met een commercieel verkrijgbare silicasol, Ludox. Dit heeft een
dichtheid van 1,4 g/ml/ maar vlokt uit wanneer er zout aan wordt
toe-gevoegd.
I
36
-dan ca. 400 mOsra, en de viscositeiten laag. Waarschijnlijk kan de dichtheid nog opgevoerd worden door de concentratie te verhogen. De
De dichtheid van Percoll is 1,13 g/ml. Volgens de fabrikant be-staat 77% van het gewicht uit water. Dat betekent dat van het volume
I
Price et al (1978) werken met een nieuwe silicasol, Percoll, met I een dichtheid van 1*13 g/ml. Hierbij zijn de silicadeeltjes gecoat met
polyvinyl-pyrrolidone, waardoor het materiaal niet toxisch is. Zij • voegen hieraan 10% zeewater, 9% sorbitol en enige zouten toe, waarmee
de dichtheid 1,15 g/ml wordt en de osmotische waarde in de buurt van zeewater komt.
Price et al (1978) werken met een osmotische waarde van 0,7 Qsm/kg, terwijl de waarde van zeewater van 35 °/oo ca. 1 Osm is, omdat hogere waarden, bij minimaal gelijke dichtheid, plasmolyse tot
gevolg hebben. I Muthe-Kaas en Seglen (1974) scheiden rattenlever-cellen met
be-hulp van Metrizamide (2-(3-acetamido-5-N-methylacetamido-2,4,6-triio- • dobenzamido)-2-deoxy-D-glucose). Dit heeft zowel wat betreft
dicht-heid, viscositeit en osmotische waarde gunstige eigenschappen. Zij ge- • bruiken het tot een dichtheid van 1,25 g/ml. De osmotische waarde is *
I I
I
prijs van een liter is bij een dichtheid van 1,25 g/ml echter al ca. f —
3.200,-. Ook is de biologische inertie waarschijnlijk minder dan die van Percoll.
Een andere mogelijkheid is zwaar water. Hiervan mag aangenomen • worden dat het inert is, maat de dichtheid is slechts 1,11 g/ml en het
is zeer duur. M Percoll lijkt het enige materiaal dat mengbaar is met zeewater,
bij een redelijke dichtheid een niet te hoge osmolaliteit heeft en • niet toxisch is. Een nadeel is de matige dichtheid 1,13 g/ml, en de • hoge prijs, ca f 200,-/1. Daar volgens opgave van de fabrikant, Phar- _ macia, Percoll voor 77% uit water bestaat, leek het niet onmogelijk gj dat de dichtheid op te voeren zou zijn. Op grond van bovenstaande
ar-gumenten werd besloten een gradiëntstof samen te stellen op basis van • Percoll, suiker en zouten, zodat er enig zout voor de algen
beschik-baar zou zijn, de osmotische waarde en pH in de buurt van die van zee- I water zouden liggen en de dichtheid zo groot mogelijk zou zijn.
2.4.2. Indikken Percoll •
I
I
I
I
I I I I I I I I I
1 i I I I
I I I I
37
-77 x 1,13 - 87% uit water bestaat en 13% uit silicabolletjes. De dichtheid van de silicabolletjes is dus (113 -87)/13 « 2 g/ml.
Percoll blijkt tot ca. 50% ingedampt te kunnen worden zonder na-delige gevolgen. Dit kan gebeuren bij ca. 35 - 40 °C in een broedstoof en duurt dan ca. 5 dagen. Door roeren kan de tijd teruggebracht worden tot ca. 3 dagen. Bij hogere temperatuur treedt irreversibele klontvor-ming op. Bij volledige droogdamping ontstaan kristalachtige structuren die niet meer in water opgelost kunnen worden.
Als 1.000 ml Percoll wordt ingedampt tot 500 m l , bestaat deze 500 ml uit 130 ml ailicabolletjes en 370 ml water, dat wil zeggen voor 26%
uit silicabolletjes en voor 74% uit water op volumebasis. De dichtheid is dan 0,26 x 2 + 0,74 x 1 = 1,26 g/ml.
