Production of novel protein therapeutics to improve targeted cancer therapy Al-Qahtani, Alanod
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Al-Qahtani, A. (2019). Production of novel protein therapeutics to improve targeted cancer therapy. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
217
Chapter 8:
Samenvatting en toekomstperspectieven
219
Samenvatting en toekomstperspectieven :
Gerichte kanker therapieën zijn momenteel middelpunt van veel geneesmiddel gerichte kanker behandelingen, met de eigenschap tot het hinderen van kanker celgroei of overleving. Veel geneesmiddel gerichte kanker behandelingen zijn goedgekeurd door de Amerikaanse Inspectie van voedsel- en geneesmiddelen (FDA) voor de behandeling van verschillende soorten kanker. Andere behandelingen worden getest in klinische trials en vele zijn momenteel in de preklinische fase. Gerichte therapieën op kanker cellen hebben hun beperkingen, mogelijk door medicijn resistentie, of gebrek aan specificiteit. Elk hieronder beschreven hoofdstuk richt zich op een mogelijke beperking van behandeling en levert nieuwe benaderingen welke in de toekomst toegepast kunnen worden om dit in de te ondervangen.
In Hoofdstuk 2 hebben we een evaluatie uitgevoerd van verschillende strategieën om langwerkende therapeutische geneesmiddelen bij kanker te produceren en de voordelen ervan voor drug delivery. De resultaten leggen een bijzondere nadruk op PEGylatie en albumine-fusie en vertegenwoordigen de gevallen die het meest gebruikt en genoemd worden. De toepassing van de twee vormen in therapeutische eiwitten en hun bij de behandeling van kanker en het verbeteren van de medicijnafgifte zijn cruciaal en vertegenwoordigen de toekomst voor therapeutische eiwitten. Van de gemodificeerde therapeutische middelen is aangetoond dat ze een verhoogde halfwaardetijd en oplosbaarheid in serum hebben en een verbeterd potentieel voor drug delivery met behoud van activiteit. Onze studies suggereren een rol in zowel immunotherapie en gerichte kankertherapie, dusdanig op een manier die het eiwit / enzym beschermt tegen het immuunsysteem.
In Hoofdstuk 3, wordt besproken hoe het gelukt is om een nieuwe CPG2 variant te isoleren. Ondanks de sterke gelijkenissen tussen het nieuwe en het conventionele enzym, reageerde het gekweekte polyklonale antilichaam tegen onze nieuwe vorm van CPG2, niet tegen CPG2 van Pseudomonas stam RS-16 dat momenteel in klinisch gebruik is. Dit geeft aan dat de twee enzymen antigeen verschillend zijn. Dit kenmerk kan voordelen hebben doordat toediening van twee geneesmiddelen achtereenvolgens in het ADEPT-protocol, de antilichaamreacties die repetitieve toediening van de huidige behandeling met Ps CPG2 belemmeren, kan minimaliseren. De beschikbaarheid van nieuwe glucarpidase zou van grote betekenis kunnen zijn in de verbetering van de therapeutische bruikbaarheid tijdens kankertherapie en levert de mogelijkheid tot dosis studies, welke vervolgens kunnen leiden tot de escalatie van methotrexaat dosering voor efficiëntere behandeling. Toekomstige studies zouden kunnen onderzoeken in hoeverre welke antilichamen, in de circulatie van patiënten die behandeld zijn met de Ps CPG2, anders of zelf niet reageren met de nieuwe variant van CPG2, en zodoende een klinisch voordeel bieden.
