University of Groningen Exploring cellular and molecular mechanisms underlying endothelial heterogeneity in sepsis Dayang, Erna

(1)

University of Groningen

Exploring cellular and molecular mechanisms underlying endothelial heterogeneity in sepsis

Dayang, Erna

DOI:

10.33612/diss.160307653

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from

it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:

2021

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Dayang, E. (2021). Exploring cellular and molecular mechanisms underlying endothelial heterogeneity in

sepsis. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.160307653

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

554817-L-sub01-bw-Erna 554817-L-sub01-bw-Erna 554817-L-sub01-bw-Erna 554817-L-sub01-bw-Erna Processed on: 15-2-2021 Processed on: 15-2-2021 Processed on: 15-2-2021

Processed on: 15-2-2021 PDF page: 179PDF page: 179PDF page: 179PDF page: 179

Appendices

Nederlandse samenvatting

Acknowledgements

About the author

(3)

Appendices

180

NEDERLANDSE SAMENVATTING

Welke cellulaire en moleculaire mechanismes liggen ten grondslag aan bloedvatwandcel verschillen in sepsis

Patiënten die lijden aan sepsis (bloedvergiftiging) hebben vaak te maken met orgaandisfunctie. Multi-orgaandisfunctiesyndroom (MODS) is een bij ernstig zieke patiënten veelvoorkomende levensbedreigende complicatie van sepsis. De nieren en de longen zijn gevoelig voor orgaandisfunctie tijdens sepsis. De oorzaak van nieren longdisfunctie is niet volledig bekend, en staat daarmee de ontwikkeling van een effectieve behandeling tegen sepsis-gedreven orgaandisfunctie in de weg. Wat wel bekend is, is dat bij sepsis-geassocieerde orgaandisfunctie bloedvatwandcellen (ook wel bekend als endotheelcellen) ook anders gaan functioneren. Endotheelcellen (EC) zijn belangrijke cellen die betrokken zijn bij het reguleren van de doorlaatbaarheid van de vaatwand, stolling, en het aantrekken van witte bloedcellen uit het bloed naar onderliggend weefsel. Deze processen worden verkeerd gereguleerd tijdens sepsis en kunnen daardoor bijdragen aan orgaandisfunctie. Om deze reden zou het voorkomen van abnormaal endotheelcelgedrag in sepsis een mogelijke strategie kunnen zijn om orgaanfalen te voorkomen in sepsispatiënten.

In hoofdstuk 1 introduceerde ik de rol van EC in gezonde organen en in sepsis-geassocieerde orgaandisfunctie. Hoewel EC ooit gezien werden als passieve “wandbekleders”, is nu bekend dat ze een actieve rol spelen in de ontsteking en het reguleren van de doorlaatbaarheid van de vaatwand in sepsis. EC reageren op infectie via directe herkenning van sepsis-gerelateerde ontstekingsprikkels, die leiden tot de expressie van verschillende ontstekingsmoleculen waardoor witte bloedcellen kunnen worden aangetrokken. Omdat EC ontsteking en daaropvolgend het endotheel-afhankelijke aantrekken van witte bloedcellen orgaan- en vaatbed-specifiek zijn, is het van belang om de cellulaire en moleculaire processen die hieraan bijdragen in sepsis nader te onderzoeken. Om deze reden stelde ik voor om de verschillende reacties van EC op sepsis-gerelateerde ontstekingsprikkels te onderzoeken, en de onderliggende moleculaire mechanismes te beschrijven die aan deze verschillen ten grondslag liggen.

(4)

181 Omdat nieren en longen organen zijn die ernstig aangedaan zijn door sepsis, hebben we in hoofdstuk 2 sepsis-geassocieerde acute nierschade (sepsis-AKI) en sepsis-geassocieerd acuut respiratoir stresssyndroom (sepsis-ARDS) met elkaar vergeleken. We benadrukken in dit hoofdstuk dat verschillende reacties van EC in de regulatie van de ontsteking, het infiltreren van witte bloedcellen, en barrièredisfunctie in endotheelcellen ten grondslag liggen aan de verschillende klinische patronen die worden gezien in sepsis-AKI en sepsis-ARDS. We concluderen dat het begrijpen van cellulaire en moleculaire regulatie in microvasculaire vaatbedden in nieren en longen van groot belang is om gerichte behandelingen tegen sepsis-AKI en sepsis-ARDS te ontwikkelen.

