Citation
Dijkmans, T. F. (2009, October 14). Doublecortin-like kinase and neuronal differentiation. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/14055
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/14055
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Chapter7
SUMMARY/SAMENVATTING
OUTLINE
1.Summary
2.Samenvatting
1.SUMMARY
The function of the nervous system depends on the complex architecture and
plasticity of its neuronal networks. During development, and to some extent in
adult life in very discrete brain regions, neurons are created and integrated into
thisnetwork.Eachcellthatwillultimatelybecomeaneuronwasproducedbycell
proliferation and given a neuronal identity by a process called neuronal
differentiation.Afterarrestincellproliferation,thedifferentiatingcellwillmigrate,
elaborateatreelikemorphology,formsynapticconnectionsandacquiretheability
toreceiveandsendelectricsignals.Itisevidentthatthefinalneuronistheresultof
intricateinteractionswithinthedifferentiatingcell,withothercellsandwiththeir
products. However, detailed knowledge of the underlying molecular biology of
neuronaldifferentiationisfarfromcomplete.
NerveGrowthFactor(NGF)isknowntobeanimportantfactorthatdrives
neuronal differentiation. To elucidate the molecular actions of NGF, the rat PC12
cell line in particular has been a suitable model. In response to NGF treatment,
undifferentiated PC12 cells cease to proliferate and engage in neuronal
differentiation. Presentation of NGF to the undifferentiated PC12 cell leads to
binding of NGF to the transmembrane TrkA receptor. Subsequently, a number of
intracellular signaling cascades are activated, including the Extracellular signal
RegulatedKinase1/2(ERK1/2)pathway.AfterminutesofNGFexposure,signaling
oftheERK1/2andotherpathwaysinducethetranslationindependentexpression
ofimmediateearlygenes(IEGs).ManyoftheseIEGsaretranscriptionfactorsthat
are heavily and transiently upregulated within 2 hours. Subsequently, a class of
genesbecomesexpressed,whoseregulationistranslationdependent.Thisclassis
termed delayedresponse genes (DRGs). These DRGs represent the more typical
constituents of neurons and respond after days of NGF treatment, rather than
minutesorhours.
Although a number of NGFresponsive genes with a function in neuronal
differentiation has been described, the complexity of this process suggests that
many more remain unknown. Therefore, the central goal of this thesis was to
identify(Chapter2and3)andanalyze(Chapter4and5)genesimportantforNGF
inducedneuronaldifferentiationofNs1PC12cells.
In Chapter 2, a DNA microarray screening procedure was used to identify 5 new
NGFresponsive IEGs: Cbp/p300interacting transactivator 2 (Cited2), Kruppellike
factor4(Klf4),vMafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenefamily,proteinF
(Maff), Kruppellike factor 10 (Klf10 or Tieg) and Activating transcription factor 3
(Atf3). After stimulation of Ns1 PC12 cells with NGF for 15, 30, 60 and 120
minutes, a typical, transient induction of many known NGFresponsive IEGs was
measured using DNA microarrays. Subsequently, the remaining 27 000 measured
expressionprofileswereanalyzedandyielded10candidateIEGs,ofwhich5were
validated by qPCR. The NGFinduced expression of all 5 genes was shown to be
mediatedby theERK1/2 and the PI3Kpathway; to be independentoftranslation
andtooccurinboththesubclonalNs1PC12andtheparentalPC12cellline.These
5 transcription factors were not previously reported as NGFresponsive IEGs,
however they had been identified as important regulators of cell differentiation
and proliferation in other systems. The observations provide important new
informationonthemolecularmechanismsunderlyingNGFinduceddifferentiation
ofNs1PC12cells.
InChapter3,aDNAmicroarraystudywasperformedthatcharacterizedtemporal
and functional changes of the Ns1 PC12 cell transcriptome during 4 subsequent
days of NGFinduced differentiation. Analysis of the transcription profiles of 1595
NGFregulated genes showed a large diversity in transcriptional regulation across
time. For the first time, this revealed in (Ns1) PC12 cells that NGFinduced
differentiationisnotcharacterizedbyprogressiveupordownregulationofgenes,
but rather represents a nonlinear transcriptional process. In addition, ontology
analysis was performed to quantify which biological processes and molecular
functions were specifically regulated by NGF in time. This analysis indicated that
NGF typically regulates genes implicated in protein biosynthesis, intracellular
signaling,cellstructure,chromatinpackagingandremodeling,intracellularprotein
trafficking,mRNAtranscriptionandcellcycleprocesses.Inthischapter,itwasalso
discussed how NGFresponsive genes may mediate transcriptional regulation
duringdifferentiation.Finally,amongthenewlydiscovered,highlyNGFresponsive
transcriptswasasplicevariantoftheDoublecortinLikeKinase(DCLK)gene:DCLK
short. Therefore, the function of DCLKshort in neuronal differentiation and the
mechanisms thatdetermine its expression were further investigated in Ns1PC12
cellsinChapter4and5.
