University of Groningen
Studies on Ligand Directed Enzyme Prodrug Therapy and Production of Long Acting Protein Therapeutics for Targeted Cancer Treatment
Al-Mansoori, Layla
DOI:
10.33612/diss.131689831
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Al-Mansoori, L. (2020). Studies on Ligand Directed Enzyme Prodrug Therapy and Production of Long Acting Protein Therapeutics for Targeted Cancer Treatment. University of Groningen.
https://doi.org/10.33612/diss.131689831
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Chapter (8) Samenvatting
190
Samenvatting:
Gedurende de laatste twee decennia werd veel vooruitgang geboekt met betrekking tot doelgerichte kankertherapie om de effectiviteit van kankertherapie te verbeteren. Gerichte kankertherapie was de focus van de meeste geneesmiddelen tegen kanker die recent zijn ontwikkeld om maligniteiten te behandelen. De toegenomen kennis op verschillende verwante gebieden zoals genetica, celbiologie en mitogene routes naast de individuele variatie speelt een cruciale rol in de vooruitgang van deze behandelingen en heeft bijgedragen aan de ontwikkeling en het ontwerpen van op maat gemaakte therapeutische protocollen.
In hoofdstuk 2 presenteren we recente updates waarbij kankercel-specifieke liganden gebruikt worden bij het targeten van tumorcellen. Een verscheidenheid aan liganden geconjugeerd met een cytotoxisch geneesmiddel voor afgifte ter plaatse van de kankercel kan leiden tot selectieve dood van de kankercel. Bovendien hebben we de criteria besproken voor de juiste selectie van liganden, geneesmiddelen en linkers om het optimale therapeutische complex te maken. Het gebruik van sommige kankermarkers wordt in dit hoofdstuk besproken, waarbij recente manipulaties worden gepresenteerd die worden toegepast om geavanceerde, efficiënte ligand-medicijn of ligand-eiwit "enzym" conjugaten te vormen, hetgeen resulteert in een betere behandeling van kanker met weinig of geen bijwerkingen.
Chapter (8) Samenvatting
191
Antilichaamgerichte enzym-prodrug-therapie is een veelbelovend systeem dat is ontworpen om maligniteiten aan te pakken waarbij het antilichaam is geconjugeerd aan het therapeutische enzym. In ons onderzoek is gekozen voor carboxypeptidase G2 "CPG2". Verschillende andere enzymen zijn gebruikt bij gerichte kankertherapie zoals β-lactamase en cytosinedeaminase, echter is CPG2 de enige die de fase van klinische onderzoeken heeft bereikt. Dus in ons werk gebruikten we CPG2 om langwerkende derivaten van de CPG2 te produceren, een nieuw ligand-CPG2-conjugaat te ontwikkelen en om de therapeutische eigenschappen van CPG2 en de geproduceerde conjugaten te verbeteren.
In plaats van CPG2 geconjugeerd met een antilichaam, als in ADEPT, hebben we in hoofdstuk 3 een ligand ontworpen en gesynthetiseerd waarbij een peptide is geconjugeerd aan CPG2. Het peptide dat is geconjugeerd met CPG2 is cyclisch Cysteine-Asparagine-Glycine Arginine-Cystein (CNGRC), waarvan bekend is dat het selectief aan aminopeptidase N (CD13) bindt welke in hoge mate op tumorcellen tot expressie is gebracht. APN is nodig voor metastatische kankercellen om angiogenese te stimuleren. Het geconjugeerde peptide was op twee manieren gekoppeld aan CPG2 met de GG-linker en leverde twee vormen op, ofwel een enkel fusie-eiwit waarbij het peptide is gekoppeld aan een terminus van CPG2 (CNGRC-CPG2), of dubbel fusie-eiwit waarbij het peptide is geconstrueerd om te binden zowel carboxyl- als amino-uiteinden van CPG2 (CNGRC-CPG2-CNGRC). De resulterende conjugaten werden getest op hun katalytische activiteit en bindingsaffiniteit voor het beoogde APN op kankercellen. De dubbele fusie met CNGRC bleek de katalytische activiteit van CPG2 en bindingsaffiniteit aan kankercellijnen
Samenvatting:
Gedurende de laatste twee decennia werd veel vooruitgang geboekt met betrekking tot doelgerichte kankertherapie om de effectiviteit van kankertherapie te verbeteren. Gerichte kankertherapie was de focus van de meeste geneesmiddelen tegen kanker die recent zijn ontwikkeld om maligniteiten te behandelen. De toegenomen kennis op verschillende verwante gebieden zoals genetica, celbiologie en mitogene routes naast de individuele variatie speelt een cruciale rol in de vooruitgang van deze behandelingen en heeft bijgedragen aan de ontwikkeling en het ontwerpen van op maat gemaakte therapeutische protocollen.
