I I
SCHEIDING J/AN_SESTON
(ZOWEC V) EINDRAPPORT Nota: Z 82 V 5
I rijkswaterstaat - deltadienst
— milieu en inrichting
I
bibliotheek en documentatiepostbus öb3<3 4330 ff/j Middelburg
I I I I I I I I I I I I I I
" ZOWEC = ZOut Water ECologie
•
Samenwerkingsproject van:
Delta Instituut voor Hydrobiologisch Onderzoek, Yerseke en Deltadienst, Hoofdafdeling Milieu en Inrichting, Middelburg,
Auteurs: E.T. van Ierland L. Peperzak
November 1982.
rijkswaterstaat - deltadienst milieu en inrichting bibliotheek en documentatie
postbus Öb3c£
4330 fj
}Middelburg
I Scheiding van seston
•
I
™
Inhoud Blz.
Voorwoord
I I
8 Dankbetuiging
M I. Inleiding
m II, Overzicht scheidingstechnieken
III. Keuze richting onderzoek en motivering aanschaf appara- 13 tuur
IV. ZoÖplanktonscheiding 15
• V. Scheiding van veldraonsters met behulp van dichtheids
%31 gradiënten
VI. Oriënterend onderzoek met de elutriator-rotor 84
VII. Oriënterend onderzoek met de flowcytometer 92
• VIII. Dichtheid van enkele marine diatomeeën soorten en een 115 dinoflagellaat
I
IX. Samenvatting. 126
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
— 1 —
voorwoord
Op 16 maart 1979 werd bij brief nr, AL/O 18608 van de Directeur- Generaal van de Rijkswaterstaat machtiging verleend tot het doen ver- richten van onderzoek ten behoeve van zoutwaterecologie in Ooster- 3chelde en Grevelingen. Dit ZOWEC-project (code M 2000) bestaat uit vijf deelonderzoeken, nl.j
1. Mineralisatie in het water 2. Mineralisatie in de bodem 3. Kwantitatief vissenonderzoek 4. Bodem-water uitwisseling 5. Kwantificering sesfcon
Het onderzoek wordt uitgevoerd onder de wetenschappelijke verantwoor- delijkheid van het Delta Instituut voor Hydrobiologisch Onderzoek te Yerseke, De deelonderzoekingen passen inhoudelijk in het kader van het project "C-kringloop in de Grevelingen" van het Delta Instituut. On- derzoeksdoelstelling, zoals geformuleerd in notitie DDMI-79.286 luidt:
"het voorzien in een aantal belangrijke lacunes in de kennis van zout- water ecosystemen o.a. ten behoeve van het opzetten van modellen (mine-
ralisatie, visbestand, uitwisseling bodem-water, seston)".
De structuur van het ZOWEC-project is beschreven in notitie DDMI-79,286. Projectleider vanuit de Hoofdafdeling DDMI is drs. J.P, Al, terwijl de dagelijkse leiding op het Delta Instituut in handen is van Dr. P.H. Nienhuis. Bik van de vijf deelonderzoekingen heeft een projectleider, die o.a. zorg draagt voor de dagelijkse wetenschappe- lijke begeleiding van het deelonderzoek en voor de voortgangsrappor- tage. Teneinde tot een zo goed mogelijke evaluatie van de onderzoeks- resultaten te komen, is voor elk deelproject een begeleidingsgroep in het leven geroepen. Deze wetenschappelijk-inhoudelijke toetsgroep be- commentarieert de onderzoeksvoorstellen en interim- en eindrapporten.
Het dagelijkse onderzoek in de deelprojecten wordt uitgevoerd door een onderzoeker met assistent(en). Leidraad voor het onderzoek is het door de onderzoeker opgestelde, en in de begeleidingsgroep becom- mentarieerde, onderzoeksvoortstel. De voortgang van het onderzoek wordt beknopt weergegeven in een 3-4-maandelijks voortgangsrapport.
Een uitvoerig overzicht van het onderzoek vindt plaats door twee in-
terimrapporten en een eindrapport, opgesteld door de onderzoeker.
- 2 -
Dankbetuiging
I
I I
In tegenstelling tot de andere onderzoeken is dit onderzoek uit- • gevoerd op de Hoofdafdeling DDMI te Middelburg, onderafdeling hydro-
biologie. Het is gestart op 1 september 1979 door J. Elgershuizen en H T. de Booy, Deze hebben het project verlaten op 1 september 1980,
resp. 1 maart 1981. Per 1 november 1980, resp. 1 april 1981, is het m onderzoek voortgezet door E. van Ierland en L. Peperzak. Het onderzoek •
is afgerond op 1 november 1982. Veel mensen hebben er verder nog aan „ meegewerkt: een deel van de tellingen is verricht door H. Haas, die | ook bij ander lab.-werk assistentie bood. De cultures werden bijgehou-
den door R. Duin. De chlorophyl-, POC- en Siliciumbepalingen werden I gedaan door de medewerkers van het Lab. van DDMI; veel van het teken-
en typewerk ia ook door medewerkers van DDMI gedaan. V O O E de determi- fÊ natie gingen we te rade op het DIHO.
Het hele onderzoek, van opzet tot verslaglegging, werd begeleid B|
door de begeleidingscommissie bestaande uit de volgende personen: • C. Bakker (DIHO), M. Donze (KEMA), B. van Eek (DDMI), D. Eisma (NIOZ) , _, J. Elgershuizen (DIHO), V. de Jonge (BOEDE), C. Peetees (DDMI) en | W. Schreurs (DDMI).
Aan alle medewerkers hartelijk dank. I Ook A. Tulp (Ned. Kanker Instituut) en J. Elgershuizen (DIHO) ben
ik dank verschuldigd voor het mogen gebruiken van een dooc hen ontwor- • pen centrifugebuishouder met aan- en afvoerkop.
I
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
- 3 -
I. Inleiding
Seston, al het particulair materiaal in een watermonster, bestaat uit zoöplankton, phytoplankton, schimmels, bacteriën, virussen, detri- tus en anorganisch materiaal.
Voor veel onderzoek zou het nuttig zijn deze groepen te kunnen scheiden. Kwantificering van de groepen met de microscoop zou gemakke- lijker worden, kwantificering reet behulp van deeltjestelapparatuur zou zinvoller worden, en processen als photosynthese, grazing, mineralisa- tie en sedimentatie zouden per groep bekeken kunnen worden. Voor pho- tosynthese-metingen opgezet om op grond van tellingen voorspellingen te kunnen doen over de totale produktie van een phytoplanktongemeen- schap is een scheiding in phytoplanktonsoorten noodzakelijk.
Voor de pcocesmetingen is het nodig dat het materiaal levend blijft èn in dezelfde physiologische toestand als voor de scheiding
(Blgershuizen, 1980, Peeters, 1981).
Onderstaand onderzoek is opgezet om de mogelijkheden na te gaan (hfdst. II) en ten uitvoer te brengen (hfdst. IV, V en VI) van een scheiding van seston in zoöplankton, zo mogelijk in soorten, phyto- plankton, zo mogelijk in soorten, detritus en anorganisch materiaal.
Schimmels, bacterieën en virussen werden buiten beschouwing gelaten omdat dit te moeilijk werd geacht.
Hoofdstuk VII geeft ook informatie over beschrijving van seston, omdat dat in sommige gevallen een alternatief voor scheiding kan zijn.
Het onderzoek naar scheiden op dichtheid (hfdst. V) leverde ook gegevens op over de dichtheid van algensoorten. Omdat het scheidings- onderzoek maar weinig positief resultaat opleverde en extra tijd daar- in geen verbetering kon brengen, is ook aandacht besteed aan het ver- loop van de dichtheid van algen in het seizoen en in verband met het siliciumgehalte van het omringende water. Dit is beschreven in hoofd- stuk VIII.
Omdat geprobeerd is de hoofdstukken zoveel mogelijk op zich zelf te laten staan kan er enige herhaling optreden.
Literatuur
Elgershuizen, J.H.B.W., 1980. • Seston-analyse-onderzoek. Interim- verslag Delta Instituut voor Hydrobiologisch Onderzoek.
Peeters, J.C.H., 1981. Ontwikkeling van scheidingstechnieken.
Notitie DDMI-81.591.