In Hoofdstuk 4 bespreken we hoe we met DNA-shuffling nieuwe CPG2-varianten creëerden met mutaties die 110-200% meer activiteit produceerden dan het wildtype glucarpidase. Analyse van de DNA-sequenties liet zien dat een mutatie op een enkel punt optrad in elke variant die aminozuursubstituties I100T, T239A en G123S veroorzaakte. CD-onderzoek van het geshuffelde CPG2 vertoonde een hoger alfa-helixgehalte dan het wildtype. Dit werk vormt de grondslag voor economische productie van een nieuw recombinant glucarpidase voor het potentiële gebruik in ADEPT en / of de ontgifting van geneesmiddelen. De toepassing van de nieuw gegenereerde glucarpidase kan worden uitgebreid naar andere klinische toepassingen dan kanker. Het nieuwe geïsoleerde
221
glucarpidase met hogere activiteit, zou van waarde kunnen zijn bij ontgifting bij een overdosis met methotrexaat. Gemodificeerde geneesmiddelen (zoals hieronder besproken in Hoofdstuk 5) kunnen worden toegepast met de nieuwe geshuffelde varianten om een langer actief medicijn te produceren met een nog hogere activiteit. In Hoofdstuk 5 was het de doel om een langwerkende glucarpidase te produceren. We ontwikkelden twee langwerkende vormen van CPG2: een mono-gePEGyleerde glucarpidase en een HSA-gefuseerde glucarpidase. Biochemische en bioactiviteitsanalyses wezen erop dat elke vorm een verbeterde halfwaardetijd had en de functionele activiteiten van de glucarpidase conjugaten werden gehandhaafd. Ze vertoonden ook een hoge stabiliteit in menselijk serum en waren meer resistent tegen belangrijke humane proteasen dan het lichaamseigen glucarpidase. Voor zover ons bekend is, is deze studie de eerste die melding maakt van stabiele en minder immunogene glucarpidase-varianten geproduceerd door PEGylation en fusie met HSA. Onze bevindingen suggereren dat ze mogelijk een grotere werkzaamheid hebben bij het ontgiften van medicijnen en ADEPT. De twee vormen kunnen achtereenvolgens aan de patiënt worden gegeven om de cyclus toediening te verlengen, waardoor de kankerbehandelingsstrategie aanzienlijk wordt verbeterd. Ons werk baant de weg voor klinisch onderzoek en klinische trials met behulp van onze nieuwe gemodificeerde vormen van CPG2 voor de behandeling van kanker en ontgifting van geneesmiddelen. De productie van verschillende modifiers voor glucarpidase (CPG2) en variaties ervan zouden het mogelijk moeten maken dat nieuwe CPG2-vormen worden geproduceerd voor meer cycli van toediening van het enzym. Dierproeven zullen een cruciale brug vormen
naar klinische onderzoeken en een eerste beoordeling toelaten van de halfwaardetijden van de verschillende vormen van CPG2 in vivo, hun immunogeniciteit en stabiliteit. In Hoofdstuk 6 hebben we verschillende moleculen gebruikt voor de behandeling van kanker, namelijk superantigenen. Het doel is om de regio’s op deze moleculen te identificeren die de hypotensie veroorzaken als een bijwerking van superantigenen. Dit zal op zijn beurt leiden tot de productie van een gemodificeerd superantigeen door de verwijdering van deze regio’s met minder bijwerkingen. We brachten eerst vier met codons geoptimaliseerde superantigenen, SEA, SEB, TSST-1 en SPEA tot over expressie. Deze hadden het vermogen om de T-cellen te activeren in een mate die ten minste 66% groter was dan die met de beschikbare SEB. De recombinante superantigenen hadden het vermogen om DLD1-kankercellen te doden wanneer gemengd werden met PBMC's, die T-cellen activeerden en zo de productie van cytokinen activeerden. We hebben aan de hand van twee van de superantigenen, SEA en SPEA aangetoond dat ze vasodilatatie veroorzaken, wat zou kunnen leiden tot hypotensie, een mogelijke ongewenste bijwerking. Vervolgens hebben we 19 overlappende peptiden van SPEA ontwikkeld en gesynthetiseerd en konden we peptiden identificeren die bijdragen aan de door superantigen geïnduceerde hypotensie. Het verwijderen van de geïdentificeerde aminozuren zou de weg moeten banen voor de productie van superantigen varianten met een lagere potentie voor de vasodilatatie bijwerkingen.
