Epoxyvetzuren als indicator voor oxidatie

5.3.1 Geïdentificeerde epoxyvetzuren in de standaarden

In het chromatogram van de geëpoxideerde methyl-EPA standaard werden 9 pieken aangetroffen in een retentietijd gebied van 37 tot 43 minuten. Deze pieken werden geïdentificeerd als verschillende plaatsisomeren van EPA afgeleide mono- epoxyvetzuren. Concreet werd op basis van retentietijd en karakteristieke fragmentionen methyl-5,6-epoxy-eicosatetraenoaat, methyl-8,9-epoxy- eicosatetraenoaat, methyl-11,12-epoxy-eicosatetraenoaat en methyl-14,15-epoxy- eicosatetraenoaat geïdentificeerd. Van elk van deze epoxyvetzuren werd telkens het

cis- en trans-isomeer teruggevonden. In de verschillende massaspectra bekomen uit

pieken per EPA afgeleid epoxyvetzuur was nooit het moleculaire ion (m/z 332) aanwezig. Ook niet alle verwachte karakteristieke fragmentionen werden gedetecteerd. De karakteristieke ionen per component die wel gedetecteerd werden hadden telkens een lage relatieve abundantie ten opzichte van de niet karakteristieke ionen.

In het chromatogram van de geëpoxideerde methyl-DHA standaard werden 8 pieken aangetroffen in een retentietijdgebied van 54 tot 63 minuten. De pieken werden geïdentificeerd als methyl-4,5-epoxy-docosapentaenoaat, methyl-7,8-epoxy- docosapentaenoaat, methyl-10,11-epoxy-docosapentaenoaat, methyl-13,14-epoxy- docosapentaenoaat en methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat. Door co-elutie van methyl-7,8-epoxy-docosapentaenoaat en methyl-10,11-epoxy-docosapentaenoaat konden deze componenten niet afzonderlijk gelinkt worden aan een piek. Ook bij DHA afgeleide epoxyvetzuren was het moleculaire ion (m/z 358) niet detecteerbaar. Opmerkelijk is dat bij zowel geëpoxideerd methyl-EPA als methyl-DHA telkens het eindstandige epoxyvetzuur niet terug te vinden was. Concreet voor methyl-EPA afgeleide epoxyvetzuren was dit methyl-17,18-epoxy-eicosatetraenoaat en voor methyl-DHA afgeleide epoxyvetzuren, methyl-19,20-epoxy-docosapentaenoaat. Hiervoor kunnen twee mogelijke verklaringen gegeven worden. Enerzijds kan de afwezigheid van eindstandige epoxyvetzuren te maken hebben met de reactiviteit van deze componenten. Mogelijks kunnen zowel methyl-17,18-epoxy- eicosatetraenoaat als methyl-19,20-epoxydocosapentaenoaat verder reageren met andere componenten zoals eiwitten (Obando, Papastergiadis, Li, & De Meulenaer, 2015). Hierdoor worden deze wel gevormd bij epoxidatie maar reageren deze

66 onmiddellijk verder. Een kanttekening bij deze hypothese is echter dat in de zuivere geëpoxideerde standaarden geen andere componenten aanwezig waren. Dit kan mogelijks wel een rol spelen bij de gerookte visstalen. Ook worden epoxyvetzuren als relatief stabiele oxidatiecomponenten beschouwd waardoor de reactiviteit met andere componenten eerder laag is (Mubiru, Shrestha, Papastergiadis, & De Meulenaer, 2013).

Een tweede mogelijke verklaring voor de afwezigheid van eindstandige epoxyvetzuren heeft te maken met sterische hindering. In deze theorie is het door de 3D conformatie van methyl-EPA en methyl-DHA minder waarschijnlijk dat de eindstandige onverzadigde binding epoxidatie ondergaat. Figuur 5.2 geeft de eindstandige methyl-EPA en methyl-DHA afgeleide epoxyvetzuren weer.

Figuur 5.2: Effect van sterische hinder op afwezigheid van eindstandige epoxyvetzuren, weergegeven aan de hand van methyl-17,18-epoxy-eicosatetraenoaat en methyl-19,20-epoxy- docosapentaenoaat.

In de gemethyleerde EPA en DHA standaarden hindert de aanwezigheid van de methoxygroep de vorming van eindstandige epoxyvetzuren. Dit zijn echter slechts veronderstellingen om de afwezigheid van de eindstandige epoxyvetzuren verklaren.

