spectrofotometrie3

(1)

MOLECULAIRE

SPECTROFOTOMETRIE



Principe:

In de spectrofotometrie wordt de concentratie van een

gekleurde stof bepaald door de kleur dan de oplossing van die stof

te vergelijken met oplossingen waarin diezelfde gekleurde stof zit

maar dan in concentraties die bekend zijn. De kleur kan afkomstig

zijn van de stof zelf maar kan ook het reactieproduct zijn van de te

meten stof met een geschikt reagens.

 Concentratie van een onbekende kan al met het blote oog geschat wordenConcentratie van een onbekende kan al met het blote oog geschat worden  Sneltesten: indicator strips (bijvoorbeeld voor aquaria: nitraat, nitriet, ...)Sneltesten: indicator strips (bijvoorbeeld voor aquaria: nitraat, nitriet, ...)  Nauwkeurige meting: met spectrofotometerNauwkeurige meting: met spectrofotometer

(2)

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

WAT IS LICHT ?

LICHT =

elektromagnetische golven

Naargelang de energie-inhoud van deze

golven wordt het elektromagnetisch

spectrum opgesplitst in :



Gammastraling (behandeling van kanker)



X-stralen (geneeskunde)



Ultraviolet stralen



Zichtbaar licht



Infrarood stralen



Microgolven (microgolfovens)



Radiogolven (F.M. radio, radar, televisie)

veel energie

(3)

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

WAT IS LICHT ?

Enkel een klein deel van het

elektromagnetisch spectrum is

voor de mens zichtbaar als kleur.

Dit is dan het zichtbare gedeelte.

In dit zichtbare deel van

het spectrum kunnen we 7

basiskleuren onderscheiden

(dit zijn de kleuren van de

regenboog):

Rood, Oranje, geel,

groen, blauw, indigo

en violet.

(4)

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE



Ultra Violet (UV)

200 - 400 nm



Zichtbaar (Visible - Vis) 400 - 800 nm



Nabij Infra Rood (NIR) 800 - 2500 nm



Infra Rood (IR)

2500 - 12500 nm

(5)

Licht is een elektromagnetisch golfverschijnsel dat zich in vacuum met een constante snelheid (c) van ca. 300 000 km/s voortplant.

Een golf kunnen we karakteriseren met:

De trillingstijd T: de tijdsduur van een trilling (eenheid: s)

De frequentie f: het aantal trillingen per seconde (eenheid: Hz) (f=1/T).

De golflengte : de lengte van een trilling (eenheid: nm (10-9_{m) of Å (10}-10_m))

Het golfgetal s:1/ (eenheid: cm-1) - wordt voornamelijk in de Infra Rood spectroscopie gebruikt

de golfsnelheid: c = (afgelegde weg / tijd) =/ T = f .  (f=1/T).

als de golflengte toeneemt neemt de frequentie af en vice versa.

Electromagnetische golven

Electrisch veld

(6)

Kleurencirkel en kleurenspectrum

• als we uit wit licht de kleur groen verwijderen: geeft rode kleur •. We zien steeds de complementaire kleur

(7)

Licht als energie



De intensiteit van een bundel licht is een maat voor de hoeveelheid

energie. Deze bundel bestaat uit een stroom energiedeeltjes. Deze

deeltjes worden KWANTEN of FOTONEN genoemd

.

De wet van Planck



De energie inhoud van elk deeltje is evenredig met de frequentie.