In hoofdstuk 2 presenteren we recente updates waarbij kankercel-specifieke liganden gebruikt worden bij het targeten van tumorcellen. Een verscheidenheid aan liganden geconjugeerd met een cytotoxisch geneesmiddel voor afgifte ter plaatse van de kankercel kan leiden tot selectieve dood van de kankercel. Bovendien hebben we de criteria besproken voor de juiste selectie van liganden, geneesmiddelen en linkers om het optimale therapeutische complex te maken. Het gebruik van sommige kankermarkers wordt in dit hoofdstuk besproken, waarbij recente manipulaties worden gepresenteerd die worden toegepast om geavanceerde, efficiënte ligand-medicijn of ligand-eiwit "enzym" conjugaten te vormen, hetgeen resulteert in een betere behandeling van kanker met weinig of geen bijwerkingen.
Antilichaamgerichte enzym-prodrug-therapie is een veelbelovend systeem dat is ontworpen om maligniteiten aan te pakken waarbij het antilichaam is geconjugeerd aan het therapeutische enzym. In ons onderzoek is gekozen voor carboxypeptidase G2 "CPG2". Verschillende andere enzymen zijn gebruikt bij gerichte kankertherapie zoals β-lactamase en cytosinedeaminase, echter is CPG2 de enige die de fase van klinische onderzoeken heeft bereikt. Dus in ons werk gebruikten we CPG2 om langwerkende derivaten van de CPG2 te produceren, een nieuw ligand-CPG2-conjugaat te ontwikkelen en om de therapeutische eigenschappen van CPG2 en de geproduceerde conjugaten te verbeteren.
In plaats van CPG2 geconjugeerd met een antilichaam, als in ADEPT, hebben we in hoofdstuk 3 een ligand ontworpen en gesynthetiseerd waarbij een peptide is geconjugeerd aan CPG2. Het peptide dat is geconjugeerd met CPG2 is cyclisch Cysteine-Asparagine-Glycine Arginine-Cystein (CNGRC), waarvan bekend is dat het selectief aan aminopeptidase N (CD13) bindt welke in hoge mate op tumorcellen tot expressie is gebracht. APN is nodig voor metastatische kankercellen om angiogenese te stimuleren. Het geconjugeerde peptide was op twee manieren gekoppeld aan CPG2 met de GG-linker en leverde twee vormen op, ofwel een enkel fusie-eiwit waarbij het peptide is gekoppeld aan een terminus van CPG2 (CNGRC-CPG2), of dubbel fusie-eiwit waarbij het peptide is geconstrueerd om te binden zowel carboxyl- als amino-uiteinden van CPG2 (CNGRC-CPG2-CNGRC). De resulterende conjugaten werden getest op hun katalytische activiteit en bindingsaffiniteit voor het beoogde APN op kankercellen. De dubbele fusie met CNGRC bleek de katalytische activiteit van CPG2 en bindingsaffiniteit aan kankercellijnen
Chapter (8) Samenvatting
192