- 4 -
I I
II. Overzicht scheidingstechnieken •
I I I I
Inhoud Blz.
1. inleiding 5
2. Grootte 5
3. Dichtheid 5
4. Valsnelheid 6
5. Optische eigenschappen 9
6. Electrische eigenschappen 9 0
7. Eigen beweging 10 H
8. Literatuur 11 I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
- 5 -
II. Overzicht scheidingsmethoden
1. Inleiding
Bij een poging tot scheiding kan worden uitgegaan van verschil- lende eigenschappen van het materiaal. Deze worden hieronder met de bijbehorende apparatuur besproken.
2. Grootte
Scheiden op grootte gebeurt met filters en gaas. Filters zijn verkrijgbaar vanaf 0,015 urn, gaas vanaf 1 vmw
Een zuivere scheiding tussen de genoemde categorieën kan dit in de meeste gevallen niet teweeg brengen. Detritus komt in alle maten voor, diatomeeënsoorten overlappen elkaar in grootte, en diatomeeën van één soort kunnen sterk in grootte verschillen. Het grootste pro- bleem bij filters en gaas is echter dat het niet werkelijk op grootte scheidt: of een deeltje erdoor gaat of niet hangt ook af van zijn val- richting, van de kracht waarmee het er eventueel doorgeduwd wordt en de hoeveelheid die al op het gaas of filter ligt. Een vergelijking op dit punt van verschillende filters is gemaakt door Sheldon (1972). De belangstelling voor het scheiden op grootte blijkt uit het feit dat er produktieproeven aan verschillende groottefracties van natuurlijke phytoplanktonpopulaties zijn gedaan (Durbin et al, 1975, Malone, 1980). Aangenomen mag echter worden dat dit alleen gebeurd is omdat een scheiding in soorten niet mogelijk was.
Onder gunstige omstandigheden kan gaas soms wel de gewenste scheiding teweegbrengen: bijvoorbeeld als toevallig een bloei van 2 duidelijk in grootte verschillende algensoorten aanwezig is.
3. Dichtheid
Voor het scheiden op dichtheid zijn verschillende apparaten ont- worpen. Het principe is echter voor allemaal hetzelfde: in een kolom wordt onderin zware vloeistof gebracht en naar boven toe stees lichte- re vloeistoffen, waardoor een gradiënt ontstaat. Na verloop van tijd zullen in de kolom gebrachte deeltjes terechtkomen in de laag die het- zelfde soortelijk gewicht heeft als de deeltjes, of deze deeltjes gaan drijven of pelletteren (neerslaan).
- 6 -
4. Valsnelheid
De valsnelheid van een deeltje wordt gegeven door de wet van Stokes:
I I I
Het nadeel van een kolom is dat het scheiden nogal lang duurt en dat de deeltjes elkaar kunnen hinderen bij het vallen.
Het eerste kan verbeterd worden door de valafstand te verkleinen, het • tweede door het oppervlak te vergroten. Het fractioneren kan dan niet
meer door een pipet of door aftappen gebeuren, vanwege de geringe • afstand tussen eventuele banden. Het verwijderen van de inhoud gebeurt
hier door de hele inhoud in precies horizontale positie op te drukken WÈ en bovenin door een kegelvormige afvoer weg te persen. Dit is een • sedimentatiekamer (Tulp et al, 1979). »
Het scheiden op dichtheid in een kolom kan ook versneld worden | door centrifugeren. Behalve sneller gaat dit ook preciezer, oradat
deeltjes met verschillend soortelijk gewicht minder gemakkelijk aan • elkaar blijven kleven. Dit kan gebeuren in oentrifugebuizen in een
swinging bucket-rotor (Hinton en Dobrota, 1976, de Jonge, 1979, Price I et al, 1974). "
Het afvoeren gebeurt hierbij ook door opdrukken via een kegelvormige
afvoer die op de buis geplaatst kan worden. Hierbij kunnen vier mon- m sters van ca. 35 ml tegelijk verwerkt worden. •
Een andere mogelijkheid is een zonale rotor. Dit is een holle ro-
terende schijf die helemaal gevuld kan worden met de gradiënt en het g monster. Deze schijf is doorzichtig, zodat tijdens het draaien zicht-
baar is wat er gebeurt {Hinton en Dobrota, 1976). Het nadeel hiervan • is dat de gradiënt en het monster tijdens het draaien aangebracht en
afgevoerd moeten worden, zodat continu moet worden opgelet. Een nadeel fl is ook dat het pellet niet terug te winnen is en dat de schoonmaak be-
werkelijk is. Een voordeel ten opzichte van de swinging bucket-rotor m kan zijn dat er een grotere hoeveelheid monster mee verwerkt kan wor- • den, ca. 500 ml. In het experimentele stadium is dit echter een na- —
deel. | Er is ook een zonale rotor met doorstroommogelijkheid, maar deze
is niet doorzichtig {Price et al, 1974). •
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
- 7 -
v = 2/9.g.r2. (p' -p)^~1.$>-1
waarin geldt: v = valsnelheid in m
g = zwaartekracht in m.sec~2 r = straal van het deeltje in m
p ' 3 dichtheid van het deeltje in kg.nr3 o 3 dichtheid van het medium in kg.m"^
Y) = viscositeit van het medium in kg.itM sec~1
^ = vormweerstand van het deeltje (dimensieloos)
Scheiden op valsnelheid betekent dus scheiden op een combinatie van grootte, dichtheid en vorm. De theorie en de praktijk van de vorra- weerstand zijn ingewikkeld (walsby en Reynolds, 1980), maar in het al- gemeen valt een groter bolletje sneller dan een kleiner en valt een bolletje sneller dan een schijfje van hetzelfde volume.
Alle apparatuur onder 2.3. genoemd is ook geschikt voor scheiden op valsnelheid. Het vereist wel een subtielere techniek omdat precies op het juiste moment moet worden afgevoerd. Als er gewacht wordt met afvoeren tot de evenwichtspositie bereikt is, wordt er in feite ge- scheiden op dichtheid. Vooral bij centrifugeren kan dit problemen op- leveren.
Omdat de physiologische toestand van algen, en daarmee ook de temperatuur, van invloed kan zijn op de dichtheid (Smayda, 1970, Wals- by and Reynolds, 1980) en de temperatuur ook via de viscositeit in- vloed heeft op de valsnelheid moeten de proeven worden uitgevoerd in een gethermostatiseerd kastje.
Er zijn ook speciaal voor het scheiden op valsnelheid ontworpen centrifuges. Eén ervan is de uitspoel-centrifuge (elutriator-rotor).
Deze werkt met een kegelvormige buis, die draait op een manier verge-
lijkbaar met die van awinging bucket-buizen. Tijdens het draaien wordt
onder in de buis, waar de centrifugaalkracht het grootst is, een
vloeistofstroom ingevoerd. Bovenin stroomt de vloeistof uit. Omdat de,
buis bovenin breder is (kegelvorm), stroomt de vloeistof daar langza-
mer. Een deeltje dat zich in de vloeistof bevindt, ondervindt twee
- 8 -
gen en detritus elkaar overlappen en de valsnelheid van algen niet soort-specifiek is.
I
I I
krachten: één naar buiten, door de centrifugaalkracht, en één naar
binnen door de vloeistroomkracht. Elk deeltje blijft hangen op die — hoogte waarop voor dat deeltje deze krachten juist in evenwicht zijn. | Wordt de stroomsnelheid opgevoerd, of de centrifugaalkracht verlaagd,
dan zullen een aantal deeltjes niet meer blijven hangen, maar afge- • voerd worden met de stroom. Door achtereenvolgens telkens hogere
stroomsnelheden in te stellen kunnen verschillende fracties worden af- M gevoerd (Knook, 1979).
Het voordeel van de uitspoelcentrifuge boven de eerdergenoemde • apparatuur is dat door de grotere krachten minder samenklontering van ™ deeltjes kan optreden. _ Een probleem kan zijn dat de range van deeltjes die tegelijk in » | de scheidingskamer kan zijn misschien te klein is vooc een veldmon-
ster: het is mogelijk dat de langzaamvallende deeltjes al uitspoelen, • terwijl de snelvallende tegen de bodem kapot slaan. Dit zou betekenen
dat een monster verschillende malen door een centrifuge gevoerd zou • moeten worden.
