Toelichtend document voor de validatie van detectiemethoden van plantpathogenen en -aantasters

Hele tekst

(1)Toelichtend Document voor de Validatie van Detectiemethoden van Plantpathogenen en -aantasters. Dr.Ir. R.A.A. van der Vlugt, Ing. M. Verbeek & Dr. P.J.M. Bonants. Rapport 135.

(2)

(3) Toelichtend Document voor de Validatie van Detectiemethoden van Plantpathogenen en -aantasters. Dr.Ir. R.A.A. van der Vlugt, Ing. M. Verbeek & Dr. P.J.M. Bonants. Plant Research International B.V., Wageningen februari 2007. Rapport 135.

(4) © 2007 Wageningen, Plant Research International B.V. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen of enige andere manier zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van Plant Research International B.V. Exemplaren van dit rapport kunnen bij de (eerste) auteur worden besteld. Bij toezending wordt een factuur toegevoegd; de kosten (incl. verzend- en administratiekosten) bedragen € 50 per exemplaar.. Plant Research International B.V. Adres Tel. Fax E-mail Internet. : : : : : :. Droevendaalsesteeg 1, Wageningen Postbus 16, 6700 AA Wageningen 0317 - 47 70 00 0317 - 41 80 94 info.pri@wur.nl www.pri.wur.nl.

(5) Inhoudsopgave pagina. 1.. Inleiding. 1. 2.. Validatie van detectiemethoden plantenziekten. 3. 2.1 2.2 2.3 2.4. 3 3 4 4 6 6 6 7. 3.. Definities 3.1 3.2 3.3. 4.. 5.. Wat is validatie? Methodiek, methode en analyse De validatie van analyses Werkwijze 2.4.1 Het bepalen van het doel van de analyse 2.4.2 Is de te valideren analyse kwalitatief of kwantitatief? 2.4.3 Is de te valideren analyse een referentiemethode? 2.4.4 Het bepalen van de prestatiekenmerken. Overzicht van definities van prestatiekenmerken Overzicht van overige definities Validatiemateriaal. 9 9 15 17. Rapportage. 19. 4.1. Validatierapport. 19. Lijst met aanbevelingen. 21. Bijlage 1. Uitwerking Validatie schema Pepinomozaïekvirus (PepMV) B1.1 B1.2 B1.3 B1.4. DAS-ELISA PepMV RT-PCR PepMV Protocol DAS-ELISA voor PepMV Protocol RT-PCR voor PepMV. Bijlage 2. Validatierapport B2.1 B2.2. Validatierapport DAS-ELISA voor het aantonen van Pepinomozaïekvirus in tomatenblad Validatierapport RT-PCR voor het aantonen van Pepinomozaïekvirus in tomatenblad. 23 23 29 33 35 37 37 44. Bijlage 3. Termen en definities NEN 7777. 51. Bijlage 4. Verwijzigingen en geraadpleegde literatuur. 57. B4.1 B4.2 B4.3. Verwijzigingen Geraadpleegde Literatuur Literatuurlijst (voor verdere oriëntatie). 57 57 58.

(6)

