2
U
ITVOERINGSGEGEVENS
N
AAM UITVOERDER
E-
MAILADRES
Marthe van der Ven mcl.vanderven@student.avans.nl
P
ERIODE
Afstudeerstage van 27-08-12 t/m 18-01-2013
B
EDRIJFSBEGELEIDER
Dr. Eric Jansen e.jansen@nclms.ru.nl
S
TAGEDOCENT
Dr. Kees Rodenburg cw.rodenburg@avans.nl
V
ERSIE
1.3
D
ATUM
:
03-01-2013
O
PLEIDING
Avans Hogeschool
Academie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu Lovensdijkstraat 61-63
4818 AJ Breda
O
RGANISATIE
Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Centre for Neuroscience, Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences (NCMLS), Radboud University Nijmegen. Afdeling Moleculaire Dierfysiologie, (Prof. Dr. Gerard Martens)
Geert Grooteplein-Zuid 28 6525 GA Nijmegen
3
Voorwoord
Deze scriptie is geschreven in het kader van de voltijd opleiding Forensisch Laboratorium Onderzoek (studierichting Biologie en medisch onderzoek) aan de Avans Hogeschool Breda. Deze scriptie is het resultaat van een onderzoek dat als afstudeeropdracht is opgezet en uitgevoerd. Tijdens deze afstudeerstage is er onderzoek gedaan naar de recent ontdekte V-ATPase accessoire subunit Ac45RP. Het onderzoek is uitgevoerd op de afdeling Moleculaire Dierfysiologie aan het Nijmegen Centre for Molecular Life Sciences, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Centre for Neuroscience te Nijmegen.
Graag wil ik via deze weg mijn begeleider Dr. Eric Jansen bedanken voor de goede ondersteuning tijdens het project. Het was een erg leerzame tijd door de vele nieuwe technieken. Daarnaast wil ik ook Nick van Bakel bedanken die mij geholpen heeft bij de uitvoering van deze technieken en Prof. Dr. Gerard Martens wil ik bedanken voor het mogelijk maken van mijn afstudeerstage.
Marthe van der Ven Nijmegen, december 2012
4
Samenvatting
Recent werd het nieuwe hersen-specifieke eiwit genaamd Ac45-gerelateerde proteïne (Ac45RP) ontdekt. Van dit eiwit wordt verwacht dat het bindt aan de membraansector (V0) van de V-ATPase. De V-ATPase is een
protonenpomp en bestaat behalve uit de membraan-gebonden V0-sector ook uit de cytoplasmatische V1
-sector. De V0-sector speelt een belangrijke rol bij membraanfusie. Het Ac45RP werd aangetoond in blaasjes
(enlargeosomen) welke membraan leveren aan de groeikegel van de uitgroeiende neuriet in primaire corticale neuronen. Overexpressie van Ac45RP in neuroblastoma 2a (N2a) cellen leidde tot een verhoging van neurale uitgroei. Het Ac45RP/V0 complex zou kunnen functioneren bij de membraanfusie van enlargeosomen met het
plasmamembraan in de groeikegel. Het doel van dit onderzoek was om meer inzicht te krijgen in de eigenschappen, functie en lokalisering van Ac45RP. Om dit doel te kunnen bereiken, werden verschillende studies uitgevoerd. N2a cellen werden behandeld met tunicamycine om de glycosylering van het Ac45RP-eiwit te remmen. Daarnaast werd de endogene Ac45RP mRNA expressie bepaald in N2a cellen na differentiatie van de cellen. Verder werd er een reductie van het endogene Ac45RP mRNA/eiwit verkregen door middel van RNA interferentie (short hairpin RNA’s (shRNA’s)) en werd de invloed op neurale uitgroei bestudeerd. Ook werden er Dendra2 gefuseerde Ac45RP-eiwitten in N2a cellen gebracht om door middel van live cell imaging het proces van neurale uitgroei te kunnen gaan volgen. Naast deze studies werd door middel van in situ hybridisaties bestudeerd in welke cellen van het muizenbrein Ac45RP tot expressie komt. Uit de resultaten van dit onderzoek kan geconcludeerd worden dat Ac45RP mogelijk uit twee geglycosyleerde vormen bestaat en dat er na differentiatie geen extra nieuw Ac45RP mRNA gevormd wordt. Verlaging van Ac45RP mRNA expressie via transiënte transfecties met shRNAs lijkt het proces van neurale uitgroei niet duidelijk te remmen. De nieuw-gegenereerde stabiele shRNA cellijnen toonden een duidelijke reductie van Ac45RP mRNA expressie aan en deze lijnen kunnen worden gebruikt voor verder eiwit en differentiatie-onderzoek. De expressie van de Dendra2 fusie-eiwitten bleek te laag voor live cell imaging en moet dus nog verder geoptimaliseerd worden. Verder bleek het gevolgde in situ hybridisatie protocol goed te werken voor de detectie van Ac45 mRNA maar zal nog verder moeten worden geoptimaliseerd voor Ac45RP mRNA detectie. Deze studie heeft dus een aantal nieuwe tools opgeleverd om de functie van het Ac45RP glyco-eiwit in het proces van neuronale uitgroei verder te kunnen bestuderen.
5
Inhoudsopgave
Voorwoord ... i Samenvatting ... ii Inhoudsopgave ... iii Hoofdstuk 1: Inleiding ... 7 1.1. Neuronale cellen ... 7 1.1.2. Neuronale uitgroei ... 81.2. Vacuolaire proton ATPase ... 8
1.2.1. De structuur van V-ATPase ... 8
1.2.2 Rol van de V-ATPase V0 sector in membraanfusie ... 9
1.2.3. De V-ATPase accessoire subunits Ac45 en het Ac45RP ... 11
1.3. N-glycosylering van het Ac45RP-eiwit ... 12
1.4. Doelstelling... 12
Hoofdstuk 2: Materiaal en Methode ... 14
2.1 Cellen... 14
2.2. pSuper.neo+gfp Vector ... 14
2.2 Transfectie van cellen ... 14
2.3 De remming van de Ac45RP N-glycosylatie in N2a cellen met behulp van tunicamicine ... 14
2.4 SDS-PAGE ... 15
2.5 Western Blotting ... 15
2.6 RNA-Isolatie ... 15
2.7 cDNA... 15
2.8 Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) ... 16
2.9 Immunohistochemie ... 16
2.10 Digoxigenin (DIG) gelabelde RNA probes voor in situ hybridisatie ... 16
2.11 Kwantificering van DIG-gelabelde RNA probes d.m.v. spotblot ... 16
2.12 In situ hybridisatie ... 17
Hoofdstuk 3: Resultaten... 18
3.1 Remming van de N-glycosylering van Ac45RP in N2a cellen door middel van tunicamycine ... 18
3.2 De Ac45RP mRNA expressie in N2a cellen tijdens differentiatie met dbcAMP ... 20
3.3 De reductie van de Ac45RP mRNA en eiwit in N2a cellen ... 21
3.3.1. Differentiatie van N2a cellen na reductie van Ac45RP met behulp van shRNA ... 22
3.3.2. De reductie van Ac45RP mRNA in stabiele shRNA cellijnen ... 24
6
3.5 De lokalisatie van Ac45RP-expresserende cellen in het muizenbrein ... 26
Hoofdstuk 4: Discussie/Conclusie ... 30
4.1. Remming van de N-glycosylering van Ac45RP in N2a cellen door middel van tunicamicine ... 30
4.2 De Ac45RP mRNA expressie in N2a cellen tijdens differentiatie met dbcAMP ... 30
4.3 De reductie van de Ac45RP mRNA en eiwit in N2a cellen ... 31
4.4 Het proces van het Ac45RP-eiwit in neurale uitgroei van N2a cellen ... 31
4.5 De lokalisatie van Ac45RP-expresserende cellen in het muizenbrein ... 32
Hoofdstuk 5: Algemene conclusie ... 33
Literatuurlijst ... 34
Bijlagen ... 36
Bijlage I: pSUPER.neo + GPF vector ... 36
Bijlage II: Dendra2-MmAc45RP-pcDNA3 ... 37
Bijlage III: MmAc45RP-Dendra2-pcDNA3 ... 38
Bijlage IV: MmAc45RP-AS-ISF-pJET1.2 en MmAc45-AS-ISF-pJET1.2 ... 39
7
Hoofdstuk 1: Inleiding
1.1.
N
EURONALE CELLEN
De ontwikkeling en functie van multicellulaire organismen hangt af van de unieke eigenschap dat individuele cellen met elkaar kunnen communiceren. In het brein, zorgen zenuwcellen (neuronen, zie figuur 1) voor een belangrijke communicatie tussen het brein en het lichaam. Deze neuronen bestaan uit vele dendrieten, dit zijn vertakte uitlopers van een zenuwcel en ontvangen signalen van andere neuronen. Een neuron heeft één uitloper (axon) die zorgt voor het transport van signalen naar andere cellen. Elk vertakte eind (groeikegel) van een axon gaat een verbinding (synaps) aan met een andere cel. De neuronale cellen zijn gespecialiseerd in het ontvangen, omzetten, en uitzenden van de boodschappermoleculen (neurotransmitters). De afgifte van deze neurotransmitters is een gereguleerd proces dat plaatsvindt van de gereguleerde secretieroute. Deze secretieroute bestaat uit het endoplasmatisch reticulum (ER) waarin de eiwitsynthese doormiddel van ribosomen plaatsvindt. Vervolgens worden de gevormde producten gemodificeerd en gesorteerd in het Golgi en trans-Golgi netwerk. Wanneer de eiwitten het trans-Golgi netwerk bereiken worden er secretieblaasjes gevormd. Hier in worden de eiwitten verder gemodificeerd om daarna uitgescheiden te worden. De protongradiënt is belangrijk voor een goede werking van de secretieblaasjes. De vacuolaire proton ATPase (V-ATPase) is een belangrijke protonpomp die zorgt voor deze gradiënt. In de paragraaf 1.2. wordt de werking van deze protonpomp en de associatie met het onderzoek verder uitgelicht [1,2].