Een groter probleem is waarschijnlijk dat de valsnelheid van al- *
I
Als de deeltjes eerst op dichtheid zijn gescheiden speelt alleen
de vorm (voor diatomeeën betekent dat min of meer: soort) en grootte • een rol.
Sc ia nog een centrifuge die op valsnelheid scheidt: de door- I stroomcentrifuge . Dit is een cylindervormige trommel die "om zijn
lengte-as draait. Deze wordt gevuld met een vloeistof. Ook hier komt • onderin een vloeistofstroom, die bovenin*weer wordt afgevoerd. De een-
trifugaalkracht staat hier echter loodrecht op de stroomrichting. *m Deeltjes worden dan ook naar buiten geslingerd. Grotere en zwaardere m deeltje sneller dan kleinere en lichtere. Deeltjes met grote valsnel-
heid pelletteren dus onderin de trommel tegen de wand, deeltjes met I kleinere valsnelheid bovenin (Holland, 1980).
Dit apparaat is ontworpen om het seston in het veld uit grote • hoeveelheden water te halen, voor levend scheiden is het niet ge-
schikt, omdat het materiaal tegen de wand kapot slaat. Wel kan dit ap- fÊ paraat gebruikt worden om in het veld te kijken of verschillende soor- * ten algen zich op valsnelheid laten scheiden.
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
5. Optische eigenschappen
Scheiden op optische eigenschappen kan gebeuren met de FACS II flowcytometer (Herzenberg et al, 1976, Trask et al, 1982). Dit apparaat bekijkt elk deeltje apart op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing en fluorescentie. Het wordt vooral gebruikt in het medische onderzoek. Per seconde kunnen ca. 5.000 cellen geteld worden. Bén categorie deeltjes naar keuze kan dan worden opgevangen.
Dat scheiden kan echter alleen gebeuren met deeltjes van ca. 3 - 5 0 jim.
Voor veldmonsters betekent dit dat gezeefd moet worden over 40 um.
Tellen en beschrijven zonder scheiden kan gebeuren tot 80 pnw Een apparaat dat 5.000 deeltjes per seconde telt, kan zeer snel genoemd worden, voor scheiden is dit echter langzaam. De cellen blijven levend, maar of de physiologische toestand onveranderd blijft is niet zeker.
Nadeel van dit apparaat is ook dat het ca. f 500.000,- kost, en vrijwel permanent een technicus op HTS-niveau nodig heeft om het in bedrijf te houden.
6. Electrische eigenschappen
Afhankelijk van de electrische eigenschappen van het oppervlak bewegen deeltjes zich in electroforese-apparatuur naar de anode of de kathode. Ook de snelheid waarmee dit gebeurt kan een scheiding tussen verschillende soorten deeltjes bewerkstelligen. Met zoetwateralgen werd door Bayne en Lawrence (1972) een gedeeltelijke scheiding be- reikt. De overlapping tussen de pieken was echter zeer groot. Volgens Sakshaug (1980) gaat dit niet bij zout water, omdat de apparatuur bij hoge conductiviteit niet meer werkt. De algen zouden dan eerst in zoet water gebracht moeten worden en dus niet meer levend kunnen blijven.
Hunter en Liss (1982) doen echter wel electroforese-proeven met
gesuspendeerd materiaal in zout water, niet in verband met scheiding,
maar in verband met flocculatie. Zij vinden tussen deeltjes in het-
zelfde water een zeer grote overeenkomst in electrische oppervlakte-
lading, waarschijnlijk door een coating van metaaloxide of organisch
materiaal. Dit, en de matige resultaten van Bayne en Lawrence, maken
het niet waarschijnlijk dat electroforese zoutwatermonsters kan schei-
den.
- 10 -
i
I
7. Eigen beweging |
Phytoplankton •
Plagellaten en dinoflagellaten zouden met behulp van hun eigen I beweging van de rest van het seston gescheiden kunnen worden. Van een
aantal soorten is bekend dat ze naar lichtbronnen toe of er vanaf be- M wegen, afhankelijk van de intensiteit van het licht, de golflengte, » het uur van de dag of nacht, de ionensamenstelling van het water en de _ voorgeschiedenis (Seitz, 1975). De factocen die deze beweging regule- | ren werken waarschijnlijk zeer ingewikkeld samen. De literatuur bevat
over dit onderwerp dan ook regelmatig tegenstrijdigheden. • Theoretisch kan de snelheid van voortbewegen groot genoeg zijn om
een scheiding te bereiken: Euglena gracilis kan zich voortbewegen met • een snelheid van 0,15 mm/sec (Seitz, 1975), Rhodomonas spec. met 0,05
mm/sec (eigen waarneming). Gezien het bovenstaande is het echter niet ÊÊ waarschijnlijk dat het in de praktijk ook werkt. " ™
Zoöplankton m
Zoöplankton reageert dikwijls met gerichte bewegingen op licht. I Vragen over het mechanisme wat daar achter zit zijn nog lang niet
opgelost (Seitz, 1975), maar verschillende onderzoekers hebben er met • succes gebruik van gemaakt om zoöplankton in open water te vangen
(Baylor & Smith, 1953, Jones, 1971, Ervin & Haines, 1972, Espinosa & • Clark, 1972, Apperson & Jows, 1976), of ora er zoöplankton mee uit een • monster te lokken (Ervin & Haines, 1972, Heerkloss & Arndt, 1981).
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
- 11 -
8. Literatuur
Apperson, C.S., D.G. Yows, 1976.
A light trap for collecting aquatic organiams, Mosquito news 36 (2): 205-206
Baylor, E. and F. Smith, 1953. A physiological light trap. Ecology 34:
223-4
Bayne, D.R, and J.M. Lawrence, 1972. Separating constituents of natura! phytoplankton populations by continuous particle electrophoresis. Limnol. Oecanogr. 17: 481-489
Durbin, E.G., R.W. Krawiec and T.J. Smayda, 1975. Seasonal studies of the relative importance of different size fractions of phy- toplankton in Narraganset Bay (U.S.A.) . Mar. Biol, 32:
271-87
Ervin, J.L. and T.A. Haines, 1972. Using light to collect and separate zoöplankton. The Progressive fish culturist Vol. 34 (3):
171-174
Espinosa, L.R. and W.E. Clark, 197 2. A polypcopylene light trap for aquatic invertebrates. Cal. Pish and Game 58: 149-52
Heerkloss, R. and H. Arndt, 1981. Eine Lichtfalle sur Reinigung von Zooplanktonproben. Wissenschaftliche Zeitschrift der Wil- helm-Pieck Universitat Rostock - 30 Mathematische- Naturwis- senschëftliche Reihe - 4/5
Herzenberg, L.A,, S.G. Sweet and h.h* Herzenberg, 1976. Pluorescence- activated| cell sorting. Scientific American 234, 3: 108-131 Hinton, R. and M. Dobrota, 1976. Density • gradiënt centrifugation.
North-Hoiland Publishing Company Amsterdam
Holland, A., 1980. jHet bemonsteren,van gesuspendeerd materiaal in op-
i
pervlakt^wateren. Nota DDMi-80.07
Hunter, K.A. and P.S. Liss, 1982. Organic matter and the surface charge oj: suspended particles in estuarine waters. Limnol.
Oceanogrj 27 (2): 322-335
Jones, D.A., 1971^ A new light-trap for plankton. Lith. Eur. Mar.
