4.1.
REMMING VAN DE N-GLYCOSYLERING VAN AC45RP IN N2A CELLEN DOOR
MIDDEL VAN TUNICAMICINE
Het accessoire V-ATPase subunit Ac45RP is een N-geglycosyleerd eiwit met zeven potentiële N-gekoppelde glycosylerings sites. Uit eerder onderzoek is gebleken dat doormiddel van een N-glycosidase F behandeling er een verandering in moleculemassa van het exogeen Ac45RP-eiwit van ≈80kDa naar ≈36kDa ontstond in Cos-1 cellen. Uit data-analyse van het eiwit blijkt dat dit ≈36kDa fragment zeer waarschijnlijk de ongeglycosyleerde vorm van Ac45RP is [2]. Het endogene Ac45RP in N2a cellen is hierna behandeld met N-glycosidase F echter werd het ≈80kDa eiwit niet gedeglycolyseerd. Na verschillende optimalisaties van de lysisbuffer met gebruik van N-glycosidase F is er voor gekozen om de N-glycosylering geheel te blokkeren met behulp van tunicamycine. Tunicamycine inhibeert de binding van N-acetylglucosamine (GlcNAc)aan dolichol waardoor er geen glycosylering meer plaats kan vinden [20,21]. Een nadeel van het gebruik van tunicamycine is dat het niet alleen de N-glycosylering van Ac45RP-eiwit zal remmen maar ook andere eiwitten die in de cel geglycosyleerd worden. Na Western blot analyse bleek dat er drie verschillende vormen (35kDa – 50kDa – 80kDa) van Ac45RP ontstonden na de toevoeging van 0 µM tunicamicine. Bij toevoeging van 10 en 25 µM tunicamicine waren de 50kDa en 80kDa banden gereduceerd. Dit zou betekenen dat er twee verschillende geglycosyleerde vormen zijn van het Ac45RP-eiwit en dat de band van 35kDa de ongeglycosyleerde vorm is van Ac45RP, wat overeenkomt met de eerdere analyse. Daarnaast kan uit deze resultaten niet geconcludeerd worden of de twee vormen van Ac45RP (50kDa en 80kDa) elk een afzonderlijke functie hebben binnen de cel of dat het 50kDa eiwit wordt opgeslagen in het ER en verder wordt geglycosyleerd wanneer de cel de geglycosyleerde vorm van 80kDa nodig heeft. Er kan gebruik gemaakt worden van Endoglycosidase H (Endo H) om te achterhalen of de 50kDa band werkelijk in het ER blijft. Dit enzym klieft alle structuren voordat alle mannose subunits worden verwijderd in Golgi (bijlage V). Daarna zijn de structuren resistent tegen het enzym. Hierdoor kan er worden achterhaald of het 50kDa Ac45RP-eiwit zich in het ER lokaliseert of dat het al verder verwerkt is en zich al in de Golgi bevindt [25].
Naast de deglycosylering op eiwitniveau van Ac45RP met behulp van tunicamycine werd van de behandelde en onbehandelde N2a cellen ook de locatie onderzocht met behulp van immunofluorecentie. Hieruit bleek dat Ac45RP mogelijk ophoopt rond het ERGIC gebied na behandeling met 10µM tunicamycine. Om vast te stellen in welk gebied Ac45RP nu werkelijk ophoopt zouden er verschillende specifieke markers gebruikt kunnen worden voor onder andere de Golgi, Endoplasmatisch reticulum en ER-Golgi intermediate compartment.
4.2DE AC45RP MRNA EXPRESSIE IN N2A CELLEN TIJDENS DIFFERENTIATIE
MET DBCAMP
Eerdere experimenten [26] toonde aan dat het Ac45 mRNA in N2a cellen niet toenam na differentiatie door middel van serumdeprivatie. Later werd bekend dat dbcAMP zorgt voor de differentiatie van N2a cellen in dopamine axonen [23]. Om dit te kunnen vergelijken werden N2a cellen gedifferentieerd met dbcAMP voor t= 0,4,24 uur. Na qPCR analyse bleek dat er geen veranderingen ontstonden in de expressie van Ac45RP op mRNA niveau. Hieruit kan geconcludeerd worden dat er na differentiatie geen extra Ac45RP mRNA wordt aangemaakt en het Ac45RP-eiwit dat al in de cel aanwezig is mogelijk steeds opnieuw wordt gebruikt tijdens differentiatie van N2a cellen.