FIGUUR 1: STRUCTUUR VAN EEN NEURON. ZICHTBAAR ZIJN DE DENDRIETEN EN HOE DE AXONEN ZICH HECHTEN AAN EEN ANDERE
NEURONALE CEL. DE AANHECHTING VAN DE AXON AAN DE CEL HEET EEN SYNAPS DIE OOK ZICHTBAAR IS IN DE AFBEELDING. DE SIGNALEN DIE WORDEN AFGEGEVEN ZIJN DE NEUROTRANSMITTERS [1].
8
1.1.2.
N
EURONALE UITGROEI
Van het eiwit Ac45-related proteïne (Ac45RP) dat centraal staat in dit onderzoek wordt verondersteld dat dit eiwit de V-ATPase reguleert in het proces van neurale uitgroei (zie paragraaf 1.2.3.). Neuronale uitgroei is een essentieel proces voor de differentiatie van neuronen. Bij neuronale uitgroei, groeien neuronen uit tot neuriten (axonen of dendrieten). Dit proces is naast de groei van het cytoskelet ook afhankelijk van de exocytose van Ca2+ (zie figuur 2). Exocytose is de fusie van de baasjes met het plasmamembraan. Een transportblaasje dat is uitgegroeid in het Golgi-apparaat beweegt via de microtubuli van het cytoskelet naar het plasma membraan. Wanneer het membraan van het blaasje in aanraking komt met het plasma membraan zullen de twee membranen fuseren. Het proces waarbij het membraan van het blaasje fuseert met het plasmamembraan is Ca2+-afhankelijk. Dit membraantransport vindt plaats door gespecialiseerde blaasjes, de zogenaamde enlargeosomen. Door dit mechanisme kan de groeikegel, het uiteinde van een axon, uitgroeien [1,2,3].
FIGUUR 2: NEURONALE UITGROEI. DE CONCENTRATIE GRADIENT VAN DE ‘ATTRACTIVE GUIDANCE CUE’ INDUCEERT CALCIUM SIGNALEN
AAN EEN ZIJDE VAN DE GROEIKEGEL. DEZE CALCIUM SIGNALEN WORDEN OPGENOMEN IN DE BLAASJES EN DOORMIDDEL VAN EXOCYTOSE AFGEGEVEN AAN EEN ZIJDE VAN DE GROEIKEGEL. HIERDOOR GAAT DE GROEI VAN DE AXON IN DE RICHTING VAN DE ‘ATTRACTIVE GUIDANCE CUE’ *4+.
1.2.
V
ACUOLAIRE PROTON
ATP
ASE
De V-ATPases zijn familie van de ATP-afhankelijke protonpomp en heeft als functie intracellulaire delen te verzuren en in sommige gevallen zorgt het voor het transport van protonen door het plasma membraan van eukaryote cellen. De V-ATPase is gelokaliseerd op verschillende cellulaire membranen van eukaryote cellen zoals endosomen, lysosomen, en onder andere de secretieblaasjes. V-ATPase speelt onder andere een belangrijke rol bij intracellulair membraan transport, eiwitdegradatie en de opname van neurotransmitters. Ook heeft recent onderzoek heeft uitgewezen dat de V-ATPase een belangrijke rol speelt bij Ca2+-afhankelijke membraanfusie (zie paragraaf 1.2.2.) [2,5,6].
1.2.1.
D
E STRUCTUUR VAN
V-ATP
ASE
V-ATPase bestaat uit twee hoofdstructuren het V0 en het V1 domein (zie figuur 3). Het V1-domein zorgt voor de
ATP hydrolyse. De energie die daarbij vrijkomt wordt gebruikt door het membraangebonden V0-domein die de
protonen over het membraan transporteert. V1 bestaat uit acht verschillende subunits (A-H) en het V0-domein
9
FIGUUR 3: SCHEMATISCHE WEERGAVE VAN DE V-ATPASE POMP. ZICHTBAAR HET V1 DOMIJN GELEGEN IN HET CYTOPLAMA EN HET V0
DOMEIN DAT AAN HET MEMBRAAN GEBONDEN IS. OOK HIER HET ACCESSOIRE SUBUNIT AC45 ZICHTBAAR WELKE DE V-ATPASE ACTIVITEIT REGULEERT IN NEUR0-ENDOCRINE CELLEN.
1.2.2
R
OL VAN DE
V-ATP
ASE
V
0SECTOR IN MEMBRAANFUSIE
Naast de functie als protonpomp heeft onderzoek uitgewezen dat het membraandomein (Vo) van V-ATPase ook
betrokken is bij Ca2+-afhankelijke membraanfusie van secretieblaasjes (zie figuur 4) [19].
In neurotransmitterblaasjes zorgt de V-ATPase (V1 en V0) voor de H+ opname in het blaasje. De
neurotransmitter pomp (NT) verbruikt deze protonengradiënt om neurotransmitters in het blaasje te krijgen. Wanneer het blaasje gevuld is met neurotransmitters zal het V1-domein losraken van het V0-domein.
Vervolgens zullen de SNARE eiwitten (waaronder VAMP-2) een interactie aangaan met het V0-domein van de
V-ATPase. SNARE eiwitten zijn eiwitten die zorgen voor de fusie van de het membraan van de blaasjes met het plasmamembraan. Bij de fusie van het membraan vormen verschillende SNARE eiwitten een complex met elkaar. Na deze fase zijn er twee hypotheses over hoe het membraan van het blaasje fuseert met het plasmamembraan. Een SNARE-V0 complex zorgt er in de eerste hypothese voor dat het membraan fuseert met
het plasmamembraan waardoor de neurotransmitters worden afgegeven. In de tweede hypothese is er een extra V0-domein in het plasmamembraan betrokken. Hier ontstaat er tussen de twee V0-domeinen een kanaal
10
FIGUUR 4: MODEL VAN MEMBRAANFUSIE MET DE V-ATPASE V0 SECTOR. V-ATPASE ZORGT VOOR HET H+ TRANSPORT IN HET BLAASJE. DE
NEUROTRANSMITTER POMP VERBRUIKT H+ VOOR HET TRANSPORT VAN NEUROTRANSMITTERS IN DE CEL. WANNEER HET BLAASJE VOL IS ZAL DE V1-SECTOR LOSLATEN EN ZULLEN DE SNARE EIWITTEN HECHTEN AAN HET V0-DOMEIN. VERVOLGENS KAN HET ZIJN DAN HET
MEMBRAAN FUSEERT MET HET PLASMAMEMBRAAN WAARDOOR DE NEUROTRANSMITTERS WORDEN VRIJGELATEN EN HET
PLASMAMEMBRAAN UITGROEID. EEN ANDERE MOGELIJKHEID IS DAT ER NOG EEN EXTRA V0-SECTOR HECHT AAN HET PLASMAMEMBRAAN
WAARDOOR EN EEN KANAAL ONTSTAAT WAARDOOR DE NEUROTRANSMITTERS WORDEN VRIJGELATEN [19].
Binnen onderzoek was de werkhypothese (Figuur 5) dat het Ac45RP-eiwit een belangrijke rol speelt bij de membraanfusie in de groeikegel bij neurale uitgroei. Het model wat deze hypothese onderbouwd is dat Ac45RP een interactie aangaat met de V0-sector, waardoor de V1-sector van V-ATPase niet meer kan hechten. Dit
complex zou kunnen functioneren bij de SNARE-membraanfusie (zie figuur 4) van enlargeosomen met het plasmamembraan. De V1-sector van de V-ATPase speelt hierbij geen rol omdat enlargeosomen pH neutraal zijn.
Omdat de enlargeosomen voor zover bekend geen inhoud bevatten wordt er gedacht dat deze blaasjes alleen functioneren in het leveren van membraan aan de groeikegel tijdens neuronale uitgroei [2].
11
FIGUUR 5: MODELSYSTEEM VAN AC45RP. DE HYPOTHESE IS DAT AC45RP EN DE V0-SECTOR VAN DE V-ATPASE EEN COMPLEX VORMEN OP
DE ENLARGEOSOMEN. WAARDOOR ER VERVOLGENS DOOR DE ENLARGEOSOMEN MEMBRAAN KAN WORDEN AFGEGEVEN AAN HET PLASMAMEMBRAAN VAN DE GROEIKEGEL.
1.2.3.
D
E
V-ATP
ASE ACCESSOIRE SUBUNITS
A
C
45
EN HET
A
C
45RP
Een eiwit dat de V-ATPase activiteit reguleert in neuro-endocrine cellen is het accessoire subunit Ac45-proteïne [8]. Recent onderzoek heeft tot de ontdekking van een breinspecifieke Ac45 paraloog, het Ac45-gerelateerde proteïne (Ac45RP), geleid. Het eiwit blijkt evolutionair geconserveerd te zijn en is aanwezig in alle vertebraten (gewervelde) en niet in evertebraten. Ac45RP vertoont een aminozuurgelijkenis met Ac45 in specifieke delen van het molecuul. Ac45 en Ac45RP zijn beide N-geglycosyleerde type I transmembraan eiwitten (zie figuur 6). Dit houdt in dat de N-terminus (begin van een eiwit) aan het lumen is blootgesteld zoals ook zichtbaar in figuur 3. Ook hebben beide eiwitten een relatief lange N-terminus en cysteine aangrenzend aan de het transmembraan domein. Cysteine zorgt ervoor dat er zwavelbruggen gevormd kunnen worden en is belangrijk voor de stabiliteit van het gevormde eiwit. Enkele verschillen tussen Ac45 en Ac45RP zijn dat Ac45RP geen herkenningssequentie in het lumen heeft voor furine. Furine is een enzym dat een eiwit op een specifieke plaats kan klieven. Het Ac45-eiwit heeft deze herkenningsplek wel voor furine. En uit onderzoekt blijkt dat het Ac45-eiwit vroeg in de secretie route wordt gekliefd en daarna pas werkzaam kan zijn bij de regulatie van V-ATPase [18].
