͘EĂƚƵƌĞ͘ϭϵϵϳ͖ϯϴϲ͗ϲϳϭͲϲϳϰ͘

ϯ͘ ĂƌƚĞů͕͘W͘DŝĐƌŽZEƐ͗ŐĞŶŽŵŝĐƐ͕ďŝŽŐĞŶĞƐŝƐ͕ŵĞĐŚĂŶŝƐŵ͕ĂŶĚĨƵŶĐƟŽŶ͘Cell 116͕ϮϴϭͲϮϵϳ;ϮϬϬϰͿ͘

ϰ͘ ǀĂŶZŽŽŝũ͘ΘKůƐŽŶ͕͘E͘DŝĐƌŽZEƚŚĞƌĂƉĞƵƟĐƐĨŽƌĐĂƌĚŝŽǀĂƐĐƵůĂƌĚŝƐĞĂƐĞ͗ŽƉƉŽƌƚƵŶŝƟĞƐĂŶĚŽďƐƚĂĐůĞƐ͘Nat. Rev.

Drug Discov. 11͕ϴϲϬͲϴϳϮ;ϮϬϭϮͿ͘

ϱ͘ KŶŽ͕<͕͘<ƵǁĂďĂƌĂ͕z͕͘Θ,ĂŶ͕:͘DŝĐƌŽZEƐĂŶĚĐĂƌĚŝŽǀĂƐĐƵůĂƌĚŝƐĞĂƐĞƐ͘FEBS J. 278͕ϭϲϭϵͲϭϲϯϯ;ϮϬϭϭͿ͘

ϲ͘ dŚƵŵ͕d͘ΘŽŶĚŽƌĞůůŝ͕'͘>ŽŶŐŶŽŶĐŽĚŝŶŐZEƐĂŶĚŵŝĐƌŽZEƐŝŶĐĂƌĚŝŽǀĂƐĐƵůĂƌƉĂƚŚŽƉŚLJƐŝŽůŽŐLJ͘Circ. Res. 116͕ϳϱϭͲ

 ϳϲϮ;ϮϬϭϱͿ͘

ϳ͘ ŽŽŶ͕Z͘͘ΘŝŵŵĞůĞƌ͕^͘DŝĐƌŽZEƐŝŶŵLJŽĐĂƌĚŝĂůŝŶĨĂƌĐƟŽŶ͘Nat. Rev. Cardiol. 12͕ϭϯϱͲϭϰϮ;ϮϬϭϱͿ͘

ϴ͘ &ĞŝŶďĞƌŐ͕D͘t͘ΘDŽŽƌĞ͕<͘:͘DŝĐƌŽZEZĞŐƵůĂƟŽŶŽĨƚŚĞƌŽƐĐůĞƌŽƐŝƐ͘Circ. Res. 118͕ϳϬϯͲϳϮϬ;ϮϬϭϲͿ͘

ϵ͘ tĞůƚĞŶ͕^͘D͕͘'ŽŽƐƐĞŶƐ͕͕͘͘YƵĂdž͕W͘,͕͘ΘEŽƐƐĞŶƚ͕͘z͘dŚĞŵƵůƟĨĂĐƚŽƌŝĂůŶĂƚƵƌĞŽĨŵŝĐƌŽZEƐŝŶǀĂƐĐƵůĂƌƌĞŵŽĚĞů

 ůŝŶŐ͘Cardiovasc. Res.;ϮϬϭϲͿ͘

10. Welten,S.M. et al./ŶŚŝďŝƟŽŶŽĨϭϰƋϯϮDŝĐƌŽZEƐŵŝZͲϯϮϵ͕ŵŝZͲϰϴϳď͕ŵŝZͲϰϵϰ͕ĂŶĚŵŝZͲϰϵϱŝŶĐƌĞĂƐĞƐŶĞŽǀĂƐĐƵůĂƌ

 ŝnjĂƟŽŶĂŶĚďůŽŽĚŇŽǁƌĞĐŽǀĞƌLJĂŌĞƌŝƐĐŚĞŵŝĂ͘Circ. Res. 115͕ϲϵϲͲϳϬϴ;ϮϬϭϰͿ͘

ϭϭ͘ ^Ğŝƚnj͕,͘et al.ůĂƌŐĞŝŵƉƌŝŶƚĞĚŵŝĐƌŽZEŐĞŶĞĐůƵƐƚĞƌĂƚƚŚĞŵŽƵƐĞůŬϭͲ'ƚůϮĚŽŵĂŝŶ͘Genome Res. 14͕ϭϳϰϭͲϭϳϰϴ

 ;ϮϬϬϰͿ͘

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 >ŽĐƵƐWƌŽŵŽƚĞĂƌĚŝŽŵLJŽĐLJƚĞWƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶďLJdĂƌŐĞƟŶŐƚŚĞdƌĂŶƐĐƌŝƉƟŽŶĂůŽĂĐƟǀĂƚŽƌŝƚĞĚϮ͘J. Biol. Chem. ϮϵϬ,

 ϮϯϭϲϮͲϮϯϭϳϮ;ϮϬϭϱͿ͘

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 ďLJĮŶĞͲƚƵŶŝŶŐWƵŵŝůŝŽϮƉƌŽƚĞŝŶůĞǀĞůƐ͘EMBO J. 28͕ϲϵϳͲϳϭϬ;ϮϬϬϵͿ͘