te verbeteren met een hoge APN-expressie en een significant verlaagd ex vivo immunotoxisch effect. Bovendien bleek het cytotoxische effect van de prodrug hoger te zijn in combinatie met het dubbele fusie-eiwit in vergelijking met enkel fusie-eiwit. Bij structuur analyse met behulp van circulaire dichroism (CD) spectroscopie vonden we een opmerkelijke invloed van dubbele fusie met CNGRC op de secundaire structuur (α-helix en β-sheet) van het resulterende CPG2-complex, zodat we moeten concluderen dat de secondaire structuur bijdraagt aan de genoemde gewijzigde eigenschappen. Aangezien CPG2 niet afkomstig is van zoogdieren en als een therapeutisch enzym in vivo moet worden gebruikt, zijn er verschillende nadelen bij gebruik in klinische onderzoeken namelijk immunotoxiciteit en een lage stabiliteit tegen serumprotease die de halfwaardetijd beïnvloedt. In hoofdstuk 4 hebben we twee methoden gebruikt (PEGylatie en genfusie met humaan serumalbumine "HSA") die in het algemeen worden gebruikt om de stabiliteit van therapeutische moleculen als eiwitten en geneesmiddelen te verbeteren. We zijn erin geslaagd om gePEGyleerde-CPG2 en HSA-gefuseerde CPG2 (HSA-CPG2) te ontwerpen en te produceren. De twee varianten van CPG2 werden gezuiverd en onderzocht op hun stabiliteit en ex-vivo immunotoxiciteit. De katalytische activiteit van CPG2 bleef behouden na PEGylering en HSA-conjugatie. In vitro-onderzoeken toonden een verbeterde serumstabiliteit aan wanneer PEGyleerde of HSA-geconjugeerde CPG2 werd vergeleken met het vrije CPG2. Bovendien werd een significante afname van de immunogeniciteit van mononucleaire cellen van perifeer bloed "PBMC's" gemeten. We hebben geconcludeerd dat de "biobetter" CPG2-varianten met verbeterde therapeutische eigenschappen het probleem van de
Chapter (8) Samenvatting
193
immunogeniciteits , dat een van de obstakels is bij het gebruik van de ADEPT-strategie voor kankerbehandeling sterk reduceert.
Deze resultaten moedigden ons aan om een gePEGyleerde vorm van de eerder onderzochte CNGRC-CPG2-fusie eiwitten te produceren. In Hoofdstuk 5 hebben we de PEGylering van de enkelvoudige en dubbel gefuseerde CPG2 uitgevoerd om PEG-CNGRC-CPG2 en PEG-CNGRC-CPG2-CNGRC te produceren.
De resultaten hebben aangetoond dat de katalytische activiteit van het gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit, PEG CNGRC-CPG2 veel hoger is dan de katalytische activiteit van het niet-gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit (CNGRC-CPG2). De katalytische activiteit van de gePEGyleerde dubbel gefuseerde CPG2 werd echter aanzienlijk verminderd. We zien dezelfde resultaten met betrekking tot de binding van de gePEGyleerde producten waarbij het gePEGyleerde dubbel gefuseerde CPG2 minder bindingsaffiniteit heeft aan de APN op kankercellen dan het vrij gefuseerde CPG2 en gePEGyleerde enkelvoudige gefuseerde CPG2. Als resultaat van de verbeterde katalytische activiteit van het gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit, was het cytotoxische effect van de prodrug in combinatie van het gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit significant hoger in vergelijking met het niet-gePEGyleerde. Het gePEGyleerde dubbele fusie-eiwit geeft echter een lagere celdood (lagere cytotoxiciteit) in combinatie met het prodrug in vergelijking met het vrije gefuseerde eiwit.