2.4.3, osmotische waarde in water ten gevolge van zeezout en sucrose
Het verband tussen grammen opgelost zout en osmotische waarde in zeewater wordt goed weergegeven door de volgende formule:
O - 29 x g (Weast and Astle, 1957 (tabel 6 3, blz. D-296) (1) waarin O =• osmotische waarde in mOsmol/kg en g = grammen zout per li-ter wali-ter-
water-Het verband tussen aantal grammen sucrose per liter water en os-motische waarde wordt gegeven door:
0 = 3 x g (Weast and Astle, 1957, blz. D-308, tabel 88) (2) waarin O de osmolaliteit in mOsmol/kg en g het aantal grammen sucrose per liter water is.
2.4.4. Osmotische waarde in Percoll ten gevolge van zout en sucrose
Het verband tussen grammen opgelost zout en osmotische waarde in Percoll wordt volgens eigen metingen met een Knauer osraometer gegeven door O s 35 x g + Op
waarin O = osmotische waarde in mOsmol/kg, g = grammen zout per liter en Op a osmolaliteit van Percoll zonder zout.
Eén gram zout in een liter Percoll heeft dus volgens deze metin-gen een groter effect op de osmotische waarde dan 1 gram zout in 1 liter water. Een meer volledige ionisatie in Percoll kan hiervan de reden niet zijn: als 1 gram NaCl volledig splitst in ionen, heeft dat
38
-O = 33,35 x g + -Op.
Deze waarde ligt iets onder de gemeten 35. De reden daarvan is waarschijnlijk dat een osmometer bij hoge viscositeit een iets te hoge
I
I I
per liter oplosmiddel een verhoging van 34 mOsmol/kg ten gevolge (het • molecuulgewicht van NaCl is: 23 + 35,5 =* 58,5. 1 gram » 0,0171 mol.
Bij volledige splitsing in Na+ en Cl" geeft dit een osmotische waarde van 2x 0,0171 Osm = 34,2 mOsmol/kg) en het is uitgesloten dat een gram zeeaout meer effect heeft omdat het voor een deel uit zwaardere ionen
bestaat. Een verklaring is het volgende; f percoll bestaat voor 77% uit water en voor 23% (gewicht) uit
ge-coate silicabolletjes. Als er vanuit wordt gegaan dat deze silicabol- • letjes alleen maar volume innemen en verder geheel neutraal zijn, dan
wordt de osmotische waarde in Percoll bepaald door het aantal grammen I zout pee hoeveelheid watec in de Percoll en niet per hoeveelheid
Fer-ooll. onderstaand volgt de berekening van het verband tussen grammen • zout per liter Percoll op basis van deze redenering. • y gram zout per 1.000 ml Percoll komt overeen met _ y gram zout per 1.130 gram percoll P y gram zout per 0,77 x 1.130 = 870 ml water
y.1,15 gram zout per 1.000 ml water •
Volgens (1) geeft y.1,15 gram zout per 1.000 ml water een osmo- • tische waarde van 33,35.y mOsmol. Het verband tussen grammen zout en
osmolaliteit wordt voor Percoll dus
1
waarde aangeeft (Advanced Instruments Inc. 1971) .
I
De overeenkomst is zo goed dat aangenomen mag worden dat deze • theorie juist is.
Bij ingedikte Percoll is de viscositeit zo hoog, dat metingen met I de osmometer helemaal niet meer mogelijk zijn. De bepaling van
osmola-liteit moet daarom gebeuren op grond van bovenstaande theorie. • Voor de berekening van de osmolaliteit in Percoll ten gevolge van • zout en succose wordt dus bepaald hoe groot de osmolaliteit van het » water zou zijn als al het opgeloste materiaal alleen in de watecfrac- •
tie zou zitten. De osmotische waarde van Percoll, minder dan 20
mOsm/kg volgens de fabrikant, moet daar dan bij opgeteld worden. I Bij ingedikte Percoll is de concentratie van de silicabolletjes
twee maal 20 groot als bij gewone Percoll en moet dus het dubbele van I de door de fabrikant gegeven waacde worden opgeteld.
I
I
I I I I 1 I I I I I I
I
I 1 I I I I I I I
39
-De theorie kan getest worden aan de hand van gegevens van de fa-brikant: volgens de bijgesloten folder resulteert toevoeging van 100 ml 9% NaCl aan 900 ml percoll in een osmotische waarde van 280 - 320 mOsm/kg. De zoutconcentratie in het water is dan
9 g/(TOO ml H2O + 900 ml Percoll)
9 g/(tOO ml H2O + 783 ml H2O + 117 ml silicabolletjes) 9 g/883 ml H20
10,19 g/1.000 ml H2O
Dit geeft volgens de theorie een osraolaliteit van:
29 x 10,19 + Op = 296 + 20 = 316 mOsm/kg.