Dit wil zeggen dat een bundelstraling met een frequentie

f

bestaat

uit fotonen met een energie gelijk aan :

E = h . f = h.c/



Hierin is

(8)

Interactie tussen materie en straling



Materie getroffen door electromagnetische

straling:



De straling wordt

doorgelaten

: fotonen passeren ongehinderd



De straling wordt

verstrooid

: fotonen veranderen van richting



De starling wordt

geabsorbeerd

: fotonen worden door het

medium opgenomen

 Energie van het medium zal stijgen met de energieinhoud van de Energie van het medium zal stijgen met de energieinhoud van de

fotonen

(9)

Moleculaire energieniveaus

Veel meer vrijheidsgraden dan een atoomkern+electronen

Buig, strek, rotatie-modes met eigen gequantizeerde energieniveaus Kleine energieverschillen ! dichte `bosjes’ van lijnen, voornamelijk IR

De opgenomen energie kan gebruikt worden ter verhoging van:

•Rotatie energie:snelheid waarmee een molecule draait om zijn asRotatie energie:snelheid waarmee een molecule draait om zijn as

•Vibratieenergie: trillen van de atomen in een moleculenVibratieenergie: trillen van de atomen in een moleculen

•Electronen energie: energie die de electronen bezitten in hun banen Electronen energie: energie die de electronen bezitten in hun banen om de atoomkern

om de atoomkern

Etot= Eelc + Evib + E rot

Eelec >> Evib >> Erot

VIS

(10)

Grond toestand Aangeslagen toestand

E

n

er

gi

e

E₁=hf₁=h.c./₁ E₂=hf₂=h.c./₂ E₃=hf₃=h.c/₃ Vibrationele niveaus Electronen In grond toestand Rotationele niveaus

(11)

I₀ = I_a + I_t + I_r

Indien men er voor zorgt dat Ir = 0 door bv. een blanco te gebruiken en te zorgen dat de reflectie geminimaliseerd wordt dan is de bovenstaande vergelijking gelijk aan :

I₀ = I_a + I_t

Spectrofotometrie

(12)

De wet van Lambert

invloed van de

invloed van de vloeistofdikte (cuvette lengte)vloeistofdikte (cuvette lengte) ten opzicht van de intensiteit van ten opzicht van de intensiteit van de lichtstraal.

de lichtstraal.

de intensiteit van de uittredende lichtstraal t.o.v. de vloeistofdikte vertoont een

exponentieel dalende kurve.

Waarin k een constante is en b de dikte van de vloeistoflaag

Absorptie

b

I

_t kb t

I

 10

₀  kb t

I

_

 10

0 kb kb I I_t _kb      _log₁₀ _log₁₀ log 0 0

I

T

_

t _transmissie

100 %

0

x

I

T

_

t Procentuele transmissie T I I A _log t _log 0     Dan wordt

b

k

A



.

(13)

Wet van Beer



Naar analogie van de bovenstaande afleiding van de wet van

Lambert kan men de wet van Beer bepalen.



Hierin wordt de absorptie bestudeerd i.f.v. de

concentratie van de

oplossing

waardoor men licht gaat zenden.



Men bekomt eveneens een exponentieel dalende kurve met

volgende formule :



I

_t_t

= I

₀₀

. 10

– k2.C– k2.C



Verdere analoge afleiding leert ons dat de absorptie in een

oplossing rechtevenredig toeneemt met stijging van de concentratie

in de oplossing of :



A = k2 . C

It

(14)

Wet van Lambert-Beer

Indien men de wet van Lambert en Beer samenvoegt kan men stellen

dat :

A = k . b

A = k

₂2

. C

Of dat

A =k. k

2₂

.b. C

A = ε .b. C

De wet van Lambert-Beer geldt alleen als aan de volgende voorwaarden wordt voldaan: •monochromatisch licht

•"optisch lege" vloeistoffen (geen lichtverstrooiende deeltjes aanwezig) •constante temperatuur

•niet te geconcentreerde oplossing

ε = molaire absorptiecoefficient (L/(mol.cm))

b= dikte van de cuvette c= concentratie in mol/L

(15)

Opnemen van absorptiespectrum

 Manueel of automatisch (in nieuwere toestellen)Manueel of automatisch (in nieuwere toestellen)  2 oplossingen: 2 oplossingen:

 blanco (bevat alles behalve de te meten stof)blanco (bevat alles behalve de te meten stof)  Standaard met hoogste concentratieStandaard met hoogste concentratie