5.3.2 Epoxyvetzuurgehalte in visstalen

Uit de totale piekoppervlakten van de totale polaire fractie 1 bekomen na SPE op het geëxtraheerde vet uit de stalen, was af te leiden dat deze fractie verandert in functie van de bewaarperiode. Concreet werd een daling in oppervlakte vastgesteld in functie van de bewaartijd, wat wijst op een daling in polaire componenten na verloop van tijd. Dit was niet verwacht aangezien uit de vetzuursamenstelling van de visstalen oxidatie bleek op te treden. Hierdoor zouden meer polaire componenten moeten gevormd worden waardoor het aandeel van de totale polaire fractie 1 zou

toenemen. Mogelijks is deze omgekeerde trend te wijten aan polymerisatie door oxidatie van de vetzuren. Polymeren zijn immers niet aanwezig in de polaire fractie 1.

Uit de berekende ratio’s voor de behandelde olie uit de visoliecapsules volgt dat het aandeel aan EPA afgeleide epoxyvetzuren in de totale polaire fractie 1 bij zowel thermoxidatie als epoxidatie het grootste is. Het aandeel van DHA afgeleide epoxyvetzuren in de totale polaire fractie ligt lager. Dit zou kunnen aantonen dat EPA meer vatbaar is voor thermoxidatie en epoxidatie dan DHA. Deze stelling wordt echter weerlegd door de gehalten EPA en DHA die in de onbehandelde olie uit capsules aanwezig zijn te vergelijken met elkaar. Hieruit volgt dat in de capsule olie telkens meer EPA aanwezig was dan DHA, dit verklaart dan ook waarom het aandeel EPA afgeleide epoxyvetzuren in de polaire fractie 1 het hoogste is. Zoals eerder aangetoond volgt uit de relatieve verschillen ten opzichte van de onbehandelde capsules dat DHA het meeste vatbaar is voor thermoxidatie. Voor epoxidatie is zowel EPA als DHA even gevoelig.

Uit de ratio’s voor EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren ten opzichte van de totale polaire fractie 1 en uit de individuele ratio’s per epoxyvetzuur kan geen duidelijke trend afgeleid worden, in functie van de bewaarperiode bij de gerookte visstalen. Aangezien slechts 1 staal per tijdstip en per techniek geanalyseerd werd kan ook geen statistisch uitsluitsel gegeven worden over de significantie van de verschillende waarden. De bewaarperiode heeft dus geen uitgesproken impact op het gehalte aan EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren. Ook de gebruikte rooktechniek heeft geen duidelijk aantoonbare impact op de samenstelling van de polaire fractie 1. Verwacht werd dat het gehalte aan EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren hoger zou liggen na drie maanden bewaring en het hoogste zou moeten zijn na zes maanden bewaring. Bij langere bewaring treedt immers meer oxidatie van de vetzuren op waardoor meer oxidatiecomponenten (waaronder epoxyvetzuren) gevormd worden.

De individuele ratio’s voor de plaatsisomeren van EPA en DHA afgeleide epoxyvetzuren tonen aan dat cis-methyl-11,12-epoxy-eicosatetraenoaat en cis- methyl-16,17-epoxy-docosapentaenoaat het grootste aandeel vertegenwoordigen binnen de respectievelijk EPA afgeleide epoxyvetzuren en DHA afgeleide epoxyvetzuren. Een verschil in conformatie kan een mogelijke verklaring zijn waarom net die epoxyvetzuren het meeste gevormd worden. Bij EPA is de dubbele binding

68 dan de andere dubbele bindingen. Bij DHA is dit de onverzadigde verbinding tussen koolstof 16 en 17. Dit zijn echter veronderstellingen en vergen meer onderzoek naar de invloed van de ligging van de dubbele binding op de vorming van epoxyvetzuren.

5.3.3 Conclusie omtrent het gebruik van epoxyvetzuren als oxidatie indicator

Algemeen kan geconcludeerd worden dat geen duidelijke link gevonden kan worden tussen het gehalte aan epoxyvetzuren en de bewaarperiode. Bij aanvang van de bewaring zijn reeds epoxyvetzuren aanwezig in stalen. Na respectievelijk drie en zes maanden bewaring is geen noemenswaardig verschil op te merken in de gehalten aan epoxyvetzuren. Aangezien geen duidelijke stijging in epoxyvetzuur gehalte te constateren is in functie van de toenemende bewaartijd, zijn epoxyvetzuren geen geschikte indicator voor de vetzuurstabiliteit in gerookte vis. Uit de resultaten van de vet extraheerbaarheid en de vetzuursamenstelling van het geëxtraheerde vet uit de gerookte visstalen, bij verschillende bewaartijdstippen, kon immers afgeleid worden dat wel degelijk oxidatie plaatsvond.