Biol. Symp. Cambridge: 487-493
Jonge, V.N, de, 19|79. Quantitative separation of benthic diatoms from sediment$ using density gradiënt centrifugation in the col- loidal sflica Ludox TM. Marine Biol. 51: 267-278
- 12 -
I I I I I
Knook, D.L., 1979. CentriÊugal elutriation: Separation of living cells. In Peeters, H. ed, Separation of cells and subsel-
lular elements. Pergamon Press Ltd • Malone, T . C , 1980. Algal size. In: Morris, l,ed. The physiological
ecology of phytoplankton. Blackwell scientific publications, ÊÊ Oxford
Price, C.A., L,R. Mendiola-Morgenthaler, M. Goldstein, E.N. Breden and R.R.L. Guillard, 1974. Harvest of planktonic marine algae by centrifugation into gradients of silica on the CP-6-contin- uous flow zonal rotor. Biol. Buil. vol. 147 (1): 136-146 Sakshaug, E., 1980. Problems in the methodology of studying phyto-
plankton. In Morris, I. ed. The physiological ecology of I phytoplankton. Blackwell Scientific Publications Oxford
Seitz, K., 1975. Orientation in space: plants. In: Kinne, O. ed. • Marine Ecology 2,2; 451-497
Sheldon, R.W., 1972. Size separation of marine seston by membrane and • glassfiber filters. Limnol. Oceanogr. 17 (3): 494-8 ™ Smayda, T.J., 1970. The suspension and sinking of phytoplankton in the » sea. Oceanogr, Mar. Biol. Ann. Rev. 8: 353-414 W Trask, B.J., G.J. van den Engh and J.H.B.W. Elgershuizen, 1982. Ana-
lysis of phytoplankton by flowcytometry. Cytometry Vol. 2 I (4): 258-264
Tulp, A., J. van der Steen and M.G. Barnhoorn, 1979. A sorter of • cells, chromosomes and nuclei that combines simplicity with
good resolution. in: Peeters, H., ed. Separation of cells M and subcellular elements. Pergamon Press Ltd. Oxford ™ Walsby, A.E. and C.S. Reynolds, 1980. Sinking and floating. In:
Morris, I., ed. The physiological ecology of phytoplankton.
Blackwell Scientific Publications Oxford
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
- 13 -
III. Keuze richting onderzoek en motivering aanschaf apparatuur
Op grond van het voorgaande leek het het meest voor de hand te liggen het zoöplankton met licht uit het monster te lokken. Er werd besloten verschillende in de literatuur beschreven apparaten op hun bruikbaarheid te testen, deze eventueel te verbeteren, en zo nodig nieuwe te ontwikkelen.
Voor het scheiden van het andere materiaal leek de flowcytometer zeer veelbelovend. Dit apparaat heeft echter nadelen die het niet in aanmerking deden komen:
1. Het bestaande apparaat kan alleen deeltjes van 3-40 yin scheiden 2. Het apparaat is electronisch zo ingewikkeld dat er gespecialiseerd
personeel nodig is om het in bedrijf te houden.
3. Een poging tot aanpassing zó dat het geschikt zou zijn voor deel- tjes tot 100 urn zou een zeer grote technische kennis en vaardigheid eisen.
4. Het apparaat kostte meer dan het budget toeliet.
Wel werd het belang van het apparaat ingezien en werd besloten TNO een onderzoekje naar de mogelijkheden van het apparaat voor phyto- planktononderzoek te laten doen (Trask et al, 1982) en werd later een eigen oriënterend onderzoek met veldmonsters gedaan (dit rapport, hfdst. v i l ) ,
Scheiden op eleotrische eigenschappen kwam op grond van het bo- venstaande geheel niet in aanmerking.
Eigen beweging van algen is niet veelbelovend, voor oriënterende proeven is echter geen speciale apparatuur nodig, zodat de mogelijk- heid hiervoor altijd openstaat.
Voor het scheiden op valsnelheid valt de doorstroomcentrifuge, aan- wezig bij de Deltadienst, af, omdat het materiaal daarin niet levend kan blijven.
Levend scheiden op valsnelheid zou mogelijk wel kunnen gebeuren in een uitspoelcentrlfuge. Hierbij is de scheidingskamer echter slechts 5 ml groot. Dit werd als een te groot bezwaar gezien voor aan- schaf. Ook hier is echter een oriënterend onderzoek mee uitgevoerd
(hfdst. V I ) .
Scheiden op valsnelheid heeft ook het bezwaar dat het scheiden
gebeurt op een combinatie van drie eigenschappen van het deeltje:
- 14 -
Literatuur
I
I
grootte, dichtheid en vorm. Meer voor de hand liggend leek het daarom • in elk geval eerst de mogelijkheden van scheiding op dichtheid uitput-
tend na te gaan. I Een swinging bucket centrifuge is bij de Deltadienst aanwezig,
maar de voordelen van het kunnen zien wat er gebeurt tijdens centrifu- M gatie en de mogelijkheid tot het verwerken van grote hoeveelheden mon- • ster leken reden genoeg om een zonale rotor aan te schaffen. Omdat bij
een zonale cotor met dootstroomsysteem niet zichtbaar is wat er ge- beurt viel dit apparaat af.
Besloten werd dus het zoöplankton met licht uit de monsters te M lokken en de rest van het monster, eventueel na grootte-scheiding, te
proberen te scheiden op dichtheid met behulp van de zonale rotor (zon- • der doorstroomsysteem) en de swinging bucket rotor.
De andere mogelijkheden tot scheiding zouden echter niet geheel M uit het oog verloren mogen worden. *
» 0
W
Trask, B.J., G.J. van den Engh and J.H.B.W. Blgershuizen, 1982. J|
Analysis of phytoplankton by flowcytometry. Cytometry vol 2
(4): 258-264. •
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I
I
- 15 -
IV. Zoöplanktonscheiding
Inhoud Blz.
1. Inleiding 16
2. Materiaal en methode 17 2.1. Monstername
1 2.2. Scheidingsapparaten 2.3. Experimenten
2.4. Tellingen en determinaties
3. Resultaten 21
• 3.1. Vergelijking apparaten 3.2. Modificatie apparaat nr. 1 JË 3.3. Invloed tijd
3.4. Invloed zwemrichting
1 3.5. Invloed lichtsterkte en -kleur 3.6. verontreiniging en vermenging 3.7. Waarnemingen
1 1 1 1 1 1 1 1 1
4. Discussie
5. Samenvatting
6. Literatuur
26
29
30
- 16 -
IV. Zoöplanktonscheiding
1. Inleiding
Een andere methode is te proberen in een met een net veczameld monster een scheiding aan te brengen tussen zoöplankton en ander mate-
is van verschillende lichtsterkten en -kleuren.
I
I I
I
Zoöplankton wordt over het algemeen verzameld door met een net • een aantal halen door het water te doen. De op deze manier verkregen
monsters bevatten ook phytoplankton, bacteriën, detritus en anorga- M nisch materiaal.
Voor grazingsproeven en chemische bepalingen is het noodzakelijk dat het monster alleen zoöplankton bevat, voor tellingen is het gemak- kelijk. Dit scheiden van het zoöplankton van de rest van het monster
kan gebeuren door óe dieren stuk voor stuk met een pincet of pipet uit 0 het monster te halen, maar dit is zeer tijdrovend. Er zijn daarom ver-
schillende andere manieren ontwikkeld om te proberen zoöplankton zui- • ver in handen te krijgen.
Eén methode is te zorgen dat alleen zoöplankton gevangen wordt. • Omdat veel zoöplankton aangetrokken wordt door licht kan dit gebeuren
met behulp van een lichtval (Baylor & Smith, 1953, Jones, 1971, Ervin •
& Haines, 1972, Espinosa & Clark, 1972, Apperson & Yows, 1976). ™
I
riaal met behulp van licht {Ervin & Haines, 1972, Heerkloss & Arndt,
1991). Bevat het monster naast zoöplankton vooral veel anorganisch ma- I teriaal of moet zwaar plankton, bijvoorbeeld foraminiferen, apart wor-
den verkregen, dan wordt ook wel op soortelijk gewicht gescheiden (Be, I
I I
1959, McGowan & Fraundorf, 1964, Anderson, 1981). Deze methode wordt vanwege het vele anorganische materiaal vooral bij benthosmonstets toegepast (Anderson, 1959, de Jonge and Bouwman, 1977, Koosman, 1977, Nichols, 1979).
Bij dit onderzoek was het de bedoeling de copepoden speciaal voor grazingproeven uit het monster te halen. Sr moest dus zo min mogelijk
phytoplankton tussen de copepoden zitten. Op grond van het bovenstaan- • de leek dit het best te kunnen gebeuren door de copepoden met behulp
van licht uit het mosnter te lokken. Vijf hiervoor bedoelde apparaten, • nieuwe en oude, werden getest en hun efficiënties werden vergeleken.
Met het best werkende apparaat werd nagegaan of de richting waar- • in het zoöplankton zich begeven moet van invloed is, en wat het effect *
I
I
I I I I I I I I I I
I I I I I I I I I I I
17 -
2. Materiaal en methode
2.1. Monstername
De monsters werden genomen met een 60 n-planktonnet in Sophiaha- ven in de Oosterschelde, door vanaf een steiger zoveel horizontale en vertilcale trekken te maken dat er genoeg zoöplankton werd verkregen.
