Kwalitatieve analyse: identificatie van epoxyvetzuur pieken

Uit een meervoudig onverzadigd vetzuur kunnen meerdere epoxyvetzuren gevormd worden tijdens de oxidatie. Concreet werd gefocust op de epoxyvetzuren die uit EPA en DHA kunnen ontstaan omdat uit de vetzuursamenstelling van de visstalen (paragraaf 4.1) volgt dat deze een belangrijk aandeel vertegenwoordigen binnen PUFA. In theorie kan EPA met vijf dubbele bindingen op vijf plaatsen epoxidatie ondergaan, DHA kan dit op zes verschillende plaatsen. In deze studie werden enkel mono-epoxyvetzuren onderzocht. Dit omdat de complexiteit van de fragmentatiepatronen en massaspectra sterkt toeneemt indien het aantal epoxygroepen toeneemt. De standaarden van EPA en DHA werden na epoxidatie gescreend op de aanwezigheid van verschillende mono-epoxyvetzuren aan de hand van de elutievolgorde op de kolom en fragmentionen uit het massaspectrum (MS). Hiervoor werden eerst de mogelijke fragmentatiepatronen onderzocht aan de hand van massaspectra door Christie beschreven (Christie, 2018). Daarna werd ook onderzoek gedaan naar de aanwezigheid van epoxyvetzuren afgeleid van EPA en DHA in de stalen.

4.2.1.1 Methylesters van mono-epoxyvetzuren gevormd uit methy-EPA

Figuur 4.6 geeft het chromatogram weer van de methylesters van mono- epoxyvetzuren gevormd uit geëpoxideerde methyl-EPA standaard.

Figuur 4.6: Chromatogram van methylesters van mono-epoxyvetzuren gevormd uit methyl-EPA standaard.

Het chromatogram vertoont negen pieken in een retentietijd gebied van 37 minuten tot 43 minuten. Ten opzichte van de retentietijd van methyl-EPA (25,8 minuten, aanwezig in GLC 68D referentiestandaard) viel op dat de mogelijke afgeleide epoxyvetzuren van EPA veel later elueren uit de kolom. De pieken kunnen geïdentificeerd worden aan de hand van de fragmentatiepatronen voor epoxyvetzuren. Christie beschrijft deze fragmentatiepatronen voor C18:1 en C18:2 (Christie, 2018). Op basis van deze informatie konden de fragmentatie ionen berekend worden voor EPA afgeleide epoxyvetzuren. Figuur 4.7 geeft dit weer voor methyl-17,18-epoxy-eicosatetraenoaat.

42 Figuur 4.7: Fragmentatiepatroon van methyl-17,18-epoxy-eicosatetraenoaat.

Bij elk isomeer kunnen telkens verschillende fragmentatiepatronen aanwezig zijn. Zo kan een splitsing links en rechts van de epoxyring optreden. Uit bevindingen van Christie (2018) bleek dat indien de splitsing rechts van de epoxygroep gebeurt (afsplitsen fragment aan het ω-uiteinde), gelijktijdig ook methanol afgesplitst wordt (rood in figuur 4.7a). Dit gebeurt niet indien links van de epoxygroep gesplitst wordt (blauw in figuur 4.7a). Ook de epoxygroep zelf kan afgesplitst worden met 42 als typerende m/z-waarde (4.7b). Daarnaast kan ook ringopening en afsplitsing ontstaan (4.7c). Op analoge wijze kunnen de fragmentionen voor de vier andere methylesters van epoxyvetzuren gevormd uit methyl-EPA voorspeld worden. Tabel 4.16 geeft per epoxyvetzuur de verwachte fragmentionen weer.

Tabel 4.16: Verwachte fragmentionen per methyl-EPA afgeleid epoxyvetzuur.