In Chapter 4, DCLKshort was identified to mediate NGFinduced neuritogenesis.
While DCLKshort protein is found basally expressed in Ns1 PC12 cells, NGF
treatment substantially increased the protein levels of DCLKshort. Moreover,
serine30ofDCLKshortappearedtobephosphorylatedbyERK1/2inresponseto
NGF treatment. Although nuclear translocation of DCLKshort upon NGFdriven
phosphorylation was hypothesized, this occurred to an insignificant degree. Also
overexpression of DCLKshort (phospho)protein left expression of IEGs cFos and
Egr1 unaffected. Therefore, an extracellular function for DCLKshort
(phosphorylation) was investigated. Interestingly, DCLKshort colocalized with
filamentousactiningrowthconesofextendingneurites.Moreover,itsintracellular
distribution was dependent on an intact actin cytoskeleton. Together this
suggested a role for DCLKshort in NGFinduced neuritogenesis, possibly
phosphorylationdependent. Indeed, overexpressed wild type or serine 30
phosphomutant DCLKshort had a different effect on the number of outgrowing
neuritesandontheinductionofamarkerofneuriteoutgrowth,GrowthAssociated
Protein 43 (GAP43). A function of DCLKshort as a phosphoprotein regulating
cytoskeleton architecture is well in line with other proteins of the Doublecortin
gene family and with the current understanding of how NGF induces
neuritogenesis.
In Chapter 5, the regulation of DCLKshort expression in Ns1 PC12 cells was
addressed.DCLKshortwasshowntobeupregulatedbyNGFandForskolin(FSK).In
line with previous in vivo studies, glucocorticoid receptor activation by
Dexamethasone was able to partially suppress this induced upregulation in Ns1
PC12 cells. In general, FSK and NGF induce gene transcription through cAMP
response elements (CREs), present in promoters of target genes. Although a
predicted CRE was present in the DCLKshort promoter, DCLKshort was
upregulated later than8 hours. Therefore, DCLKshort was assumed to be a DRG,
displayingtranslationdependentupregulation.Remarkably,bothbasalDCLKshort
expressionanditsupregulationweremediatedbythepredictedCRE.Thissuggests
that this promoter element is occupied by different, stimulusdependent protein
complexes with different transcriptional potencies. Together, DCLKshort
expression is subject to presently unresolved, yet intriguing regulatory
mechanisms.AsacAMPresponsivetranscript,DCLKshortregulationisinlinewith
manyothertranscriptsimportantinneuronaldifferentiation.
Inconclusion,thecombinedapproachofgenomewideexpressionprofilingandthe
functional analysis of one selected transcript, i.e. DCLKshort, were fruitful in
pursuitofabetterunderstandingofNGFinduceddifferentiationofNs1PC12cells.
Thereby, these findings may contribute to a more general understanding of the
molecularbiologyofneuronaldifferentiationandultimately,ofthefunctioningof
thenervoussystem.
2.SAMENVATTING
Het functioneren van het zenuwstelsel wordt bepaald door de complexe
vormgeving en de plasticiteit van zijn neuronale netwerken. Tijdens de
ontwikkeling, en tot op zekere hoogte in een enkel klein hersengebied ook bij
volwassenheid, worden neuronen geproduceerd en gentegreerd in dit netwerk.
Iedere cel die uiteindelijk een neuron wordt, is geproduceerd door celdeling en
verwerft een neuronale identiteit door een proces dat neuronale differentiatie
heet.Nadebeëindigingvandeceldeling,zaldedifferentiërendecelmigreren,een
boomachtige morfologie ontwikkelen, synaptische verbindingen vormen en het
vermogen krijgen om elektrische signalen te ontvangen en te versturen. Het is
duidelijkdathetuiteindelijkeneuronhetresultaatisvanverfijndeinteractiesinde
cel zelf, met andere cellen en met hun producten. Echter, precieze kennis van de
onderliggende moleculaire biologie van neuronale differentiatie is tot op heden
onvolledig.