Het net werd telkens na enkele trekken afgetapt.
2.2. Scheidingsapparaten
De vijf scheidingsapparaten berusten allemaal op hetzelfde prin- cipe; een donkercompartiment van ca. 100 ml voor het monster, en een lichtcompartiment voor gefilterd water om het zoöplankton naar toe te lokken. Het verschil tussen de apparaten wordt bepaald door het com- promis dat is gesloten om de beide compartimenten gemakkelijk te kun- nen vullen en de vermenging tijdens de proef zo gering mogelijk te laten zijn.
Hieronder volgt een afbeelding (fig, 1) en een beschrijving van ieder apparaat.
Apparaat 1 is een erlenmeyer met een smalle opening, 1,4 cm, die met behulp van zwart plastic donker gemaakt is tot de aangegeven hoog- te. Het monster wordt in het donkercompartiment gedaan en dit wordt in een met gefilterd zeewater gevuld bekerglas gezet.
Apparaat 2 is in principe gelijk aan 1, maar heeft een kleinere opening, 0,8 cm, en minder steile wanden.
Apparaat 3 is een improvisorisch uit plastic fleasen gemaakt ap- paraat naar voorbeeld van Ervin & Haines (1972). Het lichtcompartiment bevindt zich hierbij onder het donkercompartiment. Er wordt zoveel ge- filterd water in gedaan, dat het lichtcompartiment vol is en in het donkercorapartiment ca. 1 cm water staat. Dan wordt het monster voor- zichtig in het donkercompartiment gebracht, zover mogelijk van de ope- ning naar het lichtcompartiment. Om oppervlakte-effecten te voorkomen kan het monster met een trechter onder het oppervlak worden gebracht.
Apparaat 4 is een uit plexiglas vervaardigd apparaat naar ontwerp
van J. Elgershuizen (Delta Instituut voor Hydrobiologisch Onderzoek,
ïerseke). Het uitwisselingsoppervlak tussen licht- en donkercomparti-
- 18 -
.1.4
^
9 cm
I 6 c m I
14 cm
0.6 cm £ Som
11 cm
o.a
.5
14. cm
®
11cm IS cm
- - ivy~.
7 Om
5 c m
'T
0.5 10cm
4 cm
9cm
60 cm
18 cm
d*ltx!l#mt
A 4
"«,»• « , » « T
Pig. VI-1. Apparaten voor scheiding van zoöplankton.
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I
1
I I I I I I I I I I I
- 19 -
ment ia hierbij zo groot mogelijk gemaakt. De compartimenten kunnen voor het vullen en legen van elkaar gescheiden worden door twee schij- ven met uitsparingen elkaar juist niet overlappen. De werktekening wordt gegeven in een bijlage.
Apparaat 5 is een door een glasblazer gemaakte kolom mefc een aan- tal aftappunten en een reservoir. Deze kolom is ook geschikt voor be- zinkingsproeven. Er wordt eerst 400 ml gefilterd zeewater ingegoten, daarna wordt het monster voorzichtig onderlangs ingebracht via het re- servoir. Het gedeelte waar het monster in zit kan met plastic donker gemaakt worden.
Om vermenging tegen te gaan kan in de apparaten waarbij het lichtcompartiment zich boven het donkercompartiment bevindt (1, 2, 4 en 5) het soortelijk gewicht van het monster verhoogd worden door de toevoeging van 5% v/v Percoll (Pharmacia, Fine Chemicals), een goed met water mengbare onschadelijke stof met een soortelijk gewicht van
1,13 g/ml.
De gebruikte verlichting bestond uit 10W, 12V, of 25W, 12V auto- lampjes, die zo dicht mogelijk bij de opening van het donker- naar het lichtcompartiment werden gebracht. Bij apparaat nr. 3 wordt de ver- lichting onder het lichtcorapartiment aangebracht. Het was niet moge- lijk de lichtsterkte in de donkercompartinienten te meten, zodat geen getallen bekend zijn over lichtsterkte waarop het plankton reageert.
2.3. Experimenten
Vergelijking apparaten/ invloed tijd, temperatuur, lichtkleur en -sterkte
Per monsterdag werden meestal 3 apparaten vergeleken. De proeven werden altijd zo snel mogelijk na monstername uitgevoerd, meestal bin- nen twee uur.
Het monster werd in het donkercompartiment gedaan en het licht- compartiment werd gevuld met zuurstofrijk gefilterd water, afkomstig uit hetzelfde gebied als het monster.
De experimenten werden uitgevoerd in een thermostaatiseerbaar
kastje, gewoonlijk bij een temperatuur die hoogstens enkele graden
verschilde van de buitentemperatuur.
I
- 20 -
I
De vergelijkingsproeven werden gedaan met een verlichting van I 10W.
Na 60 minuten werden de compartimenten gescheiden en de inhoud I geteld. Soms werd het lichtcompartiment twee keer gevuld met water en
werden tellingen uitgevoerd na 30 en na 60 minuten. • Er zijn enkele experimenten gedaan waarbij de temperatuur ca. ™ 10* C boven de buitentemperatuur lag. _ Evenals een enkele maal is geprobeerd of de kleur van het licht V het percentage reagerend zoöplankton kon beïnvloeden. Deze proeven
zijn uitgevoerd met apparaat 1. De gewenste kleur werd met behulp van • filters verkregen. Er werd gewerkt met rood licht (650 - 800 n m ) , met
blauw licht (360 - 500 nm) en met wit licht. De intensiteiten werden • gelijk gehouden.
Het effect van lichtsterkte is getest met apparaat nr. 1. Hiertoe tt werd gewerkt met lampjes van 10 en 25W. •
De efficiëntie van apparaat nr. 1, de erlenmeyer met opening van 1.4 cm, is vergeleken met die van een erlenmeyer met opening van 2.5 cm.
Invloed zwemrichting
Apparaat nr. 1 is getest in verschillende standen om na te gaan of het nog verschil maakte of het zoöplankton naar boven, naar beneden
is gebeurd met een lampje van 25W.
Vermenging
I I
of naar opzij moest zwemmen om in het lichtcompartiment te komen. Dit *
I
De vermenging van de vloeistoffen in de twee compartimenten is
I
bepaald met behulp van Evans Blauw en een Pye unicam spectrophotome- • ter. De donkercompartimenten werden gevuld met een oplossing van Evans
Blauw (0,1 g / l ) . De lichtcompartimenten werden gevuld met water. Na M uitvoering van de scheidingsprocedure werd de concentratie Evans Blauw
in het lichtcompartiment bepaald door meting met de spectrophotometer tm bij 620 nm. Met behulp van de volumina werd het percentage vloeistof W dat uit het donkercompartiment door vermenging in het lichtcomparti-
ment was gekomen berekend. Bij apparaat 4 en 5 is dit ook gedaan met • 5% Percoll in het donkercompartiment.
I
I
I
I I I I I I
1
I I I I I I I I I I I I I
2.4. Tellingen en determinaties
Voor de tellingen werd het monster zonodig geconcentreerd roet een 60 pm-zeef» Het zoöplankton werd gedood met 1 ml Natriumazide 10% per 100 ml om een betrouwbaar submonster te kunnen nemen met een plunjer- pipet en het tellen mogelijk te matten. Meestal werden de tellingen ge- daan in een 0,5 ml Kolkwitz-kamer. Bij kleine aantallen werd het hele monster over 1 pm membraanfliters, 0 47 mm, gefiltreerd en het zoö- plankton op het filter geteld.
Het zoöplankton bestond vooral uit copepoden, voornamelijk Temora longicornis, Aoartia clausi en Pseudocalanus sp., en uit jeugdstadia hiervan en van zeepokken. Als er aanleiding was te veronderstellen dat er verschil in reactie was tussen de categorieën copepoden en jeugd- stadia werden deze categorieën apart geteld.
Soms zaten er veel polychaetenlarven in het monster. Deze werden niet geteld, wel werd gekeken of ze in beide compartimenten ongeveer evenveel voorkwamen. Naar Protozoën werd helemaal niet gekeken.