te verbeteren met een hoge APN-expressie en een significant verlaagd ex vivo immunotoxisch effect. Bovendien bleek het cytotoxische effect van de prodrug hoger te zijn in combinatie met het dubbele fusie-eiwit in vergelijking met enkel fusie-eiwit. Bij structuur analyse met behulp van circulaire dichroism (CD) spectroscopie vonden we een opmerkelijke invloed van dubbele fusie met CNGRC op de secundaire structuur (α-helix en β-sheet) van het resulterende CPG2-complex, zodat we moeten concluderen dat de secondaire structuur bijdraagt aan de genoemde gewijzigde eigenschappen. Aangezien CPG2 niet afkomstig is van zoogdieren en als een therapeutisch enzym in vivo moet worden gebruikt, zijn er verschillende nadelen bij gebruik in klinische onderzoeken namelijk immunotoxiciteit en een lage stabiliteit tegen serumprotease die de halfwaardetijd beïnvloedt. In hoofdstuk 4 hebben we twee methoden gebruikt (PEGylatie en genfusie met humaan serumalbumine "HSA") die in het algemeen worden gebruikt om de stabiliteit van therapeutische moleculen als eiwitten en geneesmiddelen te verbeteren. We zijn erin geslaagd om gePEGyleerde-CPG2 en HSA-gefuseerde CPG2 (HSA-CPG2) te ontwerpen en te produceren. De twee varianten van CPG2 werden gezuiverd en onderzocht op hun stabiliteit en ex-vivo immunotoxiciteit. De katalytische activiteit van CPG2 bleef behouden na PEGylering en HSA-conjugatie. In vitro-onderzoeken toonden een verbeterde serumstabiliteit aan wanneer PEGyleerde of HSA-geconjugeerde CPG2 werd vergeleken met het vrije CPG2. Bovendien werd een significante afname van de immunogeniciteit van mononucleaire cellen van perifeer bloed "PBMC's" gemeten. We hebben geconcludeerd dat de "biobetter" CPG2-varianten met verbeterde therapeutische eigenschappen het probleem van de
immunogeniciteits , dat een van de obstakels is bij het gebruik van de ADEPT-strategie voor kankerbehandeling sterk reduceert.
Deze resultaten moedigden ons aan om een gePEGyleerde vorm van de eerder onderzochte CNGRC-CPG2-fusie eiwitten te produceren. In Hoofdstuk 5 hebben we de PEGylering van de enkelvoudige en dubbel gefuseerde CPG2 uitgevoerd om PEG-CNGRC-CPG2 en PEG-CNGRC-CPG2-CNGRC te produceren.
De resultaten hebben aangetoond dat de katalytische activiteit van het gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit, PEG CNGRC-CPG2 veel hoger is dan de katalytische activiteit van het niet-gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit (CNGRC-CPG2). De katalytische activiteit van de gePEGyleerde dubbel gefuseerde CPG2 werd echter aanzienlijk verminderd. We zien dezelfde resultaten met betrekking tot de binding van de gePEGyleerde producten waarbij het gePEGyleerde dubbel gefuseerde CPG2 minder bindingsaffiniteit heeft aan de APN op kankercellen dan het vrij gefuseerde CPG2 en gePEGyleerde enkelvoudige gefuseerde CPG2. Als resultaat van de verbeterde katalytische activiteit van het gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit, was het cytotoxische effect van de prodrug in combinatie van het gePEGyleerde enkelvoudige fusie-eiwit significant hoger in vergelijking met het niet-gePEGyleerde. Het gePEGyleerde dubbele fusie-eiwit geeft echter een lagere celdood (lagere cytotoxiciteit) in combinatie met het prodrug in vergelijking met het vrije gefuseerde eiwit.
Chapter (8) Samenvatting
194
Samenvattend hebben we met succes nieuwe langwerkende glucarpidase-derivaten geproduceerd. Ook hebben we het antilichaam dat nodig is voor het uitvoeren van antilichaam-gerichte enzym-prodrug-therapie (ADEPT) vervangen door een klein peptide en hebben de doeltreffendheid van de nieuwe conjugaat in ligand-gerichte enzym-prodrug-therapie (LDEPT) aangetoond. Vervolgens zijn we begonnen met de productie van deze conjugaten om de immunogeniciteit van deze behandeling te minimaliseren. De nieuwe eiwitconjugaten en de derivaten die in dit werk werden geproduceerd, zullen een aanzienlijke bijdrage leveren om de beperkingen van ADEPT en LDEPT te overwinnen. Toekomstig onderzoek naar stabiliteit, specificiteit en immunotoxiciteit van de geproduceerde therapeutische conjugaten moet in vivo worden uitgevoerd om andere effectieve opties voor gerichte kankertherapie te bieden. Bovendien zouden prodrugs PET-gelabeld kunnen zijn om de biologische distributie en het cytotoxische effect van geneesmiddelen op kankercellen exclusief te onderzoeken, naast het gebruik van PET-biomarkers om de in vivo therapeutische werkzaamheid van LDEPT te inspecteren.