Voorbeeld: Fe2+ + fenantroline geeft rood complex Voorbeeld: Fe2+ + fenantroline geeft rood complex

dus absorbeert tussen 480 en 550nm dus absorbeert tussen 480 en 550nm

we nemen het spectrum op tussen 450 en 600nm we nemen het spectrum op tussen 450 en 600nm

  AA 450 450 0,070,07 470 470 0,10,1 490 490 0,170,17 510 510 0,220,22 530 530 0,250,25 550 550 0,250,25 570 570 0,210,21 590 590 0,140,14 610 610 0,070,07

(16)

Doel = Concentratiemetingen

A₄ A₃ A₂ A₁

A

_x C₁C₂C₃C₄

C

_x

y = ax + b

Calibratiemethode: ijklijn

Van de te bepalen verbinding wordt een serie (nauwkeurig bekende!) verdunningen gemaakt, waarvan de absorpties worden gemeten.

Door gebruik te maken van interpolatie kan de concentratie van een onbekend monster na meting van de absorptie worden berekend

(17)

Concentratiebepaling: praktisch

voorbeeld



Fe met fenantroline



Welk concentratiegebied: rekening houden met lineair gebied (uit

literatuur): tot 10 mg/L



Maak stockoplossing van 0.5g/L=500 mg/L



Hieruit maken we verdunningen :

 0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L, ....10mg/L en meten de absorbantie0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L, ....10mg/L en meten de absorbantie 

Concentratiebepaling:

 Meet Absorbantie van onbekende oplossingMeet Absorbantie van onbekende oplossing

 Kunnen gemiddelde _{Kunnen gemiddelde}

ε

bepalen uit_{bepalen uit} de standaarden en deze gebruiken in _{de standaarden en deze gebruiken in}

de berekening

 Kunnen ijkrechte opstellen en concentratie van onbekende berekenen uit Kunnen ijkrechte opstellen en concentratie van onbekende berekenen uit

vergelijking

(18)

Instrumentatie

lichtbron _{golflengteselectie} uittreespleet cuvet detector versterker uitlezing intreespleet

(19)

stralingsbron



De Stralingsbron moet van constante stralingsintensiteit

zijn en straling uitzenden zo gelijkmatig mogelijk over

het gehele golflengtegebied verdeeld.



Meestal gebruikt men voor het zichtbare gebied een

wolfraam lamp die een continue spectrum heeft van 350

- 2500 nm.



Een Deuteriumlamp met een hoge intensiteit tussen 180

nm en 375 nm

(20)

Golflengteselectie



Filters of monochromators worden gebruikt om de door de bron

uitgezonden straling te scheiden in zijn samengestelde golflengtes.



Monochromatisch licht nodig voor:

 Grotere selectiviteitGrotere selectiviteit

 Betere gevoeligheidBetere gevoeligheid

 Zekerheid dat aan wet Lambert-Beer voldaan wordtZekerheid dat aan wet Lambert-Beer voldaan wordt 

Voor de golflengteselectie kunnen:

 FiltersFilters (absorptie of interferentiefilters) (absorptie of interferentiefilters)  Monochromators: Monochromators: prismasprismas en en roostersroosters

(21)

Filters

Absorptiefilters

Dit zijn filters die een deel van het lichtspectrum doorlaten en een ander deel

tegenhouden door absorptie. Ze bestaan uit gekleurd glas of uit een organische kleurstof gesuspendeerd in gelatine en vastgehouden tussen glazen plaatjes.