Nerve Growth Factor (NGF) is bekend als een belangrijke eiwit dat neuronale
differentiatie aanstuurt. Om de moleculaire rol van NGF te begrijpen vormt de
PC12 cellijn een interessant model. In reactie op NGFbehandeling stoppen PC12
cellenmetdelenenbeginnenzeaanneuronaledifferentiatie.Deblootstellingvan
NGF aan de PC12 cel leidt tot binding aan de transmembrane TrkAreceptor.
Vervolgens wordt een aantal intracellulaire signaaltransductieketens geactiveerd,
waaronderdeExtracellularsignalRegulatedKinase1/2(ERK1/2)pathway.Binnen
minuten induceert signaaloverdracht van de ERK 1/2 en andere pathways de
translatieonafhankelijke expressie van immediateearly genes (IEG's). Veel van
deze IEG's zijn transcriptiefactoren waarvan de expressie binnen een tijdsbestek
van twee uur, sterk en tijdelijk wordt verhoogd. Daarna wordt een klasse genen,
waarvan de regulatie translatieafhankelijk is, tot expressie gebracht: de delayed
response genes (DRG's). Deze DRG's vertegenwoordigen de meer kenmerkende
eiwitten van neuronen en reageren eerder na dagen dan na minuten of uren van
NGFbehandeling.
Hoewel een aantal NGFresponsieve genen met een functie tijdens neuronale
differentie reeds beschreven is, suggereert de complexiteit van dit proces dat er
nogveelbetrokkengenenonbekendzijn.Daaromwasdecentraledoelstellingvan
dit proefschrift om genen, met een belangrijke rol in NGFgenduceerde
differentiatie van Ns1 PC12 cellen, te identificeren (Hoofdstuk 2 en 3) en te
analyseren(Hoofdstuk4en5).
In Hoofdstuk 2 is een DNA microarrayscreening gebruikt om 5 nieuwe, NGF
responsieve IEG's te identificeren: Cbp/p300interacting transactivator 2 (Cited2),
Kruppellike factor 4 (Klf4), vMaf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene
family, protein F (Maff), Kruppellike factor 10 (Klf10 of Tieg) en Activating
transcriptionfactor3(Atf3).Na15,30,60en120minutendurendestimulatievan
Ns1 PC12 cellen met NGF werd aan de hand van DNA microarrays de typische,
tijdelijkeinductievanveelbekendeIEG'sgemeten.Vervolgenswerdendeoverige
27.000 gemeten expressieprofielen geanalyseerd, hetgeen resulteerde in 10
kandidaat IEG's, waarvan er 5 met qPCR werden gevalideerd. Ook is bij dit
onderzoekaangetoonddatdeNGFgenduceerdeexpressievanalle5genenviade
ERK 1/2 en de PI3K pathway verliep; dat de opregulatie translatieonafhankelijk
was en dat de opregulatie zowel in de subclonale Ns1 PC12 als in de PC12
moedercellijn plaatsvindt. Eerder werd nog niet gerapporteerd dat deze 5
transcriptiefactoren NGFresponsieve IEG's zijn, maar wel dat het belangrijke
regulatoren zijn van celdifferentiatie en proliferatie in andere systemen. Deze
observaties geven belangrijke, nieuwe informatie over de moleculaire
mechanismenvanNGFgenduceerdedifferentiatie.
In Hoofdstuk 3 is een DNA microarraystudie verricht die de tijdsafhankelijke en
functionele veranderingen van het Ns1 PC12 transcriptoom, gedurende 4
opeenvolgende dagen van NGFgenduceerde differentiatie, karakteriseert. De
analyse van de expressieprofielen van 1595 NGFresponsieve genen toonde een
grote variatie aan in transcriptionele regulatie in de tijd. Voor het eerst was
hiermee in Ns1 PC12 cellen zichtbaar gemaakt dat NGFgenduceerde
differentiatie niet tot uitsluitend een toenemende of afnemende genexpressie
leidt, maar eerder een nonlineair verschijnsel is. Ook werd er een ontologie
analyse uitgevoerd om te berekenen welke biologische processen en welke
moleculairefunctiesspecifiekdoorNGFindetijdwordengereguleerd.Ditlietzien
dat NGFregulatie wordt gekenmerkt door het benvloeden van eiwitbiosynthese,
intracellulairesignaaltransductie,chromatinepakkingenherschikking,intracellulair
eiwittransport, mRNAtranscriptie en celcyclus processen. In dit hoofdstuk werd
ook besproken hoe NGFresponsieve genen een rol kunnen spelen in
transcriptionele regulatie tijdens differentiatie. Tot slot, onder de nieuw
gedentificeerde en sterk NGFresponsieve transcripten bevond zich een splice
variantvanhetDoublecortinLikeKinase(DCLK)gen:DCLKshort.InHoofdstuk4en
5 zijn daarom in Ns1 PC12 cellen de functie van DCLKshort in neuronale
differentiatieendemechanismendiedeexpressievanhetDCLKshortgenbepalen
verderonderzocht.