Epoxyvetzuur Fragmentionen [m/z] Methyl-5,6-epoxy-eicosatetraenoaat 332, 301, 189, 112, 31, 231, 101, 42, 202, 130, 218, 114 Methyl-8,9-epoxy-eicosatetraenoaat 332, 301, 152, 149, 31, 191, 141, 42, 170, 162, 178, 154 Methyl-11,12-epoxy-eicosatetraenoaat 332, 301, 192, 109, 31, 181, 151, 42, 210, 122, 194, 138 Methyl-14,15-epoxy-eicosatetraenoaat 332, 301, 232, 69, 31, 221, 111, 42, 250, 82, 234, 98 Methyl-17,18-epoxy-eicosatetraenoaat 332, 301, 272, 31, 29, 261, 71, 42, 274, 58, 290 Cursief: Moleculair ion M en M-31.

De aanwezigheid van deze fragmentionen werd onderzocht in elk massaspectrum bekomen per piek. Figuur 4.8 geeft het massaspectrum weer voor piek 1 en piek 2 afkomstig van het chromatogram van geëpoxideerde methyl-EPA standaard.

Figuur 4.8: Massaspectrum van piek 1 en 2 afgeleid uit het chromatogram van geëpoxideerde methyl-EPA standaard.

De m/z waarden die in hoogste abundantie voorkwamen zijn 41, 55, 67, 79, 91 en 105. Uit vergelijken van de verschillende massaspectra van de negen pieken bleken deze fragmentionen echter in alle pieken aanwezig te zijn. Hierdoor werden deze beschouwd als niet karakteristiek. De karakteristieke ionen per EPA afgeleid epoxyvetzuur kwamen in veel lagere abundantie voor. Het moleculaire ion (m/z 332) werd in geen van de massaspectra teruggevonden. Het moleculaire ion na verlies van methanol (M-31, m/z 301) werd wel terug gevonden in de massaspectra. Dit werd echter niet gebruikt voor de identificatie aangezien dit bij alle EPA afgeleide epoxyvetzuren voorkomt. Tabel 4.17 geeft per methyl-EPA afgeleid epoxy-isomeer de bijhorende geïdentificeerde piek weer. De fragmentionen die vetgedrukt staan werden gebruikt voor de identificatie. De andere meest voorkomende fragmentionen in het massaspectrum werden ook opgenomen in de tabel. Tussen haakjes is telkens de relatieve abundantie per fragmention weergegeven, bepaald ten opzichte van de hoogst voorkomende abundantie.

44 Tabel 4.17: Massaspectra ionen voor methyl-epoxyvetzuren afkomstig van geëpoxideerde methyl-EPA standaard.

Uit onderzoek van de massaspectra bleek methyl-17,18-epoxy-eicosatetreenoaat niet gedetecteerd te zijn in de epoxyfractie. De vier andere epoxyvetzuren afgeleid van EPA werden wel gedetecteerd. Op de gebruikte kolom (CP-sil 88) elueerde telkens eerst het trans-isomeer en vervolgens het cis-isomeer van een bepaalde component (Mubiru, Shrestha, Papastergiadis, & De Meulenaer, 2013). Bij de methyl-EPA afgeleide epoxyvetzuren elueerde de cis-component telkens 0,5 tot 0,6 minuten na de trans-component. Figuur 4.9 geeft het verschil in structuur tussen cis- en trans-epoxyvetzuren weer toegepast op methyl-14,15-epoxy-eicosatetraenoaat.

Figuur 4.9: Verschil in cis- en trans-isomerie toegepast op methyl-14,15-epoxy- eicosatetraenoaat.

Epoxyvetzuur Piek Fragmentionen [m/z] (relatieve abundantie %)