Een ander verschil tussen de eiwitten is dat de C-terminus twee maal korter is bij het Ac45-eiwit dan bij het Ac45RP-eiwit. In tegenstelling tot Ac45 is de expressie van Ac45RP mRNA beperkt tot het zenuwstelsel. Van dit Ac45RP-eiwit wat centraal staat in dit onderzoek wordt verondersteld dat het V-ATPase reguleert in het proces van neurale uitgroei. Dit wordt gedacht omdat na overexpressie van het proteïne Ac45RP bleek dat er een toename in neurale uitgroei ontstond. En na onderzoek bleek dat het Ac45RP mRNA in relatief hoge hoeveelheid in de bulbus olfactorius in het muizen brein aanwezig is. De bulbus olfactorius is een hersenstructuur welke een belangrijke rol speelt bij het reukvermogen en waar veel nieuwgeboren neuroblasten aanwezig zijn die neurale uitgroei vertonen [2,7,8].
12
FIGUUR 6: STRUCTUUR EN VERGELIJKING VAN LINEAIR AC45 EN AC45RP. AC45 EN AC45RP LATEN EEN HOGE GELIJKENIS ZIEN IN DE
CYSTEINE BEVATTENDE FRAGMENTEN EN IN TRANSMEMBRAAN REGIO. DE SPLITSINGSPLAATS WORDT IN WEERGEGEVEN BIJ AC45 DOOR DE GROENE LIJN IN HET MIDDEN VAN HET EIWIT. C: CYSTEINE; TM: TRANSMEMBRAAN DOMEIN.
1.3.
N-
GLYCOSYLERING VAN HET
A
C
45RP-
EIWIT
Glycosylering van een eiwit heeft een belangrijke rol in de regulatie van eiwitexpressie, eiwitstructuur, stabiliteit en het transport. De N-gekoppelde glycosylering van eiwitten is een fundamentele en uitgebreide modificatie dat resulteert in de aanhechting van glycanen aan de aminogroep van asparagine (N) in eiwitketens. De oligosaccharide keten wordt door middel van oligosaccharyltransferase (OST) overgebracht van Dolichol naar de peptide sequentie Asn-X-Ser/Thr (X kan geen proline zijn) in het endoplasmatisch reticulum (ER). De oligosaccharide keten bestaat uit Glucose3-Mannose9-N-acetylglucosamine2 (Glc3Man9GlcNAc2). Na de
aanhechting van deze keten en de vouwing van het eiwit worden de Glucose groepen verwijderd. Het eiwit kan hierdoor worden geëxporteerd naar de Golgi waar er een kern structuur zal ontstaan van Mannose3-
N-acetylglucosamine2. Die mogelijk weer verlengd kan worden met verschillende monosaccharides [20,21].
Het Ac45RP-eiwit bevat zeven potentiëlen N-glycosylerings sites (Figuur 5) waarbij een exogene behandeling met N-glycosidase F een daling veroorzaakte van ≈44kDa (van ≈80kDa naar ≈36kDa) in moleculaire massa, welke de gemiddelde moleculaire massa per glycaan op ≈7kDa brengt. N-glycosidase F hydrolyseert de glycoproteïne door het klieven van intacte glycanen. Wanneer het endogene Ac45RP in N2a cellen werd behandeld met N-glycosidase F werd alleen het geglycosyleerde eiwit van ≈80kDa terug gevonden. Door dit gegeven is in plaats van N-glycosidase F gebruik gemaakt van Tunicamycine. Tunicamycine inhibeert de eerste stap in het glycosyleringsproces waarbij N-acetylglucosamine2 (GlcNAc2) aan dolichol hecht. Wanneer deze stap
geinhibeert wordt kan er geen geglycosyleerde vorm van het eiwit meer aangemaakt worden [2,20,21].
1.4.
D
OELSTELLING
Het Ac45RP-eiwit is een recentelijk ontdekt hersenspecifiek eiwit en maakt waarschijnlijk onderdeel uit van de enlargeosomen, gespecialiseerde blaasjes die zorgen voor membraantransport [3]. Na onderzoek bleek dat het Ac45RP-eiwit vooral tot expressie komt in de Bulbus olfactorius (structuur in hersenen betrokken bij reukvermogen) van het muizenbrein. Dit eiwit blijkt een paraloog van de ATPase regulator Ac45 te zijn. De V-ATPase is een belangrijke protonenpomp, maar recentelijk onderzoek heeft laten zien dat de membraansector (V0) van deze pomp ook een rol speelt bij membraanfusie [8]. Na overexpressie van het proteïne Ac45RP in N2a
cellen bleek dat er een uitgebreidere neurale uitgroei ontstond. Door dit gegeven wordt er gedacht dat het een belangrijke rol speelt bij de neurale uitgroei. Echter is er tot op heden nog weinig informatie bekend over het Ac45RP-eiwit en zijn functie [2].
13
Het doel van het onderzoek was meer inzicht te krijgen over de functie van het Ac45RP-eiwit en mechanismen die betrokken zijn bij neurale uitgroei en hersenontwikkeling. Dit doel werd bereikt door:
(i) bepalen of Ac45RP een N-geglycosyleerd eiwit is door het endogene Ac45RP-eiwit in N2a te behandelen met tunicamycine. Tunicamycine inhibeert de eerste stap in het glycosyleringsproces waarbij N-acetylglucosamine2 (GlcNAc2) aan dolichol hecht. Wanneer deze stap geinhibeert wordt kan er geen geglycosyleerde vorm van het eiwit meer aangemaakt worden [20,21].
(ii) in vitro differentiatie van Ac45RP in muizen neuroblastoma N2a cellen door middel van incubatie met dbcAMP. Hiervan is bekend dat N2a cellen na toevoeging van Dibutyryl Cyclic Adenosine Monophosphate (dbcAMP) differentiëren in dopamine neuronen (24). De expressie van het mRNA wordt hierin bepaald door middel van een qPCR.
(iii) in vitro onderexpressie van Ac45RP in muizen neuroblastoma N2a cellen door middel van RNA interferentie en het effect hiervan op neurale uitgroei te bestuderen. Bij RNAi wordt de transcriptie selectief geblokkeerd door het messenger RNA (mRNA) te induceren met kleine fragmenten short hairpin RNA’s (shRNA). Er wordt een expressie vector met een sequentie coderend voor een ‘short hairpin’ RNA in een cel gebracht. Het shRNA wordt verwerkt door de dicer waar door er siRNA ontstaat. Dit wordt vervolgens door het RISC complex enkelstrengs gemaakt en zal hechten aan het mRNA van het Ac45RP-eiwit die ook via een expressie vector de cel in is gebracht. Hierdoor wordt het mRNA afgebroken en zal er een lage expressie van het Ac45RP-eiwit ontstaan [9,11,12,13].
(iv) in vivo en live-cell imaging experimenten van fluorescent-gekoppeld Ac45RP-eiwit in N2a cellen om het proces van neuronale uitgroei te volgen. Om meer inzicht te krijgen in de functie van het Ac45RP-eiwit worden de bewegingen van de blaasjes gevisualiseerd in levende cellen. Er wordt hierbij een construct gebruikt dat bestaat uit Dendra2 en het Ac45RP-eiwit dat wordt ingebracht in muizen N2a cellen. Dendra2 is een fluorescerend eiwit dat wanneer met blauw licht bestraald van groen naar rood kleurt. Wanneer de blaasjes aangestraald worden kan het Ac45RP-eiwit gevisualiseerd worden [17].
(v) in situ hybridisaties in ontwikkelende muizenbreintjes om de Ac45RP-expresserende cellen te identificeren.
In situ hybridisatie is een techniek waarbij een deel van een chromosoom gevisualiseerd kan worden. In deze
techniek wordt er gebruik gemaakt van een probe met een sequentie die complementair is aan het target van interesse (Ac45RP). Deze probe is Digoxigenine-UTP (DIG) gelabeld. Op deze DIG-gelabelde probe hecht vervolgens een anti-DIG antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase. Door een substraat toe te voegen wat reageert met de alkalische fosfatase zal er een bruine kleurreactie ontstaan. Hierdoor kan worden geïdentificeerd waar in het muizenbrein het Ac45RP mRNA tot expressie komt [14,15].
14
Hoofdstuk 2: Materiaal en Methode
2.1
C
ELLEN
Neuronale muizencellen afkomstig uit de hersenen (Neuro-2a cellen) werden in kweek gehouden in T75 flessen met MEM medium(PAA) met glutamine aangevuld met antibiotica, pyruvaat en 10% FCS bij 37°C onder 5% CO2.
Voor het maken van stabiele cellijnen werden de cellen behandeld met 600µg/ml Neomicine. Bij differentiatie van N2a cellen werden de cellen 3 uur geincubeerd met 1mM Dibutyryl Cyclic Adenosine Monophosphate (dbcAMP) in MEM medium met 0,1% BSA.
2.2.
P
S
UPER
.
NEO
+
GFP
V
ECTOR
Voor de reductie van het Ac45RP mRNA/eiwit werden drie verschillende constructen gemaakt die in de pSuper.neo+GFP vector (zie bijlage I) werden geplaatst tussen de restrictiesites HindIII en BglII. Ac45RP584 en Ac45RP1022 werden de shRNA’s die tegen het mRNA van Ac45RP gericht zijn. En Mmscrambled werd de ‘scrambled’ nucleotide controle. De gebruikte nucleotidesequenties van de verschillende constructen waren: Ac45RP584_S: 5’-GATCCCCCGCGTCGAGATAATCTTCATTCAAGAGATGAAGATTATCTCGACGCGTTTTTA-3’, Ac45RP584_AS: 5’AGCTTAAAAACGCGTCGAGATAATCTTCATCTCTTGAATGAAGATTATCTCGACGCGGGG-3’ Ac45RP1022_S: 5’- GATCCCCGCCGAATGCTATGAGCTAATTCAAGAGATTAGCTCATAGCATTCGGCTTTTTA-3’ Ac45RP1022_AS: 5’-AGCTTAAAAAGCCGAATGCTATGAGCTAATCTCTTGAATTAGCTCATAGCATTCGGCGGG-3’ MmScrambled_S1 1022: 5’-GATCCCCGCATAGGACTCGATTACGATTCAAGAGATCGTAATCGAGTCCTATGCTTTTTA-3’ MmScrambled_AS1: 5’AGCTTAAAAAGCATAGGACTCGATTACGATCTCTTGAATCGTAATCGAGTCCTATGCGGG-3’
2.2
T
RANSFECTIE VAN CELLEN
Een dag voor transfectie werden N2a cellen 5x104 cellen/well uitgezet op een 24 wells plaat in MEM medium (PAA) met glutamine aangevuld met antibiotica, pyruvaat en 10% FCS. De cellen werden getransfecteerd met shRNA5 (Ac45RP584, Stock: 2.21µg/µl), shRNA6 (Ac45RP1022, Stock: 1.76µg/µl) en shRNA7 (MmScrambled_S1, Stock: 2.04µg/µl) met de Lipofectamine LTX (Invitrogen)kit volgens de methode van de fabrikant met gebruik van 1µg DNA, 4µl Lipofectamine en 2µl Plus reagens. Na 5 uur werd het medium ververst en de 3de dag na transfectie werden de cellen verder behandeld.