Zoals geïntroduceerd in hoofdstuk 2, vindt het endotheel-afhankelijke aantrekken van witte bloedcellen in verschillende mate plaats in sepsis-AKI en sepsis-ARDS. In hoofdstuk 3 beschreven we de kinetiek en locatie van de expressie van moleculen die er op EC voor zorgen dat witte bloedcellen worden aangetrokken (E-selectin en VCAM-1) in de nieren en longen van muizen met sepsis. We onderzochten de mate waarin het endotheel ontstoken was in de kleinste bloedvaten in organen, namelijk de arteriolen, capillairen, en venules in de nieren en de longen in reactie op sepsis. E-selectin kwam tijdelijk tot expressie in glomerulair capillair in de nier, en in arteriolen en venules in de long van sepsis muizen. VCAM-1 expressie in de nieren en longen was niet veranderd en kwam met name tot expressie in peritubulaire capillairen in de nier, en in mindere mate ook in longcapillairen. Echter, VCAM-1 expressie bleek afwezig in glomerulaire capillairen in de nier tot het laatste tijdspunt dat deze muizen zijn bestudeerd (72 uur na het ontstaan van sepsis). Daarnaast onderzochten we het tijdsbeloop van de infiltratie van witte bloedcellen in deze twee organen. Een van de witte bloedcelsoorten, de neutrofiel, was aanzienlijk hoger in de longen in vergelijking met de nieren. Neutrofielen in de nier waren glomerulair-specifiek, terwijl ze in alle vaatbedden van de long voorkwamen. Samenvattend, de expressie van E-selectin en VCAM-1 in de nieren en longen was afhankelijk van welk bloedvat je bekeek in reactie op sepsis. De aanwezigheid van beide moleculen was niet direct geassocieerd met de hoeveelheid neutrofielen in de onderzochte bloedvaten.

Lipopolysaccharide (LPS) is een onderdeel van een bepaald soort bacterie (Gram-negatieve bacteriën), en belangrijk in de totstandkoming van sepsis bij een infectie met deze bacteriën. De ontsteking van het endotheel wanneer LPS in

(5)

Appendices

182

muizen wordt ingespoten resulteert in expressie van E-selectin en VCAM-1. Van deze moleculen is het bekend dat ze worden gereguleerd door specifieke receptoren en signaalmoleculen in EC, ook al is het onduidelijk of alle EC hetzelfde reageren. In hoofdstuk 4 onderzochten we daarom LPS-gedreven E-selectin en VCAM-1 expressiepatronen in de kleinste bloedvaten uit muizennieren, en in bloedvatwandcellen in een kweekvaatje in het laboratorium. We ontdekten dat E-selectin en VCAM-1 in verschillende mate tot expressie kwamen in EC tussen en binnen verschillende kleine bloedvaten van muizen behandeld met LPS. Deze constatering werd ook gevonden in bloedvatwandcellen in een kweekvaatje. In de kweekvaatjes konden 4 soorten reactiepatronen van endotheelcellen worden gevonden na de behandeling met LPS. Deze groepen werden als volgt gedefinieerd: E-selectin-/VCAM-1-_{(-/-), E-selectin}+_/VCAM-1-_{(E-sel+), E-selectin}+_/VCAM-1+

(+/+), en E-selectin-_/VCAM-1+_{(VCAM-1+). Deze subgroepen waren gereguleerd}

door specifieke moleculen betrokken in de ontsteking van de EC. Behandeling met specifieke geneesmiddelen liet zien dat er een belangrijk rol is weggelegd voor NF-ǉB en p38 MAPK in de formatie van E-sel+ en +/+ subgroepen.

Op basis van de bevindingen in hoofdstuk 4 concludeerden we dat LPS verschillende signaalmoleculen in EC activeert die onderliggend zijn aan de verschillende expressie van ontstekingsmoleculen in EC. In hoofdstuk 5 beschrijven we daarom proeven om de verschillen in genexpressie tussen de -/- en +/+ subgroepen die ontstonden na het toevoegen van LPS te onderzoeken. De -/- en +/+ subgroepen lieten elk een verschillende reactie zien, ondanks dat ze precies dezelfde LPS prikkel ontvingen. De bestudering van de signaalmoleculen in deze cellen (het zogenoemde transcriptoom) wordt op het moment van het schrijven van dit proefschrift uitgevoerd. Ik verwacht dat de uitkomst van deze studie ons mogelijk nieuwe mechanismes zal laten zien die bepalen waarom EC in muizen en mensen verschillend reageren tijdens sepsis.