Methyl-5,6-epoxy-eicosatetraenoaat 8 (trans) 231(2), 189(2), 131(30), 130(4), 117(30), 114(1), 112(4), 105(42), 101(6), 99(32), 93(41), 91(78), 80(30), 77(40), 67(51), 55(51), 41(49) 9 (cis) 231(1), 218 (1), 202(1), 189(1), 130(8), 117(40), 106(38), 105(48), 101(1), 93(43), 91(100), 80(30), 79(81), 77(45), 67(47), 41(48) Methyl-8,9-epoxy-eicosatetraenoaat 5 (trans) 191(2), 178(2), 162(2), 149(5), 141(4), 119(38), 106(32), 105(57), 93(58), 91(93), 81(43), 80(35), 79(100), 77(42), 67(67), 55(57), 41(67) 6 (trans) 191(4), 178(2), 162(3), 152(1), 149(9), 141(2), 106(34), 105(30), 93(44), 91(59), 67(58), 55(38), 41(44) 7 (cis) 191(1), 178(1), 170(1), 162(1), 152(2), 149(5), 141(3), 105(43), 95(39), 93(38), 91(56), 81(44), 80(32), 79(100), 55(42), 41(50) Methyl-11,12-epoxy-eicosatetraenoaat 3 (trans) 109(14), 107(34), 106(40), 105(31), 93(50), 91(56), 81(39), 79(100), 77(40), 67(70), 55(44), 43(32), 41(56), 32(30) 4 (cis) 151(7), 122(7), 109(12), 107(34), 105(51), 95(46), 93(40), 91(70), 81(48), 80(34), 79(100), 77(39), 67(66), 55(44), 43(31), 41(56) Methyl-14,15-epoxy-eicosatetraenoaat 1 (trans) 354(32), 133(34), 119(36), 111(21), 107(33), 105(63), 93(64), 91(100), 81(38), 79(84), 77(58), 69(30), 67(59), 55(61), 41(84), 32(48) 2 (cis) 131(32), 117(44), 111(2), 106(44), 105(49), 98(2), 93(44), 91(100), 82(4), 80(35), 79(83), 77(45), 69(10), 67(49), 41(51) Methyl-17,18-epoxy-eicosatetraenoaat / /

De karakteristieke ionen waarmee het epoxyvetzuur geïdentificeerd werd in de piek zijn vetgedrukt, de andere meest voorkomende ionen zijn weergegeven in normaal lettertype.

De eerste twee pieken zijn afkomstig van methyl-14,15-epoxy-eicosatetraenoaat hiervoor werden 69, 82, 98 en 111 als karakteristieke m/z-waarden gevonden in piek 2 (cis). Zowel m/z 82 als m/z 98 werden gevormd bij een opening van de epoxyring. Piek 1 bevatte echter slechts enkel 69 en 111, deze m/z-waarden hadden echter een grote relatieve abundantie. In combinatie met het verschil in retentietijd met piek 2 (verschil in RT tussen piek 1 en piek 2 was 0,6 minuten) kon piek 1 geïdentificeerd worden als methyl-trans-14,15-epoxy-eicosatetraenoaat. Methyl-11,12-epoxy- eicosatetraenoaat werd geïdentificeerd als piek 3 (trans) aan de hand van de m/z- waarden 109, 122 en 151 die in hogere relatieve abundantie voorkwamen. Piek 4 werd geïdentificeerd als het cis-isomeer aan de hand van m/z 109 dit kwam in hoge relatieve abundantie voor. Het verschil in RT tussen piek 3 en piek 4 was 0,5 minuten, dit toonde aan dat piek 3 en 4 cis-trans isomeren waren. Piek 5 en 6 bevatten beiden de m/z-waarden 191, 178, 162, 149, 141. Ook andere niet karakteristieke ionen kwamen in gelijkaardige relatieve abundantie voor in deze pieken. Hierdoor konden beide pieken gelinkt worden aan methyl-trans-8,9-epoxy- eicosatetraenoaat. Piek 7 werd geïdentificeerd als het cis-isomeer van dit epoxyvetzuur aan de hand van m/z 191, 178, 170, 162, 152, 149, 141. Het verschil in RT tussen piek 5 en piek 7 was 0,6 minuten, tussen piek 5 en piek 7 was dit 0,4 minuten. De laatste twee pieken van de geëpoxideerde EPA standaard werden geïdentificeerd als methyl-5,6-epoxy-eicosatetraenoaat door m/z 231, 189, 130, 114, 112 en 101 (trans, piek 8). Bij methyl-cis-5,6-epoxy-eicosatetraenoaat (piek 9) kon bovendien ook m/z 218 en 202 als karakteristieke ionen teruggevonden worden. Ook tussen piek 8 en 9 was het verschil in retentietijd 0,5 minuten wat wijst op cis-trans isomerie.

46

4.2.1.2 Methylesters van mono-epoxyvetzuren gevormd uit methy-DHA

Figuur 4.10 geeft het chromatogram van de methylesters van mono-epoxyvetzuren gevormd uit geëpoxideerde methyl-DHA standaard weer.