ϭϱ͘ ĚŵŽŶĚƐŽŶ͕͘'͕͘>LJŽŶƐ͕'͕͘͘DĂƌƟŶ͕:͘&͕͘ΘKůƐŽŶ͕͘E͘DĞĨϮŐĞŶĞĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶŵĂƌŬƐƚŚĞĐĂƌĚŝĂĐĂŶĚƐŬĞůĞƚĂůŵƵƐĐůĞ

 ůŝŶĞĂŐĞƐĚƵƌŝŶŐŵŽƵƐĞĞŵďƌLJŽŐĞŶĞƐŝƐ͘Development ϭϮϬ͕ϭϮϱϭͲϭϮϲϯ;ϭϵϵϰͿ͘

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 ϰϭϰϬ;ϮϬϬϳͿ͘

ϭϳ͘ ,ĂLJĂƐŚŝ͕D͘et al.dĂƌŐĞƚĞĚĚĞůĞƟŽŶŽĨD<ϭͬZ<ϱŝŶĂĚƵůƚŵŝĐĞƉĞƌƚƵƌďƐǀĂƐĐƵůĂƌŝŶƚĞŐƌŝƚLJĂŶĚůĞĂĚƐƚŽĞŶĚŽƚŚĞůŝĂů

 ĨĂŝůƵƌĞ͘J. Clin. Invest 113͕ϭϭϯϴͲϭϭϰϴ;ϮϬϬϰͿ͘

ϭϴ͘ &ŝƌƵůůŝ͕͘͘et al.DLJŽĐLJƚĞĞŶŚĂŶĐĞƌďŝŶĚŝŶŐĨĂĐƚŽƌͲϮĞdžƉƌĞƐƐŝŽŶĂŶĚĂĐƟǀŝƚLJŝŶǀĂƐĐƵůĂƌƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƐ͘ƐƐŽĐŝĂ

 ƟŽŶǁŝƚŚƚŚĞĂĐƟǀĂƚĞĚƉŚĞŶŽƚLJƉĞ͘Circ. Res. 78͕ϭϵϲͲϮϬϰ;ϭϵϵϲͿ͘

ϭϵ͘ ŚĂŽ͕t͕͘ŚĂŽ͕^͘W͕͘ΘWĞŶŐ͕͘Y͘dŚĞĞīĞĐƚƐŽĨŵLJŽĐLJƚĞĞŶŚĂŶĐĞƌĨĂĐƚŽƌϮŐĞŶĞŽŶƚŚĞƉƌŽůŝĨĞƌĂƟŽŶ͕ŵŝŐƌĂƟŽŶĂŶĚ

 ƉŚĞŶŽƚLJƉĞŽĨǀĂƐĐƵůĂƌƐŵŽŽƚŚŵƵƐĐůĞĐĞůůƐ͘Cell Biochem. Funct. ϯϬ͕ϭϬϴͲϭϭϯ;ϮϬϭϮͿ͘

ϮϬ͘ ^ƵnjƵŬŝ͕͘et al.DLJŽĐLJƚĞĞŶŚĂŶĐĞƌĨĂĐƚŽƌϮŵĞĚŝĂƚĞƐǀĂƐĐƵůĂƌŝŶŇĂŵŵĂƟŽŶǀŝĂƚŚĞƉϯϴͲĚĞƉĞŶĚĞŶƚƉĂƚŚǁĂLJ͘Circ. Res.

95͕ϰϮͲϰϵ;ϮϬϬϰͿ͘

Ϯϭ͘ ŚĂŽ͕t͕͘ŚĞŶŐ͕y͘>͕͘WĞŶŐ͕͘Y͕͘ΘŚĂŽ͕^͘W͘DLJŽĐLJƚĞŶŚĂŶĐĞƌ&ĂĐƚŽƌϮZĞŐƵůĂƚĞƐ,LJĚƌŽŐĞŶWĞƌŽdžŝĚĞͲ/ŶĚƵĐĞĚ 

 ^ĞŶĞƐĐĞŶĐĞŽĨsĂƐĐƵůĂƌ^ŵŽŽƚŚDƵƐĐůĞĞůůƐsŝĂŵŝĐƌŽZEͲϭϰϯ͘J. Cell Physiol ϮϯϬ͕ϮϮϬϮͲϮϮϭϭ;ϮϬϭϱͿ͘

ϮϮ͘ ^ĐŚŝƌŵĞƌ͕^͘,͕͘ǀĂŶEŽŽŝũĞŶ͕&͕͘͘WŝĞŬ͕:͘:͕͘ΘǀĂŶ͕Z͘E͘^ƟŵƵůĂƟŽŶŽĨĐŽůůĂƚĞƌĂůĂƌƚĞƌLJŐƌŽǁƚŚ͗ƚƌĂǀĞůůŝŶŐĨƵƌƚŚĞƌĚŽǁŶ

 ƚŚĞƌŽĂĚƚŽĐůŝŶŝĐĂůĂƉƉůŝĐĂƟŽŶ͘Heart 95͕ϭϵϭͲϭϵϳ;ϮϬϬϵͿ͘

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 ŚŝŶĚůŝŵďŝƐĐŚĞŵŝĂŵŽĚĞů͘PLoS. One. 9͕ĞϵϵϴϴϮ;ϮϬϭϰͿ͘

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