3. Resultaten *
3.1. Vergelijking apparaten
De resultaten van de vergelijking van de vijf verschillende appa- raten staan in de tabellen 1 - 3.
Tabel 1 geeft vooc elk experiment het percentage copepoden of copepoden èn jeugdstadia dat uit het monster gelokt is. Dit percentage wordt verder de efficiëntie genoemd. In het begin werd geen onder- scheid gemaakt tussen de verschillende categorieën, omdat daar geen aanleiding toe leek te bestaan. Als er geen verschil is mag de effi- ciëntie voor grote copepoden gelijk gesteld worden aan die voor het totaal. Voor de volledigheid is toch in de kolom "Telling" vermeld of het om het totaal of om de grote copepoden alleen ging.
Indien er gewerkt werd bij een andere temperatuur dan de tempera-
tuur van het water waaruit het monster kwam staat de werktemperatuur
naast de buitentemperatuur vermeld.
- 22 -
Tabel IV-1. Efficiënties voor copepoden per apparaat. T : copepoden en jeugdstadia geteld, C : alleen copepoden geteld,
e ; gemiddelde efficiëntie, s : standaardafwijking, n : aantal waarnemingen.
datum 23/10 30/10 6/11 13/11 19/11 27/11 2/12 18/12
7/1
8/1 14/1 21/1 22/1 28/1 4/2 5/2 11/2 18/2 25/2 4/5 e s n1 29
39
77
8079
69 70 77 87 71 71 67 50 53 5351
60 25 62 18 182 10 25 35 23 29 14 11 34 24
23 10 9
apparaat
3
32 68 81 57
50 58 19 5
4
52 80 9 52 83 74 79 72 65 64
51
79 39 38 75 4560 20 16
5
100
7 55
58 65 69 92 48 36 32 56 1916
80 3051 28 15
e
20 29 52 53 43 44 89 2755 59 70 75
8461
57 50 6237
3669
45 38telling T
T T T T T C T
C
c c c c c c c c c c c c
T
werk
t°c
10 15
12 15
15 15
buiten
t°c
12
9 3 3 3 3 1
2
2 2 3 34
4 3 8De gemiddelde efficiënties van de verschillende apparaten blijken vrijwel gelijk te zijn, alleen apparaat 2, de erlenmeyer met de kleine opening geeft significant slechtere resultaten dan de vier andere
{t-toets, p(0,005).
Uit de experimenten blijkt geen invloed van de temperatuur (t-toets, p>0,05) .
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
- 23 -
Tabel 2 geeft de efficiënties van de verschillende apparaten voor de jeugdstadia van copepoden. Apparaat 2 geeft ook hier slechtere re- sultaten, maar door het geringe aantal waarnemingen is dit niet signi- ficant. De andere apparaten vertonen geen verschil.
Tabel 3 geeft de resultaten van de vergelijking van drie appara- ten voor de jeugdstadia van zeepokken. Hiervoor blijken de apparaten 4 en 5 significant slechter te werken dan apparaat 1 (t-toets, p<0,005).
Tabel IV-2. Efficiënties voor jeugdstadia van copepoden per appa- raat, e : gemiddelde efficiëntie, s : standaardafwij- king.
datum 2/12 18/12
7/1 8/1
e s1 40 83 46 79 62 22
apparaat 2 13 62
40
31
4 71 71
49 33 56 185 10 100 60 100 68 43
Tabel IV-3. Efficiënties voor jeugdstadia van zeepokken per appa- raat, e t gemiddelde efficiëntie, s : standaardafwij- king.
datum 4/2 5/2 11/2 18/2 25/2
e s
apparaat 1 70 66 82 86 81 77 9
4 42 32 49 50
41 43 7
5
13 17 8 63 13 24 22- 24 -
3.2. Modificatie apparaat nr. 1
De resultaten van de proeven waarmee de efficiëntie van apparaat nc. 1 vergeleken wordt met die van een erlenmeyer met opening van 2,5 cm staan in onderstaande tabel. De erlenraeyer met brede opening geeft slechtere resultaten, maar door het geringe aantal waarnemingen is dat niet significant.
Tabel IV-4. Efficiënties voor copepoden en jeugdstadia van zeepokken voor een Erlenmeyer met een opening van 1,4 en 2,5 era.
copepoden datum
2/7 8/7 20/7
1,4 cm
73 91
jeugdstadia 2,5 cm
56 59
van 1
zeepokken ,4 cm 2
74 49
,5 cm 70 39
3.3. Invloed tijd
Direct na het aanzetten van het licht kon men het zoöplankton in het lichtcompartiment zien komen. Na een half uur verschenen echter ook nog beesten. Soms kwam 30% van het totaal in het 2e halfuur. Het aantal wat nog later verscheen was verwaarloosbaar. De duur van de proeven werd daarom op 60 minuten gesteld.
3.4. Invloed zwemrichting
De resultaten staan in tabel IV-5.
Tabel IV-5. Efficiënties bij verschillende zwemrichtingen voor copepoden en jeugdstadia van zeepokken. Apparaat nr, 1,
datum 17/6 29/6 2/7 8/7 16/7 20/7 11/8
copepoden boven
53 47 79 73 89 91 71
beneden 93 72 100 98
opzij
92 89 66
jeugdstadia boven 60 56
74 67
49 86zeepokken beneden
100 94 98 97
opzij
88 94
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I I I I 1 I I I I I I I I I I I I 1 I I
- 25 -
De erlenmeyer met de opening naar beneden blijkt iets beter te wecken dan met de opening een andere kant op. Naar boven of naar opzij heeft geen effect.
3.5. Invloed lichtsterkte en -kleur
De resultaten van de proeven met verschillende sterkte en ver- schillende kleuren licht staan in tabel IV-6 en IV-7. Er blijkt uit dat noch de sterkte noch de kleur veel invloed heeft.
Tabel IV-6. Efficiënties voor copepoden en jeugdstadia van zeepokken bij 10W» 12V en 25W, 12V. Apparaat nr. 1.
copepoden jeugdstadia van zeepokken
datum 10W 25W 10W 25W
14/5 11/8 11/8
51 66 83 63
65 57 71 64
53 96 86 78
100 88 74 87
Tabel IV-7. Efficiënties voor copepoden en jeugdstadia van zeepokken bij verschillende kleuren licht, e : gemiddelde effi- ciëntie. Apparaat nr. 1,
copepoden jeugdstadia van zeepokken datum blauw rood wit blauw rood wit
12/3 19/3 26/3
65 62 60 58
56 70 70
70 66
70 38 64 82
61 65 68 64
71 55 72 66
66 67 67
3,6. Verontreiniging en vermenging
Verontreiniging van het zoöplankton met andere deeltjes uit het donkercompartiment kan optreden door vermenging van de inhoud van bei- de compartimenten, doordat deeltjes gaan drijven (apparaat 1, 2, 4 en 5) of zinken (apparaat 3t en 1 met zwemrichting naar beneden) en door- dat algen of andere deeltjes aan de poten van het zoöplankton worden
- 26 -
voor de verschillende apparaten in tabel IV-8. De vermenging wordt uitgedrukt als het percentage vloeistof uit het donkercompartiment dat in het lichtcompartiment gekomen is.
Tabel IV-8. Vermenging inhoud licht- en donkercompartiraent in pro- cent.
zonder verzwaring met verzwaring met
met Percoll Percoll
1 0
2 0
Apparaat 3 0,5
4 15
1
5 2 0
4. Discussie
Vier van de vijf geteste apparaten blijken niet te verschillen in de efficiëntie waarmee het grote zoöplankton uit het monster wordt ge-
I
I
meegevoerd. Ook na de scheiding uitgeworpen faecaliën veroorzaken ver- | ontreiniging.