Zoals beschreven in hoofdstuk 4 is er nog veel onbekend over de moleculen die betrokken zijn in deze signaalmoleculen in EC tijdens sepsis. Daarom onderzochten we in hoofdstuk 6 wat de rol is van speciale signaalmoleculen tyrosine kinases in het sturen van EC ontsteking. De analyse waarin we naar een grote groep tyrosine kinase moleculen hebben gekeken toonde 58 tyrosine kinases die betrokken zijn bij LPS-gedreven EC ontsteking. Het bestuderen van twee van deze tyrosine kinases, namelijk FAK1 en ALK, liet zien dat zij sleutelrollen spelen in het

(6)

183 sturen van LPS-gedreven EC ontsteking. Op basis hiervan concludeerden we dat profiel analyse van tyrosine kinases een waardevolle strategie is om moleculen te identificeren die het doelwit kunnen zijn van toekomstige geneesmiddelen om bloedvatwandgedrag in sepsis te beïnvloeden. Vervolgstudies in proefdieren zijn nodig om de effecten van deze geneesmiddelen op de kleinste bloedvaten in organen die falen tijdens sepsis beter te begrijpen.

Samenvattend, in dit proefschrift heb ik aangetoond dat de kleinste bloedvaten in nieren en de longen vatbaar zijn voor ontsteking in sepsis, en dat EC in beide organen op een vaatbed-specifieke manier reageren. Daarnaast verschilde de infiltratie van witte bloedcellen per orgaan, en per vaatbed. In aanvulling daarop heb ik in dit proefschrift laten zien dat FAK1 en ALK belangrijke moleculen in bloedvatwandcellen zijn tijdens deze ontsteking. Het toedienen van specifieke geneesmiddelen gericht op het remmen van deze twee tyrosine kinases wist de ontsteking tegen te gaan in bloedvatwandcellen in kweekvaatjes in het laboratorium. In het laatste hoofdstuk stel ik toekomstige studies voor om het verschillende gedrag van bloedvatwandcellen tijdens sepsis beter te begrijpen. Het ontrafelen van de moleculaire regulatie van deze verschillen op het niveau van orgaan, vaatbed, en cel, zal hopelijk bijdragen aan de ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op deze specifieke microvasculaire vaatbedden tijdens sepsis.

(7)

Appendices

184

ACKNOWLEDGEMENTS

The decision to come to the Netherlands was not an easy one. I arrived in the Netherlands just three months after I prematurely gave birth to my son Yusuf. As a mother of two, I did not have the slightest idea on how I would manage my time between being a mother and a PhD student. Fast forward, after four years, it still feels surreal that I have finally completed my PhD successfully. I certainly cannot reach this stage without enormous support and guidance from my family, supervisors, colleagues, and friends. Words alone cannot truly express my sincere gratitude to all individuals that had helped and shaped me to be who I am today.

First and foremost, I would like to thank my dear promoter, Prof. Grietje (Ingrid) Molema. Dear Ingrid, the decision to pursue my PhD under your supervision is one of the best decisions that I have ever made. You are not only a thesis advisor to me, but a life and career mentor that I look up to. Thank you for showing me, through example, how a real teacher and a scientist should be. Looking at how hard you work, I realize that if I want to be like you, first I need to work hard like you. You laid a strong foundation on my budding scientific career, and I hope to apply the principles and work ethics that you have instilled in me throughout my scientific career. I have seen one, I will do one, and I will teach one. I will be forever grateful for the privilege to be mentored by you throughout my study. Dear Jill, I worked closely with you the moment that I started my PhD. Thanks for teaching me what you know, as I know I lacked knowledge and technical skills when I started my study four years ago. Thanks for giving me space to grow. You are considerate and approachable, and I always feel comfortable to share any issues (that come from my head, or heart) with you. I wish you success for your current COVID and upcoming projects. Dear Matijs, I always appreciate your clinical inputs and remarks whenever I presented my research data. You are very easy-going and positive, and I feel relaxed whenever I talk with you. Thank you for trying to be available for me although I know you were busy with your clinical duties, especially during the last few months when I was wrapping up my thesis. Thank you for your invaluable inputs for the Nederlandse samenvatting of this thesis. I will surely miss the scientific discussions that we have weekly in my progress meetings once I return to my country.

