Exploratieve studie van epoxy en hydroxyvetzuren met GC-MS

Voor de exploratieve studie werd gebruik gemaakt van een protocol gebaseerd op de door Mubiru et al. beschreven methode voor analyse van epoxyvetzuren (Mubiru, Shrestha, Papastergiadis, & De Meulenaer, 2013).

3.2.3.1 Transmethylatie

Van de verschillende visoliestalen werd 200,0 mg afgewogen in een centrifugebuis. Hier werd 5,0 ml tertiair-butyl methyl ether (tBME) en 2,5 ml 0,2 M natriummethoxide oplossing in methanol aan toegevoegd. Dit werd gevortext gedurende 1 minuut. Na 2 minuten te laten staan bij kamertemperatuur werd 0,17 ml 0,5 M H2SO4 toegevoegd. Daarna werd 5,0 ml gedestilleerd water toegevoegd aan de stalen en werden deze gevortext. Na scheiding van de fasen werd de bovenliggende fase via een plooifilter met een bodem watervrij natriumsulfaat overgebracht in een peervormige kolf. Deze kolf was vooraf gewogen. De extractie vond twee keer plaats. Dit door nadien terug 5,0 ml tBME toe te voegen aan de centrifugebuis en gedurende 30 seconden te

homogeniseren. Dit werd opnieuw via de plooifilter overgebracht in de peervormige kolf. Finaal werd de filter gespoeld met 15,0 ml tBME. Het solvent (tBME) werd vervolgens verwijderd uit de peervormige kolf door middel van een rotavapor. Ten slotte werden de peervormige kolven met de vetzuuresters gewogen.

3.2.3.2 Solid phase extraction (SPE)

Activatie silicagel

Voor de uitvoering van een solid phase extraction werd gebruik gemaakt van silicagel. Deze silica diende eerst geactiveerd te worden. Hiervoor werd een hoeveelheid silicagel gedroogd in een moffeloven bij 450 °C en dit gedurende 12 uur. Na afkoelen in een desiccator werd het vochtgehalte op 10% gebracht met gedestilleerd water en gedurende 1 uur geschud. De geactiveerde silica werd maximaal twee weken afgesloten bewaard in een desiccator.

Voorbereiding kolom

De kolom werd voorbereid door 1,0 g geactiveerde silicagel in een SPE cartridge te brengen. De cartridge had als afmetingen: 6,5 cm hoog bij 1,3 cm diameter. Op deze kolom werd 3,0 ml van een 98:2 v/v n-hexaan-diethylether oplossing (98:2 solvent) gebracht en vervolgens werd de pakking geroerd. Na settelen van de silicagel werd op de kolom een laag van 0,5 cm zeezand aangebracht ter bescherming van de pakking. Finaal werd de elutievloeistof afgevoerd door de kraan van de kolom onderaan te openen. De pakking werd tijdens SPE continu vochtig gehouden. Figuur 3.1 geeft de opstelling weer.

24 Extractie van verschillende fasen

De vetzuuresters in de kolf werden terug in oplossing gebracht door 17,0 ml 98:2 solvent toe te voegen. Onderstaande werkwijze werd uitgevoerd op de stalen na transmethylatie:

Ø Extractie van de apolaire fractie: De esters in 98:2 oplossing werden zorgvuldig overgebracht op de silicagel kolom totdat de 17,0 ml volledig overgebracht was. Na openen van de kraan werd de apolaire fractie afgevoerd.

Ø Extractie van polaire fractie 1: Na afvoeren van de apolaire fractie werd de kraan van de cartridge opnieuw gesloten. Vervolgens werd 15,0 ml van een 90:10 v/v n-hexaan-diethylether oplossing (90:10 solvent) toegevoegd aan de kolom. Na openen van de kraan werd de eerste polaire fractie (epoxyfractie) opgevangen in een proefbuis. Vervolgens werd de proefbuis drooggedampt onder stikstof. Deze fractie werd door middel van iso-octaan overgebracht in donkere vials en drooggedampt. Finaal werd 1000 µl iso-octaan toegevoegd aan de vial. Hiervan werd 200,0 µl gebruikt voor GC injectie. De rest werd bewaard bij -20 °C.

Ø Extractie van polaire fractie 2: Na verzamelen van de eerste polaire fractie werd de kraan terug dicht gedaan. Vervolgens werd 25,0 ml van een 70:30 v/v n-hexaan-diethylether oplossing toegevoegd aan de kolom. De kraan werd geopend en de tweede polaire fractie (hydroxyfractie) werd verzameld in een proefbuis. Deze proefbuis werd drooggedampt onder stikstof. Vervolgens werden de componenten met iso-octaan overgebracht in vials en opnieuw drooggedampt.

3.2.3.3 Condities gaschromatograaf (GC-FID)

Voor de analyse van de stalen werd gebruik gemaakt van een gaschromatograaf uitgerust met FID. De injectie van de stalen gebeurde cold-on-colum, per staal werd 0,1 µl geïnjecteerd. De gebruikte kolom was dezelfde als onder sectie 3.2.2.2 beschreven. De oven van de gaschromatograaf doorliep een specifiek temperatuursverloop: 1 minuut aanhouden op 50 °C, vervolgens stijgen naar 225 °C aan 40 °C/min en dit 45 minuten aanhouden.

Als dragergas werd helium gebruikt aan een debiet van 1 ml/min, het make-up gas was helium aan een debiet van 20 ml/min. De temperatuur van de FID was 300 °C,

als gas werd lucht en waterstofgas gebruikt aan een debiet van respectievelijk 400 ml/min en 40 ml/min.

3.2.3.4 Condities massaspectrometer (GC-MS)

Voor de identificatie van de pieken werd gebruik gemaakt van een massaspectrometer (5975C VL MSD with triple axis detector, Agilent Technologies, Santa Clara, Verenigde Staten). Hier werd 1,0 µl staal geïnjecteerd door middel van een Split-Splitless injector uitgevoerd in de Splitless mode. De oven van de gaschromatograaf (7890A GC System, Agilent Technologies, Santa Clara, Verenigde Staten) doorliep een specifiek temperatuursprogramma: 1 minuut aanhouden op 50 °C, vervolgens stijgen naar 225 °C aan 40 °C/min en dit 70 minuten aanhouden. De MS interface was een capillaire directe interface met een temperatuur van 250 °C. De MS scande over een range van 30 m/z tot 600 m/z aan een scansnelheid van 3,64 cycli per seconde. De ionisatie zelf gebeurde door middel van elektron impact (70 eV).

3.2.3.5 Dataverwerking

Aan de hand van de bekomen massaspectra kunnen de verschillende oxidatiecomponenten geïdentificeerd worden. In de verschillende visoliestalen werd onderzocht welke componenten al dan niet aanwezig waren, hierbij werd vooral gefocust op epoxyvetzuren van EPA en DHA. Verder werd ook een semi- kwantitatieve analyse uitgevoerd door middel van ratio’s.

26

4 Resultaten