De vermenging van de vloeistoffen uit beide compartimenten staat I
I I I I
zonder gebruik van de verzwarende vloeistof blijkt de vermenging M alleen in apparaat 4 aanzienlijk. Mèt percoll is hij ook daar*verwaar-
loosbaar. m In hoeverre verontreiniging door drijven of zinken voorkomt hangt m af van het soort monster. Deze verontreiniging is echter vooe of na ^ scheiding gemakkelijk te verwijderen door afschuimen of afgieten. J
Het meevoeren van algen en andere deeltjes aan de poten en het
uitscheiden van faecaliën is theoretisch voor alle apparaten gelijk. •
3.7. Waarnemingen B
Larven van Polychaeten (Borstelwormen) zijn in beide compartimen- m ten waargenomen, m Br werd geen verschil gezien tussen beesten die in het donkercom- ^ partiment waren achtergebleven en beesten die naar het liehtcomparti- JH ment waren gegaan. In beide compartimenten werden zeer weinig dode of
beschadigde beesten aangetroffen. •
I
I
I
I
•
I I I
1
I I I I I I I I I I I I I I I I
- 27 -
lokt. Eén apparaat, de erlenmeyer met de opening van 0,8 cm, was dui- delijk minder efficiënt. De reden hiervoor kan zijn de kleine opening, maar ook de minder steile wanden en het feit dat het apparaat geheel donker was gemaakt, waardoor het licht binnenin misschien minder waar- neembaar was dan in de andere erlenmeyer. Dit laatste lijkt het meest waarschijnlijk omdat apparaat nr. 3 een nog smallere opening heeft, 0,5 cm, en wel een goed resultaat geeft.
De andere apparaten verschilden wel in vermenging, verontreini- ging, gebruiksgemak en efficiëntie met betrekking tot jeugdstadia van zeepokken. Apparaat nr. 3, met het lichtcompartiment onder het donker- compartiment, naar Ervin en Haines (1972), was voor de gebruikte mon- sters minder geschikt omdat deze nogal wat bezinkend materiaal bevat- ten, maar kan wel geschikt zijn voor monsters met zwevende blauwal- gen. Apparaat nr. 4, met het diafragma en het grote uitwisselingsop- pervlak, gaf zonder verzwarende vloeistof een te hoge vermenging. Nr.
5, de kolom, moest met grote zorg worden gevuld om vermenging te voor- komen. De nrs. 4 en 5 blijken bovendien significant slechter te werken voor de jeugdstadia van zeepokken. Dit wordt veroorzaakt door het te- rugvallen van de dieren in het donkercompartiment. Dit gebeurt niet bij de erlenmeyers, omdat daar de opening te klein is. Vergroting van de opening blijkt daarbij dan ook een negatief effect te hebben.
De erlenmeyer met opening van 1,4 cm, apparaat nr. 1, blijkt dus zowel wat betreft efficiëntie voor jeugdstadia van copepoden en zeepokken, als wat betreft vermenging, gebruiksgemak en kosten, beter dan de andere apparaten.
Dit apparaat kan gebruikt worden in drie standen: met de opening 'naar boven, naar beneden of naar opzij. Bij de twee laatste standen moet met steunen in het bekerglas of met en statief gewerkt worden.
Met de opening naar beneden wordt het meeste zoöplankton uit het mon- ster gelokt, maar komt ook het meeste andere materiaal mee. Er was geen verschil in efficiëntie tussen de twee andere standen. De keuze van de stand moet bepaald worden door de samenstelling van het mon- ster: veel bezinkend, veel zwevend materiaal, of veel van beide en door het gebruiksgemak.
Het apparaat kan nog verfijnd worden door het lichtcompartiment
te verkleinen, boven het donkercompartiment te brengen en de verbin-
ding afsluitbaar te maken met een kraantje, zo wordt ongeveer het ap-
paraat van Heerkloss en Arndt (1981) verkregen. Het zoöplankton wordt
- 28 -
I
I I
dan in een kleiner volume opgevangen en hoeft niet meet geconcentreerd te worden.
Gemiddeld wordt met de goedwerkende apparaten een efficiëntie B voor copepoden bereikt van 60 - 70%, terwijl de spreiding ca; 20% is.
Tussen de resultaten op verschillende dagen kan een groot verschil '•
worden gevonden. In de zomer zijn de resultaten gemiddeld iets beter
dan in de winter. Hiervoor is geen verklaring gevonden. Waarom een • deel van het zoöplankton niet op het licht afkomt is niet uit de proe- ™ ven gebleken. Zowel bij de achterblijvers als bij het zoöplankton in — het lichtcompartiment werden zeer weinig dode of beschadigde dieren | gevonden. Bij de kolom was het mogelijk om te zien waar het zoöplank-
ton in het donkercorapartiment zich bevond: het bleek gewoon verspreid • te zijn.
Voor het verschil in resultaten per dag en per seizoen is geen • verklaring gevonden.
Ervin en Haines (1972) verkregen met zoetwatermonsters hogere ef- • ficiënties: gemiddeld 85%, een een lagere spreiding. Heerkloss en «»
Arndt (1981) vermelden voor hun zoetwaterproeven geen getallen, maar m zeggen dat het werkt. Zij hebben ook een experiment met zeewatermon-
sters gedaan en verkregen toen geen goed resultaat: slechts een deel M van het zoöplankton reageerde positief.
Een duidelijke invloed van temperatuurverschillen en verschillen I in lichtkleur en -sterkte is niet geconstateerd.
Doordat geen lichtmetingen in de donkercompartimenten zijn uitge- M voerd, kunnen geen uitspraken gedaan worden over de minimale licht- * sterkte waarbij plankton nog reageert.
Mogelijk zou een beter resultaat verkregen kunnen worden door de omstandigheden in het donkercompartiment onaangenaam en in het licht-
compartiment aangenaam te maken. Bijvoorbeeld door veranderingen in I temperatuur, zuurstofgehalte, of voedselaanbod aan te brengen.
m
Samenvattend moet gesteld worden dat een 100 ml erlenmeyer met
I
een opening van 1,4 cm die tot vlak onder de hals donker gemaakt wordt, geplaatst in een bekerglas, het best voldoet. Daar echter ge- middeld slechts 60 - 70% van het zoöplankton uit het monster gehaald wordt en de spreiding zo groot is dat de hoeveelheid zuiver verkregen zoöplankton niet als schatting vooc de totale hoeveelheid in het raon-
ma
m
I
1
I I I
1
I I I I I I I I
I I I I
1
I I I
- 29 -
ster mag worden gebruikt, blijft de toepasbaarheid beperkt tot het ge- bruik voor grazingproeven en voor de bepaling van de chemische samen- stelling van zoöplankton.
5, Samenvatting
Vijf apparaten om met behulp van licht zoöplankton zuiver uit zeewatermonsters te verkrijgen zijn op hun efficiënties vergele- ken. Een 100 ml erlenmeyer met een opening van 1,4 cm geplaatst in een bekerglas (in combinatie met een 10W autolampje) voldeed het best. Af- hankelijk van het feit of het verontreinigde materiaal uit zinkende of drijvende deeltjes bestaat, of uit allebei, dient dit apparaat met de opening naar boven, naar beneden of naar opzij gebruikt te worden. Ge- middeld werd met het apparaat 65% van het aanwezige zoöplankton (cope- poden) uit het monster gehaald. De spreiding was echter zo groot dat op grond van de hoeveelheid zuiver verkregen zoöplankton geen schat- ting gemaakt kon worden van de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid.
De toepasbaarheid van het apparaat wordt hierdoor beperkt tot het ge-
bruik voor grazing of physiologische proeven, of voor het verzamelen
van zoöplankton voor het doen van chemische bepalingen.
- 30 -
6. Literatuur
I I I 1
I
Anderson, R.O., 1959. A modified flotation technique for sorting bot- JÊt tom fauna samples. Limnol. Oceanogr. 4 (2): 223-225. ™ Anderson, M.T., 1981. Improved method for separating zoöplankton from
detritus. The Prog. fish Cult. 43 (1).
Appecson, C.S. and D.G. Yows, 1976. A light trap for collecting aqua-
tic organisms. Mosquito news 36 (2): 205-206. | Baylor, E. and F. Smith, 1953. A physiological light trap. Ecology 34:
223-224. 1
Bé, A.W.H., 1959. A method for rapid sorting of foraminifera from
marine plankton samples. Journal of Paleontology 33 (5) : JÊ 846-848. * Ervin, J,L. and T.A. Haines, 1972. Using light to collect and separate
zoöplankton. The Prog. fis Cult. 34 (3): 171-174.