Figuur 4.10: Chromatogram van methylesters van mono-epoxyvetzuren gevormd uit methyl- DHA standaard.

Het chromatogram vertoont acht pieken in een retentietijd gebied van 54 tot 63 minuten. Ten opzichte van de retentietijd van methyl-DHA (30,8 minuten, aanwezig in GLC 68D referentiestandaard) viel op dat de mogelijke afgeleide epoxyvetzuren van DHA veel later elueren uit de kolom.

Aan de hand van de door Christie (2018) beschreven fragmentatiepatronen voor C18:1 en C18:2 konden de karakteristieke fragmentatie ionen voor methyl-DHA afgeleide epoxyvetzuren berekend worden. Figuur 4.11 illustreert dit voor methyl- 16,17-epoxy-docosapentaenoaat.

Figuur 4.11: Fragmentatiepatroon van methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat.

Analoog aan fragmentatiepatronen bij epoxyvetzuren, afgeleid van methyl-EPA, is bij epoxyvetzuren afkomstig van methyl-DHA splitsing met en zonder methanolverlies mogelijk. Deze splitsing kan ofwel links van de epoxygroep ofwel rechts van de epoxygroep plaatsvinden, methanol werd enkel afgesplitst bij een splitsing rechts van de epoxygroep (rood in figuur 4.11a). Daarnaast kon ook gelijktijdig links en rechts gesplitst worden (4.11c) en kon de epoxyring openen met splitsing (4.11c). Op analoge manier konden karakteristieke ionen voor de vijf andere plaatsisomeren van geëpoxideerd DHA voorspeld worden. Tabel 4.18 geeft deze karakteristieke ionen weer.

Tabel 4.18: Verwachte fragmentionen per methyl-DHA afgeleid epoxyvetzuur.

De aanwezigheid van deze fragmentionen werd onderzocht in elk massaspectrum bekomen per piek. Figuur 4.12 geeft het massaspectrum weer voor piek 1 en piek 2 bekomen uit het chromatogram van de geëpoxideerde methyl-DHA standaard.

Epoxyvetzuur Fragmentionen [m/z] Methyl-4,5-epoxy-docosapentaenoaat 358, 327, 229, 98, 31, 271, 87,42, 242, 116, 258, 100 Methyl-7,8-epoxy-docosapentaenoaat 358, 327, 189, 138, 31, 231, 127, 42, 202, 156, 218, 140 Methyl-10,11-epoxy-docosapentaenoaat 358, 327, 178, 149, 31, 191, 167,42, 196, 162, 180, 178 Methyl-13,14-epoxy-docosapentaenoaat 358, 327, 218, 109, 31, 207, 151, 42, 236, 122, 220, 138 Methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat 358, 327, 258, 69,31, 247, 111, 42, 276, 82, 260, 98 Methyl-19,20-epoxy-docosapentaenoaat 358, 327, 298, 31, 29, 287, 71, 316, 42, 300, 58

48 Figuur 4.12: Massaspectrum van piek 1 en 2 afgeleid uit het chromatogram van geëpoxideerde methyl-DHA standaard.

Uit deze massaspectra volgt dat m/z 41, 55, 67, 79, 91 en 105 met de hoogste abundantie voorkomen. Dit gold voor de acht pieken waardoor deze ionen niet konden gebruikt worden voor identificatie van de methyl-DHA afgeleide epoxyvetzuren. Het moleculaire ion (m/z 358) was telkens afwezig in de spectra voor de verschillende pieken. Ook het moleculaire ion na methanolverlies (M-31, m/z 327) werd niet gedetecteerd. De karakteristieke ionen per methyl-DHA afgeleid epoxyvetzuur kwamen in veel lagere abundantie voor. Tabel 4.19 geeft per DHA afgeleid epoxy isomeer de bijhorende geïdentificeerde piek weer. Vetgedrukte ionen werden gebruikt voor de identificatie.

Tabel 4.19: Massaspectra ionen voor methyl-epoxyvetzuren afkomstig van geëpoxideerde methyl-DHA standaard.