2.3
D
E REMMING VAN DE
A
C
45RP
N-
GLYCOSYLATIE IN
N2
A CELLEN MET
BEHULP VAN TUNICAMICINE
N2a cellen werden 5x104 cellen/well uitgezet op een 24 wells plaat in MEM medium(PAA) met glutamine aangevuld met antibiotica, pyruvaat en 10% FCS. Na 5-6 uur werden de cellen behandeld met 0-10-25 µM tunicamicine (stock 10 mg/ml) voor het remmen van de n-glycanen. Dit werd overnacht geincubeerd bij 37°C in een 5% CO2 stoof. De volgende dag werd het medium afgenomen en gecentrifugeerd voor 5 min (780-850rpm),
ondertussen werden de cellen van de bodem geschraapt en opgelost in 0,5 ml PBS. De celpellet en de cellen in PBS werden samengevoegd en gelyseerd in homogenisatie oplossing (0.32 M sucrose, 10 mM HEPES pH 7.4, 2 mM EDTA, protease inhibitoren). Na deze oplossing 3x 50 maal te hebben gepotterd werd de potter afgespoeld met homogenisatie oplossing en gecentrifugeerd voor 15 min bij 1000xg (4°C) om de kernen te verwijderen.
15
2.4
SDS-PAGE
Nadat de cellen gelyseerd waren werden de eiwitten gescheiden op een SDS-PAGE. De eiwitextracten werden opgenomen in een 4x loading sample buffer (Stock: 0.25 M Tris-HCL pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 1% Bromophenolblue. Werkoplossing: 960µl stock + 40µl β-mercapto ethanol). Om de eiwitextracten te denatureren werd er 3 min geincubeerd bij 100°C. Na denaturatie werden de eiwitextracten gescheiden op een 10% SDS-PAGE gel (Running gel: 1.5M Tris/HCL pH 8.8, 40% Acrylamide, 10% SDS, 10% APS en Temed, Stacking gel: 1.5M Tris/HCL pH 6.8, 40% Acrylamide, 10% SDS, 10% APS en Temed ) bij 100V voor 1-2 uur.
2.5
W
ESTERN
B
LOTTING
De gescheiden eiwitten na SDS-PAGE werden overgebracht naar een Polyvinylidene Fluoride membraan (PVDF, Amersham Biosciences). Nadat de eiwitten waren overgebracht werd het membraan geblokt in een blokbuffer (1x PBS, 5% Melkpoeder, Campina) voor 1 uur en daarna overnacht bij 4°C geincubeerd met een gezuiverd konijn anti-Ac45RP antilichaam (1:500). De volgende morgen werd het membraan gewassen (1xPBS, 1% Melkpoeder,Campina) en geincubeerd met het 2de peroxidase geconjugeerde geit-anti-konijn antilichaam (1:5000) gevolgd door een chemoluminescentie detectie (LumiLight Plus, Roche). De signalen werden gedetecteerd bij gebruik van een Epi Chemi II Darkroom met een software van Labworks 4.0 (UVP Bioimaging systems, Cambridge, UK). Ter controle werd er gebruik gemaakt van een 1ste muis-anti Tubuline antilichaam (1:1500) met een 2de peroxidase geconjugeerde geit-anti-muis antilichaam (1:5000). De controle en het Ac45RP extract werden apart van elkaar gedetecteerd. Bij gebruik van de detectiemethode met behulp van de Odyssey (Westburg, Leusden, The Netherlands) met de Odyssey 2.0 software werd er geincubeerd met een ander 2de antilichaam namelijk voor Ac45RP het geit-anti-konijn IRDye 800CW antilichaam (1:15000) en voor Tubiline het geit-anti-muis IRdye680 (1:15000).
2.6
RNA-I
SOLATIE
Na transfectie van N2a cellen werd het RNA geïsoleerd middels een TriReagent (Sigma Aldrich). De N2a cellen werden gelyseerd in TriReagent voor ≈25 minuten bij 4°C gevolgd door een incubatie van 5 minuten bij kamertemperatuur (KT). Na de incubatie periode werd chloroform toegevoegd om het RNA te scheiden van de eiwitten. Na een centrifuge stap van 15min (12000rpm, 4°C) kon de waterige fase met het RNA overgebracht worden naar een nieuw epje. Voor de precipitatie van het RNA werd vervolgens 20µg Glycogeen (Fermentas, Stock: 20mg/ml) en Isopropyl alcohol toegevoegd gevolgd door een incubatie van 10 min bij KT en een centrifuge stap van 10 min (12000rpm, 4°C). Het pellet met het RNA werd 2x gewassen door middel van 75% EtOH (Centrifuge: 5min bij 4°C, 75000 rpm). Na het wassen werd de pellet opgelost in 20 µl MilliQ en gereconstitueerd voor 10 min bij 55°C.
2.7
C
DNA
Voor het synthetiseren van cDNA werd eerst de eventuele aanwezigheid van genomisch DNA afgebroken door middel van een DNAse behandeling. Er werd een bufferoplossing gemaakt van 1µg RNA, 5x fosfaat buffer saline (PBS), RNAsin (Stock: 20U/µl) voor de reductie van RNAses en DNase (Stock: 1U/µl) voor de afbraak van DNA. Dit werd geincubeerd bij 37°C voor 30 min en vervolgens 5 min bij 75°C voor de inactivatie van DNase. Na de DNase behandeling konden de monsters worden gebruikt voor de reverse-transcriptase reactie (RT-reactie). Het behandelde RNA werd samen met 5x FBS, RNAsin (40 U/µL), M-MuLV Rtase (200 U/µL), random hexamer primer (0.2 µg/uL) en dNTP's (10mM) geincubeerd voor 10 min bij 25°C (annealling), 60 min bij 42°C (activatie enzym) en 5 min bij 75°C (inactivatie van het enzym). Naast de monsters werd er gebruik gemaakt van een controle waarbij er geen reverse-transcriptase enzym in de reactie werd meegenomen (-RT reactie).
16
2.8
Q
UANTITATIVE
P
OLYMERASE
C
HAIN
R
EACTION
(
Q
PCR)
Het gesynthetiseerde cDNA werd gebruikt bij de analyse van de kwantitatieve PCR (qPCR). De cDNA stock werd verdund (1:7,5) en werd gebruikt in een 10 µl reactiemix met gebruik van Sensifast SYBR No-Rox mix (Bioline) en de Rotor-Gene Q (Corbett Research, Sydney, Australië) met behulp van de Rotor-gene Q series software 1.7. Voor de amplificatie van Ac45RP werden de primers MmAc45RP-1PCR-FW1 (5’-ACTTACTCCTACCGCTGCCAAC-3’) en MmAc45RP-RV-4 (5’- CCGGTGAGAAGGAAGAGCTG-(5’-ACTTACTCCTACCGCTGCCAAC-3’) gebruikt. Als referentie werd er gebruik gemaakt van de genen peptidylprolyl isomerase A (mPPia) en Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide (Y-WHAZ) met de primers rYwhaz-rq.fw (5’-TTGAGCAGAAGACGGAAGGT-3’), rYwhaz-rq.rv (5’-GAAGCATTGGGGATCAAGAA-(5’-TTGAGCAGAAGACGGAAGGT-3’), mPpia_461FW (5’- AGCCATGGAGCGTTTTGGGTCC-3’) en mPpia_614RV (5’- AGCAGATGGGGTAGGGACGCT-3’). De resultaten werden met behulp van het programma geNorm geanalyseerd.
2.9
I
MMUNOHISTOCHEMIE
N2a cellen werden uitgezet op glaasjes 5x104 cellen/well. De volgende morgen werden de cellen 3x gewassen met PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyde/PBS voor 1uur op kamertemperatuur (KT). Vervolgens werden de cellen 3x5min gewassen met PBS/50mM NH4Cl en gepermealiseerd met PBS/0.1% TritonX100 (PBS-T).
Hierna werden de cellen overnacht geincubeerd met het 1ste konijn-anti-Ac45RP antilichaam (1:500) in blokbuffer (PBS-T/1% BSA) bij 4°C. Na de N2a cellen de volgende morgen te hebben gewassen in PBS-T werd het 2de geit-anti-konijn antilichaam (1:200) Alexa488 in blokbuffer voor 1 uur bij KT geincubeerd. Na de incubatie met het 2de antilichaam werden de glaasjes gewassen met PBS-T, 1x PBS en MilliQ. Na het wassen werd er gedehydrateerd in methanol voor 5 min. Na de dehydratatie werden de cellen gedroogd en ingesloten in Mowiol met 2.5µM DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) om de kernen te visualiseren. De immunofluorescentie werd bekeken onder de Olympus FV1000 confocale laser scanner microscoop.