31
4.3DE REDUCTIE VAN DE AC45RP MRNA EN EIWIT IN N2A CELLEN
Uit eerder onderzoek bleek dat na overexpressie van het Ac45RP-eiwit in gedifferentieerde N2a cellen er een toename was van neurale uitgroei [2]. Ook toonde onderzoek aan dat het Ac45RP mRNA in relatief hoge hoeveelheden in de bulbus olfactorius in het muizenbrein tot expressie komt. In de bulbus olfactorius zijn veel nieuwgeboren neuroblasten aanwezig die neurale uitgroei ondergaan [2]. De V0-sector van de V-ATPase is
betrokken bij Ca2+-afhankelijk membraanfusie [22]. Hierdoor wordt gedacht dat het Ac45RP-eiwit een belangrijke rol speelt bij de neurale uitgroei en membraantransport naar de groeikegel. Na deze overexpressie van het eiwit werd in dit onderzoek getracht een onderexpressie van Ac45RP te verkrijgen in N2a cellen door middel van RNA interferentie. Een transiënte transfectie met shRNA584 en shRNA1022 in N2a resulteerde in een ~75% reductie van de Ac45RP mRNA expressie t.o.v. de ‘scrambled’ controle. Op eiwitniveau leek er een lichte reductie van de 80kDa band te ontstaan na de transiënte transfectie. Dit zou kunnen betekenen dat dit geglycosyleerde product na een bepaalde tijd wordt afgebroken. Echter kon dit experiment niet meer worden gereproduceerd, mogelijk door de lage transfectie-efficientie tijdens deze experimenten. Het uiteindelijke doel van deze studie was om N2a cellen te differentiëren waarin Ac45RP gereduceerd werd. Nu de expressie op mRNA niveau was gereduceerd werd er een transiënte transfectie uitgevoerd waarbij de cellen met dbcAMP werden gedifferentieerd. De hypothese van dit experiment was dat een reductie in neurale uitgroei zou ontstaan in de cellen getransfecteerd met shRNA584 en shRNA1022 t.o.v. de ‘scrambled’ nucleotide controle. Om dit met meer duidelijkheid vast te stellen moet er nog berekend worden hoeveel getransfecteerde cellen er zijn met/zonder neurale uitgroei. Aan de hand van de microscopische analyse lijkt er nog geen duidelijke reductie van uitgroei zichtbaar maar dit zou ook verklaard kunnen worden door de stabiliteit van het Ac45RP- eiwit. Daarnaast zou dit experiment herhaald kunnen worden in stabiele shRNA cellijnen waarin meer duidelijkheid gegeven kan worden over de reductie van het mRNA en het eiwit. Om dit mogelijk te maken zijn er na de transiënte transfecties stabiele shRNA cellijnen gemaakt zodat alle cellen het shRNA in het genoom hebben opgenomen waardoor elke cel een constante reductie van Ac45RP zou moeten hebben. De Ac45RP mRNA expressie van deze stabiele lijnen resulteerde in een duidelijke reductie van het Ac45RP. Er werden hiervoor verschillende klonen ingezet waaruit kloon 3 van shRNA584 en kloon 3 van shRNA1022 de grootste reductie t.o.v. kloon 5 van de ‘scrambled’ nucleotide controle vertoonden. Deze zouden gebruikt kunnen worden om te bepalen of Ac45RP op eiwitniveau ook gereduceerd is en om te bepalen of er een afname in neurale uitgroei kan worden vastgesteld.