Espinosa, L.R. and W.E. Clack, 1972. h polypropylene light trap for
aquatic invertebrates. Can. Fish. and Game 58: 149-152. g Heerkloss, R. and H. Arndt, 1981. Eine Lichtfalle zur Reinigung von
Zooplanktonproben. wisaenschaftl. Zeitschr. der Wilhelm • Pieck univeraitët Rostock, Mathematische - Naturwissen-
schaftliche Reihe 4/5. fÊ Jones, D.A., 1971. A new light trap for plankton. 4th Eur. Mar. Biol.
Symp. Cambridge: 487-493.
jonge, V.N. de and L.A. Bouwman, 1977. A simple density aeparation technique for quantitative isolation of meiobenthos using the colloidal silica Ludox-TM. Mar. Biol. 42: 143-148.
Koosman, V.W. and H.J. Newburg, 1977. Modification of the water
flotation method for separating organisms fcom detritus in • benthic samples. Prog. fish Cult. 39 (4): 189-190.
Mcgowan, J.A. and V.J. Praundorf, 1964. A modified heavy fraction • zoöplankton sorter. Limnol. Oceanogr. 9.: 152-5.
Nichols, J.A., 1979. A simple flotation technique for separating meio- • benthic nematodes from fine-grained sediraents. Trans. Ara. ™ Microsc. Soc, 98: 127-130.
I I
I
1
I
I
I I I I I 1 I 1
I I I I I I 1 I I 1 I I I
- 31 -
V. Scheiding van veldmonsters met behulp van dichtheidsgradiënten
Inhoud Bi2.
1. Inleiding 33
2. Materiaal en methoden 34 2.1. Monstername
2-2. Filtratie 2.3. Telling
2.4. Gradiënt materiaal
4.1. Keuze gradiëntmateriaal 4.2. Indikken percoll
4.3. Osmotische waarde in water t.g.v. zout en aucrose 4.4. Osmotische waarde in Percoll t.g.v. zout en sucrose 4.5. Dichtheid van oplossingen t.g.v. zout en sucroae 4.6. Verhouding zout- en sucrose toevoegingen
4.7. Zoutoplossingen 4.8. PH
4.9. Gebruikte gradiënt 4.10. Terugwinnen Perooll 2.5. Scheidingsprocedure
5.1. Maken van de gradiënt 5.2. Aanbrengen van de gradiënt 5.3. Aanbrengen van het monster 5.4. Centrifugeren
5.5. Afvoeren van de gradiënt 5.6. Pluorimeter
5.7. Practioneren 5.8. Bepalen dichtheid 5.9. Uitwassen gradiëntstof 2.6. Density markerbeads
2.7. Invloed du,ur en toerental centrifugeren
2.8. Waarnemingen met betrekking tot het verschil in dichtheid tussen individuen van één soort
2.9. Invloed concentreren op chloropylgehalte
2.10. Invloed scheidingsprocedure op produktiecapaciteit 2.11. Invloed gradiëntstof op POC-bepaling
2.12. Cultures
- 32 -
Blz.
6. Literatuur 82
I I I I I
3. Resultaten 50 3.1. Scheidingsprocedure veldmonsters
3.2. Density markerbeads jÊ 3.3. Cultures
3.4. Invloed duur en toerental centrifugeren
3.5. Waarnemingen met betrekking tot het verschil in dichtheid
tussen individuen van één soort ~ 3.6. Invloed concentreren op chlorophylgehalte p 3.7. Invloed scheidingsprocedure op de produktiecapaciteit
3.8. Invloed gradiëntstof op POC-bepaling • 3.9. Terugwinnen Percoll
4. Discussie 76
5. Samenvatting 80 *
I I I I I I I I I
I
I
1
I I I I I I 1
I
I I
1
I 1 1 f I 1
I I I
- 33 -
1. Inleiding
De opzet van dit onderzoek is te proberen veldmonsters uit de Oosterschelde levend te scheiden in hun samenstellende componenten. De redenen om dit te proberen staan beschreven in de algemene inleiding.
De keuze om deze scheiding uit te voeren met behulp van dicht- heidsgradiënten volgt uit de hoofdstukken: "Overzicht scheidingstech- nieken" en "Keuzerichting onderzoek en motivering aanschaf appara- tuur".
Dichtheidsgradienten voor het scheiden van cellen worden in de medische wetenschap veel toegepast (Hinton en Dobrota, 1976, Peeters, 1979). In het hydrobiologisch onderzoek is er een begin gemaakt met de toepassing. Price et al (1974) gebruiken dichtheidsgradienten in een doorstroomcentrifuge voor het concentreren van algen uit cultures, price et al (1978) concentreren algen uit cultures in gradiënten in centrifugebuizen en constateren daarbij soms een verschil in dichtheid tussen verschillende soorten. Oriënterende proeven met veldmonsters noemen zij veelbelovend met betrekking tot de mogelijkheden tot schei- ding. Price et al (1977) gebruiken dichtheidsgradienten in een sedi- mentatiekamer voor het scheiden van visseëieren en haringlarven van ander zoöplankton. De Jonge (1979) past met succes dichtheidsgradien- ten toe in centrifugebuizen voor het verkrijgen van bentische diato- meeën uit bodemmateriaal.
Voor de pogingen tot scheiding konden worden uitgevoerd moest eerst aandacht worden geschonken aan het gradiëntmateriaal.
Daarna zijn in de periode augustus 1981 - augustus 1982 vrijwel wekelijks veldmonsters van verschillende grootteklassen aan de schei- ding sp
rocedure.
Om de theoretische mogelijkheden na te gaan zijn ook proeven uit- . gevoerd met bolletjes van verschillende dichtheid (density marker-
beads) en met cultures.
Om na te gaan of de physiologische toestand van de algen onaange- tast bleef zijn produktieproeven uitgevoerd.
Voor het terugwinnen van de algen uit het gradiëntmateriaal en voor de voorbereiding van de monsters moest er geconcentreerd worden.
Het effect van concentratie op het chlorophylgehalte en op de produc- tiecapaciteit is daarom nagegaan.
Ook het effect van de gradiëntstof op POC-bepalingen is bekeken.
I
- 34 -
2. Materiaal en methoden
2.1. Monstername
1
I I
Van juli 1981 tot juli 1982 zijn bijna wekelijks monsters geno- • men.
Alle monsters kwamen uit Sophiahaven in de Oosterschelde. B Er werd gewerkt met monsters van drie verschillende grootteklas-
sen: > 60 nm, >30 Vim en <30 ura. Hiervoor «aren twee redenen: het bleek V dat er per grootteklasse een andere hoeveelheid monter nodig was en ™ tellingen aan anorganisch materiaal en detritus in bijvoorbeeld een —
>30 um-monster waren bijna niet mogelijk als daar ook het materiaal 9
<30 pa nog in zat. Het is namelijk uitgesloten elk deeltje te tellen
en de grens wordt te willekeurig als deeltjes van alle grootteklassen • aanwezig zijn.
De monsters van )60 pm werden met een planktonnet genomen door 'S een groot aantal horizontale en verticale trekken te doen vanaf een
steiger. Telkens na enkele trekken werd het gevangen materiaal afge- M tapt. Br werd in totaal ca. 10 - 20 m^ water gefiltreerd. Het plankton "
daarin werd opgenomen in ca. 0,5 1 water. Het water voor het monster m van > 30 ptn werd door een pomp, waarvan de instr oomopen ing onder 41 het wateroppervlak lag, opgepompt. Het monster werd verzameld door het
water over 30 jam gaas te laten stromen en het gaas af te spuiten met • Oosterscheldewater. Het plankton werd opgenomen in ca. 0,5 1. Hiervoor
werd ca. 200 1 water gefiltreerd. I De monsters van < 30 ^m werden genomen door ca. 20 1 water dat
het 30 vim gaas passeerde op te vangen en dit via filtratie te concen- M treeën (0,45 iim) . *
De monsters werden niet altijd alle drie verwerkt.
2.2. Filtratie
1
De filtratie gebeurde met een Schleicher en Schuil filtratiecel
I
met roerinrichting vlak boven het filter om bezinking te voorkomen. Br m werd gefiltreerd over een 0,45 um Schleicher en Schuil, 0 110 mm mem-
braanfilter. Een deel van het seston bezinkt toch. Daarom werd na S doorvoeren van één of enkele liters het filter afgespoten met een
krachtige straal Oosterscheldewater uit een injectiespuit, waarvan de • naald vervangen is door een pipettip.