2.10
D
IGOXIGENIN
(DIG)
GELABELDE
RNA
PROBES VOOR IN SITU HYBRIDISATIE
Om de sense en anti-sense RNA probes te ontwikkelen voor Ac45 en Ac45RP werden er fragmenten ( Ac45: 253 bp, Ac45RP: 235 bp) gekloneerd in een pJet1.2 vector (Bijlage IV). 10µg van de verschillende vectoren werd gelineariseerd met ClaI voor Ac45 en met XBaI voor Ac45RP. Een fenol-chloroform precipitatie werd uitgevoerd om het gelineariseerde product te isoleren uit de oplossing. Dit werd naar een concentratie gebracht van 0.5 µg/µl. 1 µg van het gelineariseerde plasmide werd gebruikt voor de synthese van Digoxigenin (DIG) gelabelde RNA probes met gebruik van een DIG-RNA labelings mix (Roche Diagnostics), T7 RNA polymerase (Fermentas Life Sciences), RNase inhibitor (Fermentas Life Sciences, Ribolock 40U/µl) en een 5x transcriptiebuffer. Deze mix werd ≈2 uur geincubeerd bij 37°C waarna er 1U DNase (Fermentas Life Sciences, 1U/μl) werd toegevoegd. Dit werd 15min bij 37°C geincubeerd. Het RNA werd vervolgens gezuiverd door middel van een lithium chloride (0.16mM) precipitatie en werd opgelost in 10 μl Nuclease vrij water (Ambion).
2.11
K
WANTIFICERING VAN
DIG-
GELABELDE
RNA
PROBES D
.
M
.
V
.
SPOTBLOT
Om een schatting van de concentratie van de DIG-gelabelde probes te maken werd er een spotblot uitgevoerd. Van de DIG-gelabelde RNA probes werd een verdunningsreeks ingezet en als referentie werd een concentratiereeks gemaakt van DIG-gelabeld control RNA (Roche Diagnostics, 100ng/μl) met als startconcentratie van 20ng/μl. De verdunningen werden op een nitrocellulose membraan (Schleicher & Schuell) gepipetteerd en met behulp van een UV crosslinker (StrataLinker UV Crosslinker, Stratagene, San Diego, CA) op het membraan gebonden. Het membraan werd gewassen in TBS (1M Tris, 1.5M NaCl) en geincubeerd blokbuffer voor 30min (1x TBS, 2% Normal Goat Serum (NGS), 1% Bovine Serum Albumine (BSA). Vervolgens werd het membraan overnacht bij 4 °C geincubeerd met anti-DIG-Alkaline Phospatase-geconjugeerde Fab fragmenten (1:5000 in blokbuffer). De volgende dag werd het membraan 2x 15 min
17
gewassen in TBS en vond er een pre-incubatie plaats van 2min in AP-Buffer (1M Tris/HCl, 5M NaCl, 1M MgCl2, pH: 9.5). De blot werd gekleurd met gebruik van NBT/BCIP substraat (Roche Diagnostics, 160μl) in AP-Buffer
(20ml). De kleurreactie werd gestopt met behulp van MilliQ.
2.12
I
N SITU HYBRIDISATIE
Een muizenbrein (p22) werd in sagittale coupes gesneden van 16μm en op Superfrost Plus (Menzel Gläser) objectglaasjes gebracht en bewaard bij -80°C. De coupes werden voor de in situ hybridisatie gedroogd bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de coupes 30 min gefixeerd in 4% paraformaldehyde in 0.1M Borax pH 9.5. Na fixatie werden de coupes 2x5min gewassen in PBS, gepermealiseerd in 1x8min 0.2M HCL, gewassen 2x5min in PBS, 1x1min met DEPC H2O en 1x1 min in 0.1M TEA pH 8.0. De acetyleringsreactie werd uitgevoerd
in 0.1M TEA pH 8 + 0.25% azijnzuur anhydride voor 10min en vervolgens werd er weer 1x5 min gewassen in 2xSSC (20x stock: NaCl, triNacitrate, pH). De coupes werden bedekt met 100μl Hybridisatie mix (Hybridisatie buffer (5M NaCl, deionized formamide, 0.5M EDTA pH 8, 1M TRIS pH 8, 50x Denhardt’s oplossing, Dextran sulfate 50%), tRNA (10mg/ml) , DIG-gelabelde probe (200ng en 400ng), DEPC H2O). Na een incubatie bij 58°C
overnacht werden de coupes gewassen 2xSSC waarna er een RNAaseA behandeling plaatsvond bij 37°C voor 30 min. Daarna werd er weer gewassen met 2xSSC, 1xSSC, 0,5xSSX en vervolgens 30min in 0,1xSSC bij 58°C Na dit half uur konden de coupes gekleurd worden dit door middel van 2x5min te wassen in Buffer A (1M Tris/HCL, 5M NaCl, pH 7.5), blokken voor 60min in Buffer A + 0.5 % Blocking reagent (Roche Diagnostics) en een 3 uurs incubatie met anti-DIG-Alkaline Phospatase-geconjugeerde Fab fragmenten (1:5000 in Buffer A + 0.5% blocking reagent). Na incubatie met het antilichaam werd er weer gewassen in Buffer A en Buffer B (1M Tris/HCL, 5M NaCl, 1M MgCl2, pH 9.5). De coupes werden vervolgens overnacht gekleurd met NBT/BCIP substraat (Roche
Diagnostics in Buffer B met Levamisole) bij kamertemperatuur. De volgende dag werd de kleurreactie gestopt door middel van Buffer C (1M Tris/HCL, 0.5M EDTA, pH 8.0) en van water ontrokken door middel van een serie Ethanol concentraties (50%-70%-80%-90%-96%), isopropanol, aceton en xylene. De coupes werden vervolgens in gesloten met Entellan en bekeken onder de Leica DM 6000 B microscoop met de software IM500. De optimale hybridisatietemperatuur voor de RNA probes werd berekend aan de hand van de volgende berekening (zie bijlage IV voor de sequentie van beide probes):
18,5*LOG(Natrium conc. (0.311 mol/l)) + 0,584*(G%+C%) + 79,8 + (0,0012*(%G+%C)^2- 0,35*(%Formaldehyde= 51.37)
18
Hoofdstuk 3: Resultaten
3.1
R
EMMING VAN DE
N-
GLYCOSYLERING VAN
A
C
45RP
IN
N2
A CELLEN DOOR
MIDDEL VAN TUNICAMYCINE
Om te bepalen welke geglycosyleerde vormen van Ac45RP in N2a cellen aanwezig zijn werd er met behulp van tunicamycine de N-glycosylering van het endogene Ac45RP-eiwit geremd. In dit experiment werden in N2a cellen behandeld met 0 µM, 10 µM en 25 µM tunicamycine. Western blot analyse van de behandelde cellen toonde verschillende geglycosyleerde vormen van het Ac45RP-eiwit in N2a cellen aan (figuur 7). Na een incubatie van 0 µM tunicamycine (laan 1/2: duplo) werden er drie verschillende molmassa’s van het Ac45RP-eiwit zichtbaar namelijk 35, 50 en 80 kDa. Na toevoeging van 10 µM (laan 3/4: duplo) en 25 µM (laan 5/6: duplo) tunicamycine werd een reductie van het 50 kDa en 80 kDa Ac45RP-eiwit aangetoond maar niet van de 35-kDa vorm. Uit deze experimenten bleek dat er twee geglycosyleerde vormen zijn van Ac45RP (50 kDa en 80 kDa) en dat het de ongeglycosyleerde vorm van Ac45RP een molmassa van ongeveer 35 kDa heeft.
0
µM
10 µM
25 µM
80kDa
50kDa
35kDa
55kDa
Tunicamycine
1
2
3
4
5
6
FIGUUR 7: REMMING VAN AC45RP N-GLYCOSYLATIE IN N2A CELLEN M.B.V. TUNICAMYCINE. BIJ EEN INCUBATIE VAN 0 µM
TUNICAMYCINE WERDEN DRIE EIWITTEN MET VERSCHILLENDE MOLMASSA’S VAN 35-50 EN 80 KDA ZICHTBAAR (LAAN 1/2). DE N2A CELLEN BEHANDELD MET 10 µM (LAAN 3/4) EN 25 µM (LAAN 5/6) LATEN EEN REDUCTIE ZIEN VAN HET 50 KDA EN 80 KDA EIWIT. TER CONTROLE VAN HET EXPERIMENT WERD ER GEBRUIK GEMAAKT VAN EEN TUBULINE ANTILICHAAM WELKE EEN MOLMASSA HEEFT VAN ONGEVEER 55 KDA.
19
Naast de deglycosylering op eiwit niveau is ook bepaald op welke locatie in de cel de niet geglycosyleerde eiwitten zich verzamelen na behandeling met 0 µM en 10µM tunicamycine. Na incubatie met tunicamycine werd een immunokleuring met anti-Ac45RP antilichamen uitgevoerd. De N2a cellen werden geanalyseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (figuur 8). Hierbij werd zichtbaar dat Ac45RP na behandeling van 10 µM tunicamycine zich mogelijk meer ophoopt in een gebiedje dicht tegen de kern, mogelijk het ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC). Dit is echter niet met zekerheid vast te stellen omdat hiervoor geen marker is gebruikt.
FIGUUR 8: LOCALISATIE VAN AC45RP NA BEHANDELING MET TUNICAMYCINE IN N2A CELLEN. N2A CELLEN ZIJN 24 UUR GEINCUBEERD
MET 0 µM EN 10 µM TUNICAMYCINE. AC45RP LICHT GROEN GEKLEURD OP DOOR HET 2DE ANTILICHAAM GEIT-ANTI-KONIJN ALEXA488. DE CELKERNEN ZJIN DOOR MIDDEL VAN DAPI KLEURING BLAUW.
20
3.2
D
E
A
C
45RP
M
RNA
EXPRESSIE IN
N2
A CELLEN TIJDENS DIFFERENTIATIE
MET DBC
AMP
Vervolgens werd onderzocht of de expressie van Ac45RP mRNA tijdens differentiatie van N2a cellen veranderd. Eerder onderzoek toonde aan dat de expressie niet veranderde na differentiatie door middel van serum deprivatie [26]. In dit experiment werd er gebruik gemaakt van dbcAMP welke de N2a cellen differentieert naar dopamine achtige neuronen [23]. De differentiatie van de N2a cellen werd gestart op tijdstip 0 met toevoeging van 1mM dbcAMP. De N2a cellen werden geoogst op tijdstip t=0, 4 uur en 24 uur. Vervolgens werd de Ac45RP mRNA expressie bepaald met behulp van de qPCR waarbij er genormaliseerd werd tegen de twee huishoudgenen Y-WHAZ en mPPia. De experimenten werden in drievoud uitgevoerd (zie figuur 9). De mRNA expressie tussen de drie tijdstippen (0-4 en 24 uur) zijn niet significant verschillend.