Voor suiker geeft de fabrikant dat 100 ml van een 2,5 M sucrose-oplos-sing (856 g/l) toegevoegd aan 900 ml Percoll resulteert in een osmola-liteit van 280 - 320 mOsm. De suikerconcentratie in het water wordt:
85,6 g 883 ml H2O 96,9 g/1.000 ml H2O
Dit geeft een osmolaliteit van
3 x 96,9 + Op = 291 + 20 = 311 mOsm/kg
De theorie is dus in overeenstemming met de gegevens van de fabrikant.
2.4.5. Dichtheid van oplossingen ten gevolge van zeezout en sucrose
1 gram zeezout toegevoegd aan 1 liter zoutoplossing neemt bij een concentratie tot ca. 35 g/l een volume in van ca. 0,27 ml (Weast and Astle, 1957, tabel 63 blz. D-296).
1 gram sucrose toegevoegd aan 1 1 sucrose-oplossing neemt bij een concentratie tot ca, 200 g/l een volume in van ca. 0,62 ml (Weast and Astle, 1957, tabel 88 blz. D-308).
Met behulp van deze volumina kan de dichtheid van een oplossing ten gevolge van zout- en sucrose toevoegingen betekend worden.
2.4.6. Verhouding zout- en sucrosetoevoegingen
Bij een vaste osmotische waarde kan de dichtheid het hoogst wor-den opgevoerd als alleen suiker wordt toegevoegd; sucrose draagt weliswaar per gram minder bij aan de dichtheid dan zout, maar er kan lOx zoveel gram sucrose worden toegevoegd voor dezelfde osmolaliteit bereikt is.
40
-Voor algen is de osraolaliteit niet het enige dat de physiolo-gische toestand beïnvloedt,er zal daarom ook enig zout aanwezig moeten zijn.
Als een osmotische waarde gekozen is zal dus bepaald moeten worden welk deel daarvan door zout veroorzaakt moet worden.
2.4.7. Zoutoplossingen
Het gemakkelijkst zou zijn het zout in de vorm van kristallen zeezout af te wegen en toe te voegen. Dit blijkt niet mogelijk, omdat het zeezout zo hygroscopisch is dat het moeilijk af te wegen is en omdat het zeer moeilijk oplost.
Om niet elke keer een groot aantal zouten te hoeven afwegen werd er gewerkt met zoutoplossingen. Hiervoor werd uitgegaan van het recept van kunstmatig zeewater van Kester et al zoals beschreven in Walton Smith (1974) op blz. 22, maar zonder Strontium.
Om reacties te voorkomen moet dit kunstmatig zeewater bewaard worden in twee oplossingen, & en 8, die ieder een deel van de zouten bevatten.
De zoutconcentratie is zo hoog mogelijk gemaakt om ongwenste verdunningseffecten te voorkomen.
De oplossingen hebben de volgende samenstelling:
A
NaCl 167,48 g/l oplossing 28,06 "
KCh NaHCO3
KBr H3BO3 NaF
4,74 1,37 0,69 0,18 0,02
MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O
202,54 g/l oplossing
30 3,24 g/l - MgCl2
42,52 g/l = CaCl2
141,92 g/l oplossing 32,10 g/l oplossing 174,02 g / l oplossing
I
I I I I I
I
I
I
1
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
1
I I I I I I I I I I I I
I
I I I I I I
41
-De oplossingen A en B moeten worden toegevoegd in een verhouding 4:1 om een verhouding van de zouten te verkrijgen zoals in zeewater.
De verhouding van bet aantal grammen zout uit A resp. uit B is dan 4 x 202,54 : 1 x 174,02 - 4,66 : 1.
Om de concentratie van zeewater, 35 g/l, te verkrijgen, moet dus (1/5,66 x 35)/174,02 *» 35,5 ml B + (4/5,66 x 35)/202,54 * 122,1 ml A aangevuld worden tot 1.000 ml.
2.4.3. pH
Volgens opgave van de fabrikant is de pH van Percoll ca. 8,8 en kan deze aangepast worden over een traject van 5 - 1 0 .