In Hoofdstuk 4 werd beschreven dat DCLKshort eiwit een rol heeft in NGF
genduceerde neurietuitgroei. Hoewel DCLKshort eiwit reeds basaal in Ns1 PC12
cellen tot expressie komt, leidt NGFbehandeling tot een substantieel verdere
verhoging van DCLKshort eiwitniveaus. Bovendien is gebleken dat NGF
behandeling leidt tot fosforylering van ERK 1/2 serine 30 van DCLKshort. Hoewel
de hypothese werd getoetst dat DCLKshort naar de celkern gaat door NGF
gestimuleerde fosforylatie, bleek dit in verwaarloosbare mate te gebeuren.
EvenminhadoverexpressievanDCLKshort(fosfo)eiwitgeeneffectopdeinductie
van de IEG's cFos en Egr1. Daarom werd een rol van DCLKshort (fosforylering)
buiten de celkern onderzocht. Opmerkelijk genoeg bevond DCLKshort zich op
dezelfde plek als filamenteus actine in de groeiconus van uitgroeiende neurieten.
BovendienwasdeverspreidingvanDCLKshortindecelafhankelijkvaneenintact
actine cytoskelet. Tezamen suggereerde dit dat DCLKshort een rol heeft in NGF
genduceerdeneurietuitgroei,diemogelijkafhankelijkisvanfosforylatie.Inderdaad
had overexpressie vanwild type of serine30fosfomutant DCLKshortverschillend
effectophetaantaluitgroeiendeneurietenenopdeinductievaneenmarkervan
neurietuitgroei,GrowthAssociatedProtein43(GAP43).EenrolvoorDCLKshortals
een fosfoeiwit dat betrokken is bij de regulatie van het cytoskelet komt goed
overeen met de gepostuleerde rol van andere eiwitten van de Doublecortin
genfamilie.Dezevondstisvanbelangvoorhetbegripvanneurietuitgroeidiedoor
NGFgestimuleerdwordt.
InHoofdstuk5werddeexpressievanDCLKshortinNs1PC12cellenbestudeerd.
Het bleek dat DCLKshort expressie wordt verhoogd door NGF en door Forskoline
(FSK).ActivatievandeglucocorticodreceptordoorDexamethasononderdruktedit
gedeeltelijk,hetgeenovereenkomtmeteerdereinvivostudies.Overhetalgemeen
induceren NGF en FSK gentranscriptie door cAMPresponselementen (CRE's) die
zichbevindeninpromotersvanresponsievegenen.Hoewelerzicheenvoorspelde
CREbevondindeDCLKshortpromoter,vonddetoenameinDCLKshortexpressie
laterdanna8uurplaats.DaaromwerderaangenomendatDCLKshorteenDRGis
en dat deze ‘opregulatie’ dus translatieafhankelijk is. Opmerkelijk genoeg wasde
basale expressie van DCLKshort én diens ‘opregulatie’ afhankelijk van de
voorspelde CRE. Dit suggereert dat dit promoterelement wordt bezet door
verschillende, stimulusafhankelijke eiwitcomplexen met verschillend effecten op
transcriptie. Samengevat blijkt dat DCLKshort expressie wordt bepaald door
vooralsnog onopgeloste, maar intrigerende mechanismen. Het cAMPresponsieve
kenmerkvandeDCLKshortexpressievertoontovereenkomstmetderegulatievan
veelanderetranscriptendiebelangrijkzijnvoorneuronaledifferentiatie.
Concluderend,degecombineerdeaanpakvangenoombredeexpressiestudieende
daaruit voortvloeiende functionele analyse van een enkel geselecteerd transcript,
DCLKshort,heeftgeleidtoteenbeterbegripvanNGFgenduceerdedifferentiatie
van Ns1 PC12 cellen. Hiermee kunnen deze bevindingen bijdragen tot een beter
algemeen begrip van de moleculaire biologie van neuronale differentiatie en,
uiteindelijk,vanhetfunctionerenvanhetzenuwstelsel.
