University of Groningen
Studies on Superantigens and Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy for Tolerable Targeted Cancer Treatment
Bashraheel, Sara
DOI:
10.33612/diss.96169444
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Bashraheel, S. (2019). Studies on Superantigens and Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy for Tolerable Targeted Cancer Treatment. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.96169444
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
175
Chapter 8: Samenvatting en Toekomst
Perspectieven
Chapter 8: Samenvatting en Toekomst Perspectieven
176
Samenvatting en Toekomst Perspectieven:
Tumor gerichte kankertherapieën, waaronder immunotherapie, hebben een enorme vooruitgang geboekt, waarbij meerdere medicijnen inmiddels goedgekeurd zijn door de FDA en andere verbindingen zich inmiddels in preklinische en klinische trials bevinden. In hoofdstuk 2 van dit proefschrift wordt een literatuur onderzoek beschreven en werpt licht op verschillende tumor gerichte strategieën, waaronder het gebruikt van antibody-drug conjugaten (ADC), Proteolysis-targeting chimeric moleculen (PROTACs) en checkpoint inhibitoren, evenals gebruik van cytokinebehandelingen. Daarnaast wordt het gebruik van tumor-gerichte superantigenen en anti-lichaam directed enzym prodrug therapie (ADEPT) besproken.
In Hoofdstuk 3 was het doel om het vasodilatatie-effect van superantigenen (SAgs) rechtstreeks te bestuderen en het mechanisme te onderzoeken waarmee superantigenen hypotensie veroorzaken. Dit werd gevolgd door de identificatie van regio’s op het superantigeen die verantwoordelijk zijn voor dit fenomeen. In eerste instantie hebben we de genen gekloond en tot over-expressie gebracht van vier superantigenen (SEA, SEB, SPEA en TSST-1), door gebruik te maken van codon-geoptimaliseerde constructen voor maximale expressie in gist of E.coli. De opgezuiverde SAgs induceerden T-cel activering en cytokine productie (IL-2 en IFNγ), waaruit bleek dat de functie van de superantigenen behouden bleef. De vier recombinante SAgs lieten ook zien dat deze in staat zijn T-cel afhankelijke tumoren te doden. Vervolgens hebben we vasodilatatie studies uitgevoerd met twee superantigenen, SEA en SPEA, waarin het werkingsmechanisme onderzocht is. Ons werk laat zien dat beide SAgs een direct vaatverwijdend effect hebben en gedeeltelijk stikstofoxide (NO) afhankelijk zijn, maar volledig afhankelijk zijn van de activatie van het K+ kanaal. Aanvullend werden de regio’s welke betrokken zijn in het vaatverwijdende effect geïdentificeerd. De vasculaire tonus determinatie van twintig peptiden die de gehele sequentie van de SPEA antigenen omvatten werd uitgevoerd. Hierbij werden drie functionele regio’s, aminozuren (61-100), (101-140) en (181-220) geïdentificeerd, welke betrokken zijn bij dit effect. Deze
177 bevindingen maken de weg vrij voor het ontwerpen van superantigeen varianten zonder deze regio(‘s) en daardoor mogelijk minder bijwerkingen zouden kunnen hebben, waaronder vaatverwijding en hypotensie, en zo toegepast kunnen worden als beter tolereerbare kanker immunotherapie. Verder stellen we voor dat de drie geïdentificeerde peptiden toegepast zouden kunnen worden als nieuwe antihypertensiva.
In het tweede deel van het proefschrift stellen we oplossingen voor om de beperkingen van een van de strategieën die worden gebruikt in gerichte kankertherapie te overwinnen, namelijk door antilichaam directed enzymtherapie (ADEPT). In Hoofdstuk 4 isoleerden we met succes een nieuwe variant van het glucarpidase-enzym, Xen CPG2, van de SN213-stam van Xenophilus azovorans. In de vergelijking van het nieuwe enzym met het conventionele Ps CPG2 enzym laat een 94% homologie zien. Immunoblot analyse met de polyklonale antilichamen, gekweekt tegen Xen CPG2 gaf echter aan dat het nieuwe enzym antigenvariatie vertoont in vergelijking met het Pseudomonas-enzym dat momenteel gebruikt wordt in ADEPT. We stellen daarom voor dat de nieuw geïsoleerde CPG2-varianten, samen met de conventionele Ps CPG2, zouden kunnen worden gebruikt, als alternatief om de immuunreacties van de patiënten te verminderen. Om de bovenstaande bevinding te bevestigen, is het nieuwe CPG2 dat in deze studie werd geïsoleerd, getest met behulp van bloed dat was verzameld van patiënten die eerder met het Ps CPG2-enzym waren behandeld, om te bevestigen dat de antilichamen opgewekt tegen de laatste niet reageerden met het nieuwe enzym. Dit zou ons vermoeden bevestigen dat de twee enzymen achtereenvolgens kunnen worden gebruikt in ADEPT-behandelingen.