2.4.9. Gebruikte gradiëntstof
Er werd uitgegaan van ingedikte Percoll met een watergehalte van ca. 74% {voluaie)- Als verhouding zout-sucrose weed gekozen 4:1, dat wil zeggen dat 20% van de oamotische waarde uitgemaakt wordt door zout en 80% door sucrose.
Br werd gestreefd naar een oamotische waarde van ca. 870 mOsm/kg.
Dit komt overeen met zeewater van 30°/oo, de gemiddelde waarde van de Oosterschelde.
De hoeveelheden sucrose en zoutoplossing nodig om op 870 mosm/kg te komen zijn in eerste instantie berekend met onjuiste formules. Vol-gens die berekeningen moet aan 100 ml ingedikte Percoll van 74% water worden toegevoegd: 1,16 ml A en 0,29 ml B en 11,5 g sucrose.
Wordt aan de hand van deze hoeveelheden de osmotische waarde uit-gegerekend volgens de juiste formules dan wordt deze ca. 610 mOsm/kg
1,16 ml A + 0,29 ml B + 11,5 g s/100 ml ingedikte Percoll 1,16 ml A + 0,29 ml B + 11,5 g s/ 74 ml H2O
15,68 ml A + 3,92 ml B + 155,4 g s/1.000 ml H2O
Rekening houdend met het toegevoegde water in de zoutoplossingen en het verplaatst volume van het zout daarin wordt dit:
3,18 g zout uit A + 0,68 g zout uit B + 155,4 g s/(1000+(15,7+3,9-(3,18+0,68)x0,27)) = 1.019 ml H2O.
3,12 g zout uit A + 0,66 g zout uit B + 152,5 g s/1000 ml IÏ2°.
De osmotische waarde wordt dan gebruik makend van de formules 1 en 2 van blz. 37 en een osmotische waarde van Percoll van 20 mOsm/kg:
29 X 3,12 + 29 x 0,66 + 3 x 152,5 + 2 x 20 = 607 mOsm/kg
f
42
-Dit mengsel heeft een pH van ca. 8,2. Met 0,3 ml 4 N HCL wordt • dit op pH = 7,9 gebracht, wat overeenkomt met de gemeten waarde voor
de Oosterschelde. I Als de HCL druppelsgewijs aan de oplossing wordt toegevoegd
ont-staan vlokken die pas na zeer lang roeren weer oplossen. Als eenmaal • bekend is hoeveel nodig is, kan het gemakkelijk worden toegevoegd met • de zoutoplossingen. _ De dichtheid van deze oplossing is: | (1,16 + 0,29 + 11,5 + 74 + 52)g/(1,16 + 0,29 + 7,13 + 74 + 26) ml =
1,2S g/ml. • Door variatie in de mate van indampen kan ook enige variatie
ont-staan in de dichtheid van de gradiëntstof. Dikwijls was de dichtheid • iets hoger, tot ca. 1,30 g/ml. De osmolaliteit loopt dan op tot ca.
I
2.4.10. Terugwinnen Percoll «
Omdat Percoll niet goedkoop is, is geprobeerd het terug te winnen
met een Amicon ultrafiltratiesysteem DC-2. Dit apparaat werd ook beke- I ken op de mogelijkheid Percoll in te dikken.
5. Scheidingsprocedure
2.5.1. Maken van de gradiënt
I I
1
Er zijn verschillende mogelijkheden om de lichte en zware vloei-stoffen zo te mengen dat de gewenste gradiënt ontstaat. De simpelste
is het bovenop elkaar aan te brengen van lagen van steeds lagere • dichtheid. Dit is een discontinue gradiënt. Continue gradiënten kunnen
gemaakt worden met een systeem waarbij twee smalle buizen, de één ge- I vuld met het zware, de andere met het lichte materiaal, onderaan met
elkaar in verbinding staan. Uit de buis met het lichte materiaal wordt M vloeistof gepompt. De inhoud wordt automatisch, volgens het systeem * van de communicerende vaten, aangevuld met zwaar materiaal. Als de
buis waaruit wordt afgetapt goed wordt geroerd, wordt het aandeel van de zwace component daarin steeds groter. 2o ontstaat een continue,
bijna lineaire gradiënt. I