FIGUUR 9: AC45RP MRNA EXPRESSIE NA DIFFERENTIATIE VAN T= 0, 4 EN 24 UUR IN N2A CELLEN. DE AC45RP MRNA EXPRESSIE VAN
TIJDSTIPPEN 0, 4 EN 24 UUR IS GENORMALISEERD TEGEN DE HUISHOUDGENEN Y-WHAZ EN MPPIA. DE RESULTATEN ZIJN ONDERLING VERGELEKEN EN ZIJN NIET SIGNIFICANT VERSCHILLEND.
0 uur
4 uur
24 uur
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Tijd (uur), n=3
N
o
rm
a
li
z
e
d
e
x
p
re
s
s
io
n
(Q
/N
o
rm
F
)
NS NS21
3.3
D
E REDUCTIE VAN DE
A
C
45RP
M
RNA
EN EIWIT IN
N2
A CELLEN
Overexpressie van Ac45RP leidde tot een toename in neurale uitgroei bij N2a cellen [2]. Als toevoeging op deze studie werd onderzocht of door middel van een transiënte transfectie een onderexpressie van Ac45RP kon worden verkregen en of dit neurale uitgroei beïnvloedt. De N2a cellen werden getransfecteerd in zesvoud met shRNA584, shRNA1022 of de ‘Scrambled’ (scrambled_s1) nucleotide controle. Hierbij zorgen shRNA584 en shRNA1022 voor een reductie van Ac45RP. In de transiënte transfectie van de N2a cellen m.b.v. de Lipofectamine LTX kit werd een transfectie efficiëntie van ≈80% verkregen (zie figuur 10 als voorbeeld). Na transfectie werd de Ac45RP mRNA expressie bepaald m.b.v. qPCR (Figuur 11).
Scrambled_S1
FIGUUR 10: N2A CELLEN GETRANSFECTEERD MET DE ‘SCRAMBLED’ (SCRAMBLED_S1) NUCLEOTIDE CONTROLE IN DE PSUPER.NEO+GFP VECTOR. CELKERNEN ZIJN BLAUW GEKLEURD DOOR MIDDEL VAN DAPI EN DE GFP-GETRANSFECTEERDE CELLEN ZIJN GROEN GEKLEURD.
shRNA 584
shRNA 1022 Scrambled_s1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
shRNA getransfecteerde N2A cellen
n = 6
G
e
n
o
rm
a
li
s
e
e
rd
e
e
x
p
re
s
s
ie
(Q
/N
o
rm
F
)
* * * * * *FIGUUR 11: REDUCTIE VAN AC45RP IN N2A CELLEN MET SHRNA584 EN SHRNA1022. QPCR ANALYSE VAN AC45RP MRNA EXPRESSIE IN
N2A CELLEN NA TRANSIËNTE TRANSFECTIE MET SHRNA 584, SHRNA1022 EN SHRNA_S1 (N=6). Y-WHAZ EN MPPIA ZIJN HIERBIJ GEBRUIKT ALS REFERENTIE GENEN.
Na qPCR analyse van de Ac45RP mRNA expressie werd een ≈75% reductie in de transiënt getransfecteerde N2a cellen met shRNA584 en shRNA1022 verkregen t.o.v. de scrambled_s1 controle (figuur 11).
Naast de expressie op mRNA niveau werd de eiwitexpressie van Ac45RP in N2a cellen na reductie onderzocht door middel van een western blot analyse. De resultaten van de western blot worden weergegeven in figuur 12. Een tubuline (55kDa) antilichaam werd hierbij gebruikt ter controle van de eiwit-input.
22
80 kDa
50 kDa
35 kDa
55 kDa
shRNA584
shRNA1022
shRNA_S1 control
1 2 3 1 2 3 1 2 3
FIGUUR 12: DE REDUCTIE VAN HET AC45RP EIWIT IN N2A CELLEN MET SHRNA584 EN SHRNA1022. EEN WESTERN BLOT ANALYSE (TRIPLO)
WAARBIJ DE DRIE GEGLYCOSYLEERDE VORMEN VAN AC45RP AANWEZIG ZIJN (80 – 50 – 35 KDA). EEN LICHTE AFNAME VAN HET 80KDA EIWIT ZICHTBAAR BIJ SHRNA584 EN SHRNA1022.
In de scrambled_s1 controle werden de drie verschillende geglycosyleerde vormen (35, 50 en 80 kDa) zichtbaar. Bij shRNA584 en shRNA1022 leek er een lichte afname van de geglycosyleerde vorm van 80kDa maar was niet in drievoud terug te vinden voor shRNA1022. Ook kon deze analyse niet worden gereproduceerd waardoor deze meting niet als betrouwbaar werd beschouwd. Uit dit onderzoek kan geconcludeerd worden dat de shRNA584 en shRNA1022 het Ac45RP mRNA reduceert in N2a cellen. Op eiwitniveau kan dit echter nog niet worden vastgesteld.
3.3.1.
D
IFFERENTIATIE VAN
N2
A CELLEN NA REDUCTIE VAN
A
C
45RP
MET BEHULP VAN
SH
RNA
Het uiteindelijke doel van deze studie was om N2a cellen te differentiëren waarin de expressie van Ac45RP gereduceerd werd. De verwachting hierbij was dat er een afname in neurale uitgroei zou plaatsvinden wanneer dit vergeleken werd met een controle. In dit onderzoek werden er zoals in de eerdere studies drie verschillende shRNA’s transiënt getransfecteerd in N2a cellen. Na differentiatie met dbcAMP werden de cellen gekleurd met een tubuline antilichaam. In figuur 13 zijn de resultaten van de immunofluorescentie zichtbaar waarbij tubuline rood kleurt. De getransfecteerde cellen kleuren groen door GFP aan te stralen en de kernen kleuren door de DAPI kleuring blauw.
23
shRN 584
A
shRNA1022
Scrambled controle
FIGUUR 13: GEDIFFERENTIEERDE N2A CELLEN NA REDUCTIE VAN AC45RP MET SHRN584 EN SHRNA1022. IN DE AFBEELDINGEN ZIJN DE
GEDIFFERENTIEERDE N2A CELLEN ZICHTBAAR WAARVAN AC45RP GEREDUCEERD DOOR MIDDEL VAN SHRNA584 EN SHRNA1022. DE NEGATIEVE CONTROLE DIE HIERVOOR IS MEEGENOMEN IS DE ‘SCRAMBLED’ NULEOTIDE CONTROLE. DE KLEURING DIE ZIJN GEBRUIKT ZIJN IN ROOD TUBULINE, DE GROENE KLEUR (GFP) GEEFT DE POSITIEF GETRANSFECTEERDE CELLEN WEER EN DE BLAUWE KERNKLEURING IS DAPI.
Na differentiatie van de N2a cellen werd er nog geen duidelijk reductie in neurale uitgroei bij shRNA584 en shRNA1022 zichtbaar t.o.v. de ‘scrambled’ nucleotide controle. Een mogelijk lichte reductie in de lengte van de uitlopers leek zichtbaar maar dit is nog niet met zekerheid vastgesteld. Uit dit onderzoek kan geconcludeerd worden dat er in dit stadium nog geen vermindering in neurale uitgroei is na reductie van Ac45RP.
24
3.3.2.
D
E REDUCTIE VAN
A
C
45RP
M
RNA
IN STABIELE SH
RNA
CELLIJNEN
Om een langdurige expressiereductie van het stabiele Ac45RP-eiwit te verkrijgen werd er na een transiënte transfectie geprobeerd om stabiele shRNA cellijnen te maken door middel van neomicineselectie. Uit een selectie van 5 tot 8 klonen van elke shRNA (shRNA584, shRNA1022, scrambled controle) werden de meest fluorescerende klonen in duplo uitgezet om daarvan de mRNA expressie te bepalen door middel van een qPCR (zie figuur 14). 1 3 4 3 6 7 3 5 6 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Ac45RP/Scrambled contole
Ac45RP/shRNA1022
Ac45RP/shRNA584
shRNA klonen, n=2
G
e
n
o
rm
a
li
s
e
e
rd
e
e
x
p
re
s
s
ie
(Q
/N
o
rm
F
)
FIGUUR 14: DE GENORMALISEERDE EXPRESSIE VAN AC45RP IN DE VERSCHILLENDE STABIELE SHRNA KLONEN. DE MRNA EXPRESSIE VAN
SHRNA584 MET DE KLOONNUMMERS 1,3 EN 4. DE GESELECTEERDE KLONEN VOOR SHRNA1022 ZIJN 3,6,7 EN VOOR DE SCRAMBLED CONTROLE ZIJN DE KLOONNUMMERS 3,5 EN 6. HIERBIJ IS HET GEMIDDELDE GENOMEN VAN DE IN DUPLO UITGEZETTEN KLONEN. De qPCR analyse van de genormaliseerde expressie van Ac45RP liet een duidelijke verlaging in de shRNA584 en shRNA1022 zien. Kloon 3 van shRNA584, kloon 3 van shRNA1022 en kloon 7 van de scrambled controle leken een vergelijkend resultaat weer te geven als in de transiënte transfectie (zie figuur 11). Uit dit onderzoek kan geconcludeerd worden dat er in de stabiele cellijnen een reductie wordt gevonden van Ac45RP in shRNA584 en shRNA1022 t.o.v. de ‘scrambled’ nucleotide controle.