Ze hebben een effectieve bandbreedte van bv. 20 nm dwz dat bv. een filter van 500 nm eigenlijk alle golven doorlaat tussen 490 nm en 510 nm

Interferentiefilters

Deze zijn gebaseerd op optische interferentie, reflectie en uitdoving. Ze hebben een kleinere bandbreedte dan de absorptiefilters

(22)

MONOCHROMATORS: Prisma



Lichtstralen worden gebroken bij

de overgang van lucht naar glas

(wet van Snellius)

(n=brekingsindex)



Breking is golflengteafhankelijk:

hierdoor krijgen we dispersie

van licht



Een lens focuseert het

uittredend licht naar de

uittreespleet



Door het prisma te draaien kan

men de gewenste golflengte

selecteren

(23)

Monochromator: rooster



Rooster of tralie op

regelmatige afstand van elkaar

(vb. krassen op een glazen

plaat (zo als een CD)



Parabolische spiegel richt wit

licht op het rooster



Licht van verschillende

golflengtes wordt weerkaatst

onder een andere hoek



2

dede

spiegel richt het weerkaatst

licht op de uittreespleet



Door de tralie te draaien

selecteert men de golflengte

(24)

monochromator

Een monochromator zal de lichtstraling

scheiden volgens de golflengte en zal om

het even welk deel van de straling

doorlaten. Alle licht gaat dus door heen de

monochromator. Er zal dus niet

geselecteerd worden door absorptie zoals

bij filters.

(25)

Kuvetten zijn de recipiënten die gebrukt worden om de oplossingen te meten in de spectrofotometer.

Er bestaan talrijke uitvoeringen naargelang het gebruik. Kuvetten kunnen gemaakt zijn uit glas, kwarts of kunststof.

Kwartskuvetten worden gebruikt voor het werken in het UV-gebied, hoewel heden ook kunststofkuvetten uit bv. metacrylaat kunnen gebruikt worden

Naargelang het volume kan men kuvetten van verschillende inhoud en weglengte gebruiken.

De meest gebruikte weglengte is één cm en het meest courante volume is 3,5 ml en 1,5 ml.

Een kuvet heeft meestal twee gepolijste of heldere zijden en twee matte zijden, doch voor bv. fluorimetrie moet men kuvetten gebruiken met vier gepolijste zijden.

cuvetten

(26)

detector

De stralingsdetector (bv fotocel) zet de erop vallende straling om in

een elektrisch signaal dat na versterking wordt gemeten. Van de

detector wordt vereist:

- een hoge gevoeligheid voor een groot golflengtegebied

- een rechtlijnig verband tussen de intensiteit van de lichtstraling en het

daardoor opgewekte elektrische signaal.

De versterker moet een lineaire afhankelijkheid tussen invoer en

uitvoer bezitten.

De meter geeft het gemeten signaal aan op een transmissie schaal (%)

en/of extinctie schaal (log-schaal).

(27)

Fotocel:

cylindrisch glazen omhulsel met fotogevoelige kathode en

anode.Lichtinval rukt electronen los uit kathode die worden aangetrokken door de kathode waardoor een stroom ontstaat

Fotovermeningvuldigingsb

uis:

een fotogevoelige kathode en 10 anodes op verschillend

potentiaal: geeft een belangrijke versterking van het signaal

(28)

•De meetresultaten van een spectrofotometrische bepaling

worden zowel analoog als digitaal geregistreerd

•kan ze zowel als een absorptie A of Procentuele Transmissie %

T aflezen.

•Ook kan men bij een aantal spectrofotometers rechtstreeks

concentraties aflezen mits men de richtingscoëfficiënt ( de

molaire absorptiecoëfficiënt ) kent en in het apparaat vastlegt.

uitlezing

(29)

spectrofotometer recorder Automatische buret

Spectrofotometrische titratie

In plaats van een cuvet meetcel (1cm)

ondergedompeld in de oplossing

Titreren met constante debiet (ml/min)

Papier loopt met constante snelheid (cm/min)

(30)

CH3COOH FFT kleurloos

NaOH roos-paars Eindpunt van de titratie

Bepaling absorptiespectrum FFT in zuur en basisch midden A  zuur A  basisch Bepaling werkgolflengte

CH₃COOH + NaOH CH₃COONa + H₂O

Spectrofotometrische titratie van azijn

(31)