(8)

185 I would like to extend my special thanks to the members of the reading committee, Prof. Stefan Berger, Prof. Jaap van Buul, and Prof. Philipp Kümpers for spending your time to carefully read and evaluate my thesis.

I would like to extend my sincerest gratitude to Malaysian Government (Skim Latihan Akademik Bumiputra) and Universiti Malaysia Sarawak for the four-year scholarship offered (2017-2021), which enabled me to complete my study.

My heartfelt thanks go out to my colleagues in Endothelial Biology and Vascular Drug Targeting (EBVDT) group. I am proud to say that I am now an adept experimenter thanks to my colleagues in EVDT: Henk, you taught me how to isolate HUVEC and provided HUVEC for almost all my experiments before you retired. You were always willing to help me out with the cutting of animal tissues for my staining. Thank you for all that you have done for me, Henk, and for the delicious jam too! Josée, you were my first lab teacher. Thank you for patiently teaching me lab skills and for helping me out without hesitation whenever I need it. I am proficient in flow cytometry thanks to you. Peter, thanks for instilling strong knowledge in RT-qPCR. You are very skilled in what you do that I am glad to have you as one of my lab teachers in EBVDT. Rianne, from the outside you look tough, but you are actually friendly and approachable. You taught me immunohistochemistry, and I received practically all protocols from you. Thanks for immunohistochemistry and Western blot tips and tricks, as I benefitted a lot them. Timara, you taught me so much, from RNA isolation, cutting cryo-tissues, Western blot, Pamgene assay, and many more lab skills. I truly enjoyed working side-by-side with you and Matt for our kinase paper. Thank you for always being available to assist me, either in experimental matters, or in non-experimental matters (like accompanying me to the huisartsenpost when I accidentally cut my finger while cutting cryo-kidneyষ). I have always enjoyed our casual conversation: K-drama related or not. Not to forget, thanks for your willingness to become my paranymph, and for your inputs for the Nederlandse samenvatting of this thesis. Eliane, thanks for teaching me immunofluorescence, morphometric analysis, and scientific writing. I have always enjoyed hearing your insights whenever I presented my data in the weekly EBVDT meeting. Thank you everyone for the training, assistance, and friendship. Terima kasih.

(9)

Appendices

186

To EBVDT lab mates: Rui, you are my first friend in EBVDT, thank you for showing me how to do siRNA transfection, and for answering all my naïve questions about PhD and research. I am glad that you chose me to be one of your paranymphs. If you can read this message, then it means that this thesis has reached China safely. Kieu, I enjoyed our scientific and coffee talks, I like that you are very casual yet are so outstanding in doing research. Sophie, you are a caring friend, and I admire the strong life principles that you uphold. I appreciate our heart-to-heart conversation and our daily coffee talks; in fact, I miss those days a lot. I wish you best of luck for completing your PhD and hope you will be able to cozily bond with your bundle of joy soon. Martha, although you are not here with us anymore, but I am glad that you have been part of my PhD journey. Good luck in pursuing PhD in your old lab. Yutong, I am glad that you are also my officemate. I admire your dedication and working attitude. Thanks for patiently listening to my worries and stories, you will be missed. Zhendong, I know you for the least of time, yet sitting next to you in the office and working next to you in the lab make me know more about you. You are hardworking and I know you will be able to overcome any hurdle with your hardworking attitude, as long as you are consistent. Matt, it is amazing how we can get along so well since the first day you came to our office as a junior research associate. Thank you for being the best lab mate, office mate, gossip mate, most trusted confidante, paranymph, and at last but not least, for being my personal Dutch interpreter (sincerest thanks to you for the Nederlandse samenvatting of this thesis). We learn from each other on daily basis and we influence each other in a positive way. I will miss our daily banters when I return to “Malaysia truly Asia” ষ. You, and all my EBVDT lab mates, made my life here in Groningen full of colours!