25
3.4
H
ET PROCES VAN HET
A
C
45RP-
EIWIT IN NEURALE UITGROEI VAN
N2
A
CELLEN
Om meer inzicht te krijgen in de functie van het Ac45RP-eiwit werd er in dit experiment geprobeerd de bewegingen van de blaasjes te visualiseren in levende cellen door middel van live cell imaging. Hierbij werden er twee verschillende vectoren getransfecteerd waaruit een eiwit gemaakt wordt dat bestaat uit Ac45RP waarbij Dendra2 gekloneerd is tussen de signaalpeptide en de N-Terminus (zie bijlage II) en Ac45RP waarbij Dendra2 aan de C-Terminus gekloneerd is (zie bijlage III). Deze twee vectoren werden in muizen N2a cellen gebracht en door middel van neomicine werden er zes verschillende stabiel getransfecteerde pools gemaakt. De meest fluorescent stabiel getransfecteerde N2a cellen met het N-terminale construct (Dendra2-Ac45RP) en de C-terminale construct (Ac45RP-Dendra2) werden na fixatie zichtbaar gemaakt door middel van dendra2-fluorescentie (zie in figuur 15).
Dendra2-Ac45RP
Ac45RP-Dendra2
FIGUUR 15: STABIELE N2A CELLEN GEFUSEERD MET DENDRA2-AC45RP (LINKS) EN AC45RP-DENDRA2 (RECHTS). DEZE CELLEN ZIJN
ZICHTBAAR GEMAAKT DOOR MIDDEL VAN EEN IMMUNOFLUORESCENTIE.
De lokalisering van Ac45RP was duidelijk anders in Dendra2-Ac45RP dan in Ac45RP-Dendra2. Mogelijk zit in de C-terminus van Ac45RP een signaal voor route informatie, zoals dat het geval is voor Ac45 [24], welke door de fusie met Dendra2 geblokkeerd werd en waardoor Ac45RP zich in het plasmamembraan lokaliseert. Vervolgens werden de stabiel getransfecteerde N2a cellen onder een confocale microscoop bekeken voor live cell imaging, echter bleek het Dendra2-signaal te zwak.
26
3.5
D
E LOKALISATIE VAN
A
C
45RP-
EXPRESSERENDE CELLEN IN HET
MUIZENBREIN
Om de locatie van Ac45RP-expresserende cellen in een ontwikkelend muizenbrein te kunnen identificeren werden in situ hybridisaties uitgevoerd. Ac45 waarvan bekend is dat deze in verschillende regio’s in het muizenbrein aanwezig is [2] werd gebruikt als positieve controle. De coupes van een sagittaal gesneden p22 muizenbrein werden gehybridiseerd met Ac45 sense en anti-sense en Ac45RP sense en anti-sense probes. Van deze probes werd de concentratie bepaald door middel van een spot blot (zie figuur 16). Hierbij was de eerste spot van elke probe (links) een 5x verdunning van de stockoplossing. In figuur 17 wordt vervolgens een overzicht weergegeven van de Ac45 antisense gekleurde coupe (200ng/μl). Daarna worden de verschillende vergrote (50x) regio’s van het muizenbrein weergegeven in figuur 18 voor Ac45 en in figuur 19 voor Ac45RP.
Ac45-AS Ac45-S Ac45RP-AS Ac45RP-S Controle 20 ng/µl 10 ng/µl 5 ng/µl 2,5 ng/µl 1,25 ng/µl
FIGUUR 16: SPOTBLOT VAN AC45 SENSE EN ANTI-SENSE EN VAN AC45RP SENSE EN ANTI-SENSE. DE CONCENTRATIES ZIJN BEPAALD DOOR
MIDDEL VAN EEN DIG GELABELDE CONTROLE WAARBIJ EEN CONCENTRATIEREEKS IS GEMAAKT AFLOPEND VAN 20NG/µL - 1.25NG/µL. Van de Ac45 sense probe werd een concentratie vastgesteld van 400ng/μl en voor de anti-sense probe een concentratie van 200ng/μl. De Ac45RP sense probe toonde een concentratie van 100ng/μl en de anti-sense probe werd een hoge concentratie vastgesteld van 6400 ng/μl. Er vanuit gaande dat deze concentraties juist waren werden de in situ hybridisatie uitgevoerd met probe concentraties van 200 en 400 ng/µl. Alleen de data van de 200ng/µl wordt weergegeven in de figuren 18 en 19. De hybridisaties met 400 ng/µl gaven een vergelijkbaar resultaat.
FIGUUR 17: OVERZICHT VAN SAGITTAAL GESNEDEN MUIZENBREIN GEKLEURD VOOR AC45 MRNA. MUIZENBREIN (P22)
WAARBIJ DE VERSCHILLENDE DELEN VAN HET BREIN ZOALS DE BULBUS OLFACTORIUS, CORTEX, HIPPOCAMPUS, THALAMUS EN CEREBELLUM STERK GEKLEURD ZIJN VOOR AC45 MRNA (200NG/µL).
27
Ac45-AS
Ac45-S
FIGUUR 18: IN SITU HYBRIDISATIE RESULTATEN VAN AC45 ANTI-SENSE (LINKS) EN AC45 SENSE (RECHTS).
DE VERSCHILLENDE REGIO’S IN HET BREIN ZIJN ZICHBAAR ZOALS DE CORTEX (CR), BULBUS OLFACTORIUS (OB), HIPPOCAMPUS (HP), THALAMUS (TL) EN HET CEREBELLUM (CB).
28
Ac45RP-AS
Ac45RP-S
FIGUUR 19: IN SITU HYBRIDISATIE RESULTATEN VAN AC45RP ANTI-SENSE (LINKS) EN AC45RP SENSE (RECHTS). DE
VERSCHILLENDE REGIO’S IN HET BREIN ZIJN ZICHBAAR ZOALS DE CORTEX (CR), BULBUS OLFACTORIUS (OB), HIPPOCAMPUS (HP), THALAMUS (Tl) EN DE CEREBELLUM (CB).
29
Het Ac45 mRNA kwam in het muizenbrein zeer sterk tot expressie in ‘mitral cells’ van de bulbus olfactorius (Ob), in de cortex (Cr), Cerebellum (Cb), hippocampus (Hp, vooral C1 regio) en de Thalamus (Tl). Voor het Ac45RP mRNA werd echter in deze in situ hybridisatie geen signaal gevonden. Uit dit onderzoek kan er geconcludeerd worden dat Ac45 differentieel tot expressie komt in het muizenbrein en dat de in situ hybridisatie voor Ac45RP nog verder moet worden geoptimaliseerd.
30
Hoofdstuk 4: Discussie/Conclusie
4.1.
R
EMMING VAN DE
N-
GLYCOSYLERING VAN
A
C
45RP
IN
N2
A CELLEN DOOR
MIDDEL VAN TUNICAMICINE
Het accessoire V-ATPase subunit Ac45RP is een N-geglycosyleerd eiwit met zeven potentiële N-gekoppelde glycosylerings sites. Uit eerder onderzoek is gebleken dat doormiddel van een N-glycosidase F behandeling er een verandering in moleculemassa van het exogeen Ac45RP-eiwit van ≈80kDa naar ≈36kDa ontstond in Cos-1 cellen. Uit data-analyse van het eiwit blijkt dat dit ≈36kDa fragment zeer waarschijnlijk de ongeglycosyleerde vorm van Ac45RP is [2]. Het endogene Ac45RP in N2a cellen is hierna behandeld met N-glycosidase F echter werd het ≈80kDa eiwit niet gedeglycolyseerd. Na verschillende optimalisaties van de lysisbuffer met gebruik van N-glycosidase F is er voor gekozen om de N-glycosylering geheel te blokkeren met behulp van tunicamycine. Tunicamycine inhibeert de binding van N-acetylglucosamine (GlcNAc)aan dolichol waardoor er geen glycosylering meer plaats kan vinden [20,21]. Een nadeel van het gebruik van tunicamycine is dat het niet alleen de N-glycosylering van Ac45RP-eiwit zal remmen maar ook andere eiwitten die in de cel geglycosyleerd worden. Na Western blot analyse bleek dat er drie verschillende vormen (35kDa – 50kDa – 80kDa) van Ac45RP ontstonden na de toevoeging van 0 µM tunicamicine. Bij toevoeging van 10 en 25 µM tunicamicine waren de 50kDa en 80kDa banden gereduceerd. Dit zou betekenen dat er twee verschillende geglycosyleerde vormen zijn van het Ac45RP-eiwit en dat de band van 35kDa de ongeglycosyleerde vorm is van Ac45RP, wat overeenkomt met de eerdere analyse. Daarnaast kan uit deze resultaten niet geconcludeerd worden of de twee vormen van Ac45RP (50kDa en 80kDa) elk een afzonderlijke functie hebben binnen de cel of dat het 50kDa eiwit wordt opgeslagen in het ER en verder wordt geglycosyleerd wanneer de cel de geglycosyleerde vorm van 80kDa nodig heeft. Er kan gebruik gemaakt worden van Endoglycosidase H (Endo H) om te achterhalen of de 50kDa band werkelijk in het ER blijft. Dit enzym klieft alle structuren voordat alle mannose subunits worden verwijderd in Golgi (bijlage V). Daarna zijn de structuren resistent tegen het enzym. Hierdoor kan er worden achterhaald of het 50kDa Ac45RP-eiwit zich in het ER lokaliseert of dat het al verder verwerkt is en zich al in de Golgi bevindt [25].
Naast de deglycosylering op eiwitniveau van Ac45RP met behulp van tunicamycine werd van de behandelde en onbehandelde N2a cellen ook de locatie onderzocht met behulp van immunofluorecentie. Hieruit bleek dat Ac45RP mogelijk ophoopt rond het ERGIC gebied na behandeling met 10µM tunicamycine. Om vast te stellen in welk gebied Ac45RP nu werkelijk ophoopt zouden er verschillende specifieke markers gebruikt kunnen worden voor onder andere de Golgi, Endoplasmatisch reticulum en ER-Golgi intermediate compartment.