4.4 HET PROCES VAN HET AC45RP-EIWIT IN NEURALE UITGROEI VAN N2A
CELLEN
Om de het proces van het Ac45RP-eiwit in neurale uitgroei te volgen werden in eerdere experimenten [27] stabiele YFP-Ac45RP en Ac45RP-YFP klonen gemaakt. Deze klonen zijn bruikbaar om het proces van Ac45RP in neurale uitgroei in ‘real-time’ te volgen. Hier is er echter voor gekozen om Ac45RP-Dendra2 fusies te maken, omdat de kleur van Dendra2 van groen naar rood (photoswitch) omgezet kan worden. Hierdoor kan een pool aan blaasjes worden gemerkt en kan het proces van Ac45RP in membraanfusie gevolgd worden. Na fluorescentie-analyse van verschillende Dendra2-Ac45RP en Ac45RP-Dendra2 pools bleek dat wanneer Dendra2 aan de C-terminus gefuseerd is, Ac45RP zich meer in het plasmamembraan lokaliseert. Door de fusie met Dendra2 zou de route informatie die aanwezig is in de C-terminus mogelijk geblokkeerd kunnen worden [24]. Uit de verschillende pools werden van elke fusie de meest fluorescente geselecteerd en gebruikt voor live cell imaging. Echter bleek dat de fluorescentie van de cellen te zwak was om te kunnen vastleggen. Voor een volgend experiment zouden de gefuseerde YFP klonen gebruikt kunnen worden. Via ‘photobleaching’ zou de fluorescentie van alle blaasjes in de uitgroeiende neuriet na differentiatie kunnen worden weggehaald. De YFP gefuseerde Ac45RP klonen kunnen hierdoor gevolgd worden wanneer de uitgroeiende neuriet weer gevuld wordt met blaasjes. Ook kan door deze techniek de fluorescentie van de blaasjes in de cel worden weggehaald waardoor de blaasjes die vanuit de neuriet komen gevolgd kunnen worden. Een andere mogelijkheid om een
32
sterker signaal te verkrijgen is om een induceerbare vector met de Dendra2 fusies in N2a cellen te brengen. Ac45RP-Dendra2 en Dendra2-Ac45RP kunnen hierdoor pas op het moment zelf worden aangemaakt waardoor er mogelijke een sterker signaal wordt verkregen.
4.5DE LOKALISATIE VAN AC45RP-EXPRESSERENDE CELLEN IN HET
MUIZENBREIN
Om de lokalisatie van Ac45RP-expresserende cellen in het brein van de muis te bepalen is er een in situ hybridisatie uitgevoerd. Ac45 welke differentieel tot expressie komt in het muizenbrein [2] werd hierbij gebruik als positieve controle. Van beide eiwitten werd er gebruik gemaakt van een anti-sense en sense probe. De concentratie van de probes werd vastgesteld d.m.v. een spotblot. Hieruit bleek dat de Ac45RP anti-sense probe een erg hoge concentratie had van 6400ng/µl. Na analyse van de verschillende coupes bleek dat er voor Ac45 een duidelijke kleuring was ontstaan met de anti-sense probe. Ac45 kwam differentieel sterk tot expressie in de cortex, bulbus olfactorius, cerebellum, hippocampus en de thalamus. Na analyse van Ac45RP bleek hier in tegenstelling tot Ac45 geen expressie zichtbaar. Dit zou mogelijk opgelost kunnen worden door het gebruik van een bijvoorbeeld een andere blokoplossing (FCS i.p.v. blocking reagent) of het verlagen van de probe concentratie. Daarnaast zou de meting van een te hoge concentratie van de Ac45RP anti-sense probe mogelijk een oorzaak kunnen zijn van het niet kleuren in de coupes. Deze concentratie kan veroorzaakt worden door een niet goed gezuiverde oplossing na de DIG-labeling waarbij er nog DIG-labeling mix is achtergebleven en zou dus de werkelijke concentratie probe zijn overschat. Een andere mogelijke oorzaak is dat Ac45RP een ~15x lagere mRNA expressie [2] heeft (in brein gebiedjes) t.o.v. Ac45 waardoor er mogelijk een sterkere concentratie nodig is van Ac45RP om te kunnen detecteren. Voor verder onderzoek zou de anti-sense probe van Ac45RP in lagere verdunning gebruikt kunnen worden en zou de hybridisatie temperatuur kunnen worden aangepast. Uit een recente berekening van de optimale hybridisatietemperatuur bleek deze voor Ac45RP namelijk 57°C en voor Ac45 is dit 64°C. Mogelijk is de ~58-60°C te hoog geweest voor de Ac45RP probes en waarbij Ac45 juist goed kon hechten.
33