To office and lab mates: Fabian mijo, thanks for your camera, which has quickly become a joint property of the members of our office as soon as COVID kicked in. You are always full of ideas; I hope you will be able to execute all your experimental ideas successfully. Let us be successful in our respective field, mijo! Carlos Navarro mijo, our times together in the office were short, but we clicked the moment you came to our office and told us stories about horse shampoo and alpaca soap. I hope you will be able to wrap up your thesis and return to beautiful Colombia with your family soon. Yu Zhang, thanks for sharing Western blots tips and tricks with me, you are truly the king of WB! William, thanks for teaching me

(10)

187 on how to use spectral camera, and I have always enjoyed scientific discussions with you. If you happen to visit your family in Malaysia, let’s catch up! Dandan, Marloes, Ana Maria, Yuanrui, Shuxian, Christina, Chunli, Chengcheng, Cynthia, Martin, Renate, Jolien, Lian, Bram, Idil, Ching, Youhai, Nafiseh, Atiq, and many more, have helped to maintain my positive attitude in completing my PhD study. From the bottom of my heart, thank you very much, terima kasih, for your friendship. I will remember you.

To my Malaysian friends in Groningen (and in other parts of NL): Nad, Julie, Eja & Zack, Amar & Aina, Fatihah & Ammar, Najib, Noi & Alex, Diha & Bad, Ika & Syafiq, Suwan, Geok Wee, Kak Zaiti, and Sok Cin, thank you very much for letting me and my family feel welcomed with your hospitality. I will remember the moments spent together and hope we will always keep in touch.

To my family: Thank you yan and mamak for believing in me and for giving me the opportunity to pursue higher education although I know it was not easy. Part of the reason of me wanting to have a PhD is because I want to make both of you proud. Mun sik sebab doa kitak orang kakak sik di sitok. Terima kasih yan & mamak, Erna sayang kitak orang. Kepada ibu bapa mertua, adik-beradik, dan adik-beradik ipar, terima kasih atas sokongan dan doa kitak orang. To my husband, Arshad, who has been my main supporter since day 1. Thank you for the sacrifice that you have made for our family. Thank you for seeing my dream as our dream. Without your full support, I will never be able to complete my study on time. Semoga tesis tok, dan cerita susah dan senang di sebalik tesis tok, jadi kenangan hidup kita duak yang paling berharga. Kamek sayang kitak. Zahirah and Yusuf, you complete me. Thank you for loving me even although sometimes I feel like I do not do enough to deserve unconditional love from you two. Mamak sayang yan, kakak Yayah, and Cupi. Let us move forward and see what is in store for us. Family matters the most: always have and always will.

Dayang Erna Zulaikha binti Awang Hamsin

24th_{March 2021}

Groningen, the Netherlands ahdezulaikha@unimas.my

(11)

Appendices

188

ABOUT THE AUTHOR

The author of this thesis was born on the 7th_July

1986 in Bintulu, Sarawak, Malaysia. She received early education in Kidurong Primary and Secondary Public School in Bintulu, Sarawak. She then continued her studies in Universiti Putra Malaysia and graduated in bachelor’s degree in Biomedical Sciences in 2008. In 2010, she pursued master’s degree and graduated with Master’s in Pharmacology and Toxicology in 2013 from the same university. In 2016, she was awarded a ‘Skim Latihan Akademik Bumiputra’ scholarship from the Malaysian Government to pursue PhD study under the supervision of Prof. dr. Grietje (Ingrid) Molema, Dr. Jill Moser, and Dr. Matijs van Meurs. She started her PhD research in the Endothelial Biology and Vascular Drug Targeting (EBVDT) group at the Department of Pathology and Medical Biology, University Medical Centre Groningen in April 2017. She focused in understanding the cellular and molecular basis underlying endothelial heterogeneity in sepsis. Throughout her studies, she obtained the Jan Kornelis de Cock research funding twice, in 2018 and 2019. She presented her posters in two consecutive Dutch Endothelial Biology Society Meetings in 2018 and 2019. In 2019, she also participated and presented a poster in the Joint Meeting of the European Society for Microcirculation (ESM) and the European Vascular Biology Organization (EVBO) held in Maastricht. She will finish her PhD contract in April 2021, return to Malaysia with her family, and will resume her duty as a lecturer in the Faculty of Medicine and Health Sciences, UNIMAS.