In Hoofdstuk 5 gebruikten we foutgevoelige PCR en DNA-shuffling om nieuwe CPG2-varianten met verbeterde katalytische activiteit te produceren. Concreet
hebben een bibliotheek van vierduizend varianten gescreend op
foliumzuurhydrolyse activiteit. Klonen die hogere activiteit lieten zien, vertoonden een donkerder gele kleuring van kolonies op foliumzuur bevattende agarplaten, ten opzichte van kolonies met het wildtype CPG2, deze werden geïdentificeerd en het
Chapter 8: Samenvatting en Toekomst Perspectieven
178
DNA werd gesequenced. DNA-sequencing van drie isolaten bevestigde dat single-point-mutaties in elke variant enkele aminozuursubstituties veroorzaakten, I100T, T239A en G123S. Om ervoor te zorgen dat de donkere kleur het gevolg was van hogere specifieke activiteit in plaats van hogere niveaus van expressie van het oplosbare eiwit, verrichtten we verdere activiteit en kinetiek experimenten met methotrexaat als substraat. CD-scans van de secundaire structuur van de mutanten lieten een verhoging zien in het percentage alfa-helix vergeleken met het wildtype. Onze aanname is dat dit leidt tot de destabilisatie van het eiwit,
ondersteund door berekeningen in drie softwarepakketten voor
stabiliteitsvoorspelling, waardoor hun activiteit als afweging toeneemt. Toekomstig werk zou kunnen worden gedaan om twee of drie van de individuele mutaties te combineren in een enkel gen en te onderzoeken of de gecombineerde mutaties leiden tot enzymvarianten met nog hogere activiteit. Bovendien moet in
vivo onderzoek worden uitgevoerd om vast te stellen dat de nieuwe varianten
methotrexaat sneller kunnen verwijderen in vergelijking met het wildtype.
In Hoofdstuk 6 hebben we twee langwerkende varianten van CPG2 geproduceerd in een poging om het immunogeniciteitsprobleem van ADEPT op te lossen. Wij voerden PEGylatie van Xen CPG2 uit en produceerden met succes een gePEGyleerde vorm van het enzym, PEG-CPG2. Bovendien hebben we menselijk serumalbumine genetisch aan het enzym gefuseerd om voor de productie van HSA-CPG2. Beide nieuwe varianten, PEG-CPG2 en HSA-CPG, toonden behoud van CPG2-enzymactiviteit, maar met verbeterde oplosbaarheid. De gemodificeerde eiwitten werden gezuiverd en getest op stabiliteit en immunogeniciteit. Beide CPG2-conjugaten verhoogden de serumhalfwaardetijden van CPG2. Immunogeniciteitstest toonde aan dat PEG-CPG2 een verlaagd immunogeen effect had op perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) vergeleken met vrij CPG2. Dit werk baant de weg voor in vivo klinisch onderzoek en klinische onderzoeken met behulp van onze nieuwe gemodificeerde vormen van CPG2 voor de behandeling van kanker en ontgifting van geneesmiddelen.
179 Samenvattend, ADEPT is een effectieve techniek in kanker gerichte therapie. Het veld heeft echter onvoldoende aandacht gekregen van de farmaceutische industrie met bijvoorbeeld oog op het gebruik van antilichaam-geneesmiddel conjugaten. Door de gepresenteerde bevindingen zijn met succes veel nieuwe derivaten
geproduceerd, die een oplossing kunnen leveren op de
immunogeniciteitsproblemen die momenteel ADEPT-behandelingen belemmeren en daardoor mogelijk meer aandacht kunnen vestigen op het potentieel van ADEPT-behandelingen in de kliniek. Aan de andere kant activeren de superantigenen T-cellen van het immuunsysteem niet-specifiek, met productie van enorme hoeveelheden van verschillende cytokinen tot gevolg. Dit maakt superantigenen erg aantrekkelijk voor kanker immunotherapie. Dergelijke therapieën gaan echter gepaard met een hoog risico op levensbedreigende bijwerkingen, zoals acute hypotensie. De nieuwe bevindingen beschreven in dit proefschrift, bijvoorbeeld de identificatie van regio(‘s) in SAgs die bijdragen aan hypotensie, kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe varianten van superantigenen met minder of geen hypotensieve effecten, voor tolereerbare immunotherapie bij kanker. Deze studie opent mogelijk ook de poort naar onderzoek om veiligere superantigenen te produceren voor tumor-gerichte therapie.
Chapter 8: Samenvatting en Toekomst Perspectieven