Methyl-19,20-epoxy-docosapentaenoaat werd niet gedetecteerd in de geëpoxideerde standaard. Aan de hand van m/z-waarden 69 die in hoge relatieve abundantie voorkwam werd piek 1 geïdentificeerd als methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat. De karakteristieke ionen 69, 82 en 111 voor deze component kwamen ook voor in piek 2. Dit wijst op de cis- en trans-isomeren van methyl-16,17-epoxy- docosapentaenoaat. Aangezien trans-isomeren als eerste elueren op de gebruikte kolom kan gesteld worden dat piek 1 methyl-trans-16,17-epoxy-docosapentaenoaat was en piek 2 methyl-cis-16,17-epoxy-docosapentaenoaat. Piek 3 werd geïdentificeerd als methyl-trans-13,14-epoxy-docosapentaenoaat door m/z 109. Het

cis-isomeer van dit epoxyvetzuur elueert als piek 4. Dit karakteristieke ion kwam

zowel in piek 3 als piek 4 in gelijke relatieve abundantie voor. Verder werd voor de identificatie ook gekeken naar de elutievolgorde op de kolom, waarbij methyl-13,14- epoxy-docosapentaenoaat elueert tussen methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat (piek 1 en 2) en methyl-10,11-epoxy-docosapentaenoaat (piek 5 en 6). Onmiddellijk tegen piek 4 elueerde een brede piek waar de trans- en cis-isomeren van zowel methyl-10,11-epoxy-docosapentaenoaat als methyl-7,8-epoxy-docosapentaenoaat in aanwezig waren (piek 5 en 6). De brede piek en de aanwezigheid van karakteristieke ionen voor beide epoxyvetzuren wijst op co-elutie. Methyl-4,5-epoxy- docosapentaenoaat werd geïdentificeerd als piek 7 (trans) en piek 8 (cis) aan de hand van de karakteristieke ionen 116, 98 en 87. In piek 7 was tevens ook m/z 100 terug te vinden en in piek 8 m/z 271 en 229.

Epoxyvetzuur Piek Fragmentionen [m/z] (relatieve abundantie %)

Methyl-4,5-epoxy-docosapentaenoaat 7 (trans) 116(3), 105(37), 100(1), 98(1), 93(42), 91(70), 87(1), 81(31), 79(100), 77(33), 67(53), 55(33), 41(45) 8 (cis) 271(1), 229(1), 131(34), 119(30), 117(48), 116(6), 105(46), 98(1), 93(38), 92(30), 91(100), 87(2), 79(76), 67(45), 41(42) Methyl-7,8-epoxy-docosapentaenoaat 5 (trans) 231(3), 156(4), 131(36), 127(3), 119(33), 117(43), 105(57), 93(53), 91(100), 81(33) 79(97), 67(63), 55(53), 41(57) 6 (cis) 231(7), 156(5), 127(5), 105(42), 93(44), 91(80), 81(33), 79(100), 77(36), 67(53), 55(37), 41(46) Methyl-10,11-epoxy-docosapentaenoaat 5 (trans) 191(3), 167(4), 149(5), 131(36), 119(33), 117(43), 105(57), 93(53), 91(100), 81(33) 79(97), 67(63), 55(53), 41(57) 6 (cis) 178(4), 167(4), 149(8), 105(42), 93(44), 91(80), 81(33), 79(100), 77(36), 67(53), 55(37), 41(46) Methyl-13,14-epoxy-docosapentaenoaat 3 (trans) 386(37), 354(44), 133(46), 129(31), 119(37), 109(17), 105(78), 95(40), 93(44), 91(92), 81(39), 79(100), 77(52), 67(51), 57(32), 55(54), 44(52), 43(47), 41(55), 32(82) 4 (cis) 117(36), 109(17), 105(37), 95(34), 93(44), 91(79), 77(48), 67(61), 55(43), 41(60) Methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat 1 (trans) 386(44), 143(46), 131(40), 119(57), 105(76), 91(73), 81(58), 79(47), 77(48), 69(37), 67(60), 57(41), 55(57), 44(56), 43(60), 41(75), 32(100) 2 (cis) 131(34), 119(38), 117(52), 111(5), 105(48), 93(48), 92(31), 91(100), 82(6), 79(71), 77(43), 69(11), 67(51), 41(55) Methyl-19,20-epoxy-docosapentaenoaat / /

De karakteristieke ionen waarmee het epoxyvetzuur geïdentificeerd werd in de piek zijn vetgedrukt, de andere meest voorkomende ionen zijn weergegeven in normaal lettertype.