4.2
D
E
A
C
45RP
M
RNA
EXPRESSIE IN
N2
A CELLEN TIJDENS DIFFERENTIATIE
MET DBC
AMP
Eerdere experimenten [26] toonde aan dat het Ac45 mRNA in N2a cellen niet toenam na differentiatie door middel van serumdeprivatie. Later werd bekend dat dbcAMP zorgt voor de differentiatie van N2a cellen in dopamine axonen [23]. Om dit te kunnen vergelijken werden N2a cellen gedifferentieerd met dbcAMP voor t= 0,4,24 uur. Na qPCR analyse bleek dat er geen veranderingen ontstonden in de expressie van Ac45RP op mRNA niveau. Hieruit kan geconcludeerd worden dat er na differentiatie geen extra Ac45RP mRNA wordt aangemaakt en het Ac45RP-eiwit dat al in de cel aanwezig is mogelijk steeds opnieuw wordt gebruikt tijdens differentiatie van N2a cellen.
31
4.3
D
E REDUCTIE VAN DE
A
C
45RP
M
RNA
EN EIWIT IN
N2
A CELLEN
Uit eerder onderzoek bleek dat na overexpressie van het Ac45RP-eiwit in gedifferentieerde N2a cellen er een toename was van neurale uitgroei [2]. Ook toonde onderzoek aan dat het Ac45RP mRNA in relatief hoge hoeveelheden in de bulbus olfactorius in het muizenbrein tot expressie komt. In de bulbus olfactorius zijn veel nieuwgeboren neuroblasten aanwezig die neurale uitgroei ondergaan [2]. De V0-sector van de V-ATPase is
betrokken bij Ca2+-afhankelijk membraanfusie [22]. Hierdoor wordt gedacht dat het Ac45RP-eiwit een belangrijke rol speelt bij de neurale uitgroei en membraantransport naar de groeikegel. Na deze overexpressie van het eiwit werd in dit onderzoek getracht een onderexpressie van Ac45RP te verkrijgen in N2a cellen door middel van RNA interferentie. Een transiënte transfectie met shRNA584 en shRNA1022 in N2a resulteerde in een ~75% reductie van de Ac45RP mRNA expressie t.o.v. de ‘scrambled’ controle. Op eiwitniveau leek er een lichte reductie van de 80kDa band te ontstaan na de transiënte transfectie. Dit zou kunnen betekenen dat dit geglycosyleerde product na een bepaalde tijd wordt afgebroken. Echter kon dit experiment niet meer worden gereproduceerd, mogelijk door de lage transfectie-efficientie tijdens deze experimenten. Het uiteindelijke doel van deze studie was om N2a cellen te differentiëren waarin Ac45RP gereduceerd werd. Nu de expressie op mRNA niveau was gereduceerd werd er een transiënte transfectie uitgevoerd waarbij de cellen met dbcAMP werden gedifferentieerd. De hypothese van dit experiment was dat een reductie in neurale uitgroei zou ontstaan in de cellen getransfecteerd met shRNA584 en shRNA1022 t.o.v. de ‘scrambled’ nucleotide controle. Om dit met meer duidelijkheid vast te stellen moet er nog berekend worden hoeveel getransfecteerde cellen er zijn met/zonder neurale uitgroei. Aan de hand van de microscopische analyse lijkt er nog geen duidelijke reductie van uitgroei zichtbaar maar dit zou ook verklaard kunnen worden door de stabiliteit van het Ac45RP-eiwit. Daarnaast zou dit experiment herhaald kunnen worden in stabiele shRNA cellijnen waarin meer duidelijkheid gegeven kan worden over de reductie van het mRNA en het eiwit. Om dit mogelijk te maken zijn er na de transiënte transfecties stabiele shRNA cellijnen gemaakt zodat alle cellen het shRNA in het genoom hebben opgenomen waardoor elke cel een constante reductie van Ac45RP zou moeten hebben. De Ac45RP mRNA expressie van deze stabiele lijnen resulteerde in een duidelijke reductie van het Ac45RP. Er werden hiervoor verschillende klonen ingezet waaruit kloon 3 van shRNA584 en kloon 3 van shRNA1022 de grootste reductie t.o.v. kloon 5 van de ‘scrambled’ nucleotide controle vertoonden. Deze zouden gebruikt kunnen worden om te bepalen of Ac45RP op eiwitniveau ook gereduceerd is en om te bepalen of er een afname in neurale uitgroei kan worden vastgesteld.
4.4
H
ET PROCES VAN HET
A
C
45RP-
EIWIT IN NEURALE UITGROEI VAN
N2
A
CELLEN
Om de het proces van het Ac45RP-eiwit in neurale uitgroei te volgen werden in eerdere experimenten [27] stabiele YFP-Ac45RP en Ac45RP-YFP klonen gemaakt. Deze klonen zijn bruikbaar om het proces van Ac45RP in neurale uitgroei in ‘real-time’ te volgen. Hier is er echter voor gekozen om Ac45RP-Dendra2 fusies te maken, omdat de kleur van Dendra2 van groen naar rood (photoswitch) omgezet kan worden. Hierdoor kan een pool aan blaasjes worden gemerkt en kan het proces van Ac45RP in membraanfusie gevolgd worden. Na fluorescentie-analyse van verschillende Dendra2-Ac45RP en Ac45RP-Dendra2 pools bleek dat wanneer Dendra2 aan de C-terminus gefuseerd is, Ac45RP zich meer in het plasmamembraan lokaliseert. Door de fusie met Dendra2 zou de route informatie die aanwezig is in de C-terminus mogelijk geblokkeerd kunnen worden [24]. Uit de verschillende pools werden van elke fusie de meest fluorescente geselecteerd en gebruikt voor live cell imaging. Echter bleek dat de fluorescentie van de cellen te zwak was om te kunnen vastleggen. Voor een volgend experiment zouden de gefuseerde YFP klonen gebruikt kunnen worden. Via ‘photobleaching’ zou de fluorescentie van alle blaasjes in de uitgroeiende neuriet na differentiatie kunnen worden weggehaald. De YFP gefuseerde Ac45RP klonen kunnen hierdoor gevolgd worden wanneer de uitgroeiende neuriet weer gevuld wordt met blaasjes. Ook kan door deze techniek de fluorescentie van de blaasjes in de cel worden weggehaald waardoor de blaasjes die vanuit de neuriet komen gevolgd kunnen worden. Een andere mogelijkheid om een
32
sterker signaal te verkrijgen is om een induceerbare vector met de Dendra2 fusies in N2a cellen te brengen. Ac45RP-Dendra2 en Dendra2-Ac45RP kunnen hierdoor pas op het moment zelf worden aangemaakt waardoor er mogelijke een sterker signaal wordt verkregen.
4.5
D
E LOKALISATIE VAN
A
C
45RP-
EXPRESSERENDE CELLEN IN HET
MUIZENBREIN
Om de lokalisatie van Ac45RP-expresserende cellen in het brein van de muis te bepalen is er een in situ hybridisatie uitgevoerd. Ac45 welke differentieel tot expressie komt in het muizenbrein [2] werd hierbij gebruik als positieve controle. Van beide eiwitten werd er gebruik gemaakt van een anti-sense en sense probe. De concentratie van de probes werd vastgesteld d.m.v. een spotblot. Hieruit bleek dat de Ac45RP anti-sense probe een erg hoge concentratie had van 6400ng/µl. Na analyse van de verschillende coupes bleek dat er voor Ac45 een duidelijke kleuring was ontstaan met de anti-sense probe. Ac45 kwam differentieel sterk tot expressie in de cortex, bulbus olfactorius, cerebellum, hippocampus en de thalamus. Na analyse van Ac45RP bleek hier in tegenstelling tot Ac45 geen expressie zichtbaar. Dit zou mogelijk opgelost kunnen worden door het gebruik van een bijvoorbeeld een andere blokoplossing (FCS i.p.v. blocking reagent) of het verlagen van de probe concentratie. Daarnaast zou de meting van een te hoge concentratie van de Ac45RP anti-sense probe mogelijk een oorzaak kunnen zijn van het niet kleuren in de coupes. Deze concentratie kan veroorzaakt worden door een niet goed gezuiverde oplossing na de DIG-labeling waarbij er nog DIG-labeling mix is achtergebleven en zou dus de werkelijke concentratie probe zijn overschat. Een andere mogelijke oorzaak is dat Ac45RP een ~15x lagere mRNA expressie [2] heeft (in brein gebiedjes) t.o.v. Ac45 waardoor er mogelijk een sterkere concentratie nodig is van Ac45RP om te kunnen detecteren. Voor verder onderzoek zou de anti-sense probe van Ac45RP in lagere verdunning gebruikt kunnen worden en zou de hybridisatie temperatuur kunnen worden aangepast. Uit een recente berekening van de optimale hybridisatietemperatuur bleek deze voor Ac45RP namelijk 57°C en voor Ac45 is dit 64°C. Mogelijk is de ~58-60°C te hoog geweest voor de Ac45RP probes en waarbij Ac45 juist goed kon hechten.
33
Hoofdstuk 5: Algemene conclusie
Het doel van deze studie was om meer inzicht te krijgen in de eigenschappen, functie en lokalisering van Ac45RP. Uit de resultaten van deze studie kan geconcludeerd worden dat Ac45RP mogelijk uit twee geglycosyleerde vormen bestaat en dat er geen nieuw Ac45RP mRNA gevormd wordt in N2a cellen na differentiatie.
In het proces van neurale uitgroei lijkt de Ac45RP mRNA expressie nog niet duidelijk geremd na een transiënte transfectie met shRNA’s. Daarnaast toonden de nieuw-gegenereerde stabiele shRNA cellijnen een duidelijke reductie van Ac45RP mRNA expressie aan en deze lijnen kunnen worden gebruikt voor verder eiwit en differentiatie-onderzoek. In het onderzoek om het proces van Ac45RP in neurale uitgroei te volgen bleek de expressie van de Dendra2 fusie-eiwitten te laag om via live cell imaging zichtbaar te maken en moet dus nog verder geoptimaliseerd worden. Verder voor de lokalisering van Ac45RP bleek het gevolgde in situ hybridisatie protocol goed te werken voor Ac45 omdat deze differentieel tot expressie kwam maar zal nog verder moeten worden geoptimaliseerd voor Ac45RP. Deze studie heeft het begin gevormd van een aantal nieuwe onderzoeken om de functie en lokalisering van Ac45RP in het proces van neurale uitgroei verder te bestuderen.