50

4.2.1.3 Methyl-EPA en methyl-DHA afgeleide epoxyvetzuren in gerookte visstalen

Figuur 4.13 geeft de chromatogrammen weer van de polaire fractie, bekomen na SPE toe te passen op het vet geëxtraheerd uit de verschillende gerookte visstalen. Dit voor FTT-, Chorkor- en rookvatstalen bij aanvang van de bewaarperiode (0 maand). Hier zijn telkens de chromatogrammen van geëpoxideerd methyl-EPA en methyl-DHA aan toegevoegd. Uit deze figuur kan afgeleid worden dat in de gerookte visstalen EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren reeds aanwezig zijn bij aanvang van de bewaarperiode. De identificatie gebeurde op basis van de retentietijden en massaspectra van de pieken. In de polaire fractie werden naast de pieken die behoren tot de EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren ook tal van andere pieken teruggevonden. Deze pieken behoren vermoedelijk tot epoxyvetzuren en andere polaire oxidatiecomponenten (zoals oxo-vetzuren) afgeleid uit andere PUFA dan EPA en DHA. Dit vergt echter verder onderzoek naar de fragmentatiepatronen van deze componenten in kwestie en de elutievolgorde op de kolom.

Figuur 4.13: Chromatogrammen van de polaire fractie bekomen na SPE op vet geëxtraheerd uit gerookte visstalen bij verschillende technieken (0 maanden);

In het rood is de geëpoxideerde methyl-EPA standaard toegevoegd als overlay. In het blauw is de geëpoxideerde methyl-DHA standaard toegevoegd als overlay.

52 Figuur 4.14 toont een detailweergave van de chromatogrammen van de polaire fractie bekomen na SPE op geëxtraheerd vet. Dit van verschillende rooktechnieken en op de drie verschillende tijdstippen.

Figuur 4.14: Detailweergave van de chromatogrammen van de epoxyfractie bekomen uit geëxtraheerd vet uit de verschillende gerookte visstalen.

Uit deze figuur valt af te leiden dat bij de drie rooktechnieken en op de drie tijdstippen telkens zowel EPA als DHA afgeleide epoxyvetzuren voorkwamen.

4.2.1.4 Methyl-EPA en methyl-DHA afgeleide epoxyvetzuren in visolie uit capsules

In de polaire fractie van de olie uit capsules bij aanvang (week 0) en na drie weken bewaring werden geen EPA afgeleide epoxyvetzuren aangetroffen. Ook DHA afgeleide epoxyvetzuren werden niet gedetecteerd in de polaire fractie van olie uit de capsules.

In de gethermoxideerde Vitarmonyl en Krill capsules konden eveneens geen EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren aangetroffen worden. Figuur 4.15 geeft de chromatogrammen van gethermoxideerde en geëpoxideerde Biover visolie weer. Hier is telkens het chromatogram van de geëpoxideerde methyl-EPA en methyl-DHA standaard aan toe gevoegd.

Figuur 4.15: Chromatogrammen van de polaire fractie van Biover visolie gethermoxideerd (boven) en geëpoxideerd (onder);

In het rood is de geëpoxideerde EPA standaard toegevoegd als overlay. In het blauw is de geëpoxideerde DHA standaard toegevoegd als overlay.

54 De chromatogrammen van de polaire fractie van gethermoxideerde Biover olie vertoonden geen pieken in het retentietijd gebied van DHA afgeleide epoxyvetzuren. In het retentietijd gebied van EPA afgeleide epoxyvetzuren waren wel pieken op te merken. Bij gethermoxideerde Boni, Lucovitaal en kruidvat visolie werden EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren aangetroffen.

In de polaire fractie van geëpoxideerde Biover olie werden zowel EPA als DHA afgeleide epoxyvetzuren aangetroffen. Bij de andere capsules was dit ook het geval met uitzondering van geëpoxideerde krill olie.