(7) 1. 1.. Inleiding. Gedurende de laatste 20-30 jaar heeft er een enorme ontwikkeling plaatsgevonden op het gebied van onderzoek en ontwikkeling van allerlei snelle analysemethoden, met name in de voedselsector. Analysemethoden om allerlei bestanddelen maar ook om een breed scala van pathogenen te detecteren in allerlei voedingsmiddelen. Zulke methoden kunnen belangrijk voordeel opleveren t.o.v. van reeds bestaande methoden, doordat ze gevoeliger, sneller, goedkoper, etc. zijn. Voor de microbiologische bepalingen werden de traditionele uitplaat methoden vervangen door ELISA en/of moleculaire methoden zoals PCR. Voordat methoden echter gebruikt kunnen worden moeten ze onderworpen worden aan een gedegen validatieprocedure. In Nederland komen vele plantpathogenen en plantaantasters voor in de teelt van talloze gewassen en onze internationale handelspositie brengt met zich mee dat er gerede kans bestaat dat er nieuwe pathogenen worden geïntroduceerd. Deze ziekten en plagen vormen een serieuze bedreiging voor de teelt van en de handel in planten en plantaardige producten, voor de natuur en het openbaar groen. Om bescherming te bieden voor teelten (c.q. natuurlijke ecosystemen) en de handel veilig te stellen zijn in internationaal verband de meest schadelijke ziekten en plagen gereguleerd (quarantainestatus). Detectie- en identificatiemethoden spelen een cruciale rol in de monitoring en bewaking van deze ziekten en plagen. In de plantenziektenkundige sector in Nederland zijn een aantal laboratoria, diensten en instituten actief m.b.t. de ontwikkeling en implementatie van dergelijke methoden voor plantenziekten. Het betreft veel verschillende organismen, zoals virussen, bacteriën, schimmels, nematoden en insecten. Binnen Nederland worden jaarlijks miljoenen monsters geanalyseerd op dit breed scala van organismen m.b.v. diverse methoden. De biologie van al deze organismen is echter zeer divers alsmede ook de methodieken die gebruikt worden om ze te detecteren in een zeer uiteenlopende reeks van substraten. De Plantenziektenkundige Dienst heeft een sleutelrol in het voorkomen van introductie van (vooral) Q(uarantaine)organismen in Nederland, terwijl de keuringslaboratoria een rol spelen in het beoordelen van plantaardig (uitgangs)materiaal op de aanwezigheid van een divers scala aan organismen. In Nederland speelt Plant Research International (PRI) (voorheen het Instituut voor Plantenziektenkundig Onderzoek (IPO-DLO)) een belangrijke rol bij de ontwikkeling van detectiemethodieken. Tientallen jaren onderzoekservaring aan een veelheid van plantpathogenen hebben tot de ontwikkeling van vele diagnostica en detectiemethodieken geleid. Deze worden al geruime tijd in binnen- en buitenland door keuringsinstanties en bedrijven gebruikt. In het verleden werden vele methoden ontwikkeld gebaseerd op het gebruik van antisera (ELISA, IF), vooral tegen virussen en bacteriën (IF). Voor een groot aantal virussen en bacteriën zijn deze methoden momenteel nog steeds het referentiekader en vormen in vele landen een pijler onder het fytosanitair beleid. Voor die plantpathogenen waarvoor geen betrouwbare antisera beschikbaar zijn (zoals voor veel belangrijke schimmels) zijn serologische detectietechnieken niet goed toepasbaar. Sinds een tiental jaren hebben de moleculaire methoden hun intrede gedaan in de wereld van de diagnostiek en zijn er detectiemethoden ontwikkeld gebaseerd op DNA/RNA. De ontwikkelingen op dit gebied gaan snel en de komende jaren zijn nog diverse nieuwe technologieën op de markt te verwachten. Hoewel moleculaire technieken voor de detectie en identificatie van plantpathogenen al op een aantal plaatsen op (semi)-routine basis in gebruik zijn (en zelfs commercieel aangeboden worden), is het niet duidelijk of bij deze testen verder gekeken is dan een vergelijking van de gevoeligheid ten opzichte van de bestaande testen. Toch is dat noodzaak omdat elke methode, maar ook elk pathogeen, zijn eigen karakteristieken heeft. Voordat een nieuwe (moleculaire) methode in de praktijk kan worden geïmplementeerd, bijv. door de PD en de praktijklaboratoria, is het noodzakelijk dat dergelijke methoden goed gevalideerd worden t.o.v. bestaande methoden. Criteria die hierbij een belangrijke rol vervullen zijn gevoeligheid, specificiteit, robuustheid, aantal vals negatieven/vals positieven, gebruikte extractiemethode en type plantmateriaal (wortels, blad, hout, bloemen etc.). De ervaring leert ook dat niet elke nieuwe (moleculaire) analyse standaard in elk laboratorium ingevoerd kan worden. Een implementatiefase als ook een veel hoger niveau van kwaliteitsborging zijn nodig t.o.v. bijvoorbeeld ELISA. Al deze organisaties, die werken met de ontwikkeling, validatie, implementatie en uitvoering van dergelijke detectiemethoden voor plantenziekten, hebben aangegeven dat een uniforme systematiek voor validatie van nieuwe analyses.

(8) 2 voor de detectie/diagnostiek van plantpathogenen noodzakelijk is, mede door het feit dat veel plantpathogenen hun eigen karakteristieken hebben. Analysemethoden, die worden aangeboden voor accreditatie, dienen gevalideerd te zijn. Voor de structuur van de methode validatie wordt verwezen naar NEN 7777: Milieu – prestatiekenmerken van meetmethoden. Deze norm is bedoeld voor de validatie van fysische en chemische methoden. De validatie van analysemethoden in andere toepassingsgebieden kan vaak niet op geheel dezelfde wijze als in de chemie of fysica worden uitgevoerd. Aanwijzingen voor validaties in bepaalde toepassingsgebieden kunnen worden opgenomen in een zgn. toelichtend document (een voorbeeld daarvan is RvA-T02, een toelichtend document voor de microbiologie). Om tot een algemeen aanvaarbare validatiesystematiek van nieuwe analyses voor plantpathogenen te komen acht de projectgroep het nodig om de (eind)gebruikers uit de praktijk in de ontwikkeling en implementatie van een dergelijk systematiek te betrekken. Ook is het essentieel om gebruik te maken van de ervaringen die buiten het gebied van plantpathogenen met validatie van op PCR gebaseerde analyses zijn opgedaan. Vooral in de humane en animale virologie wordt al op veel grotere schaal gebruik gemaakt van PCR diagnostiek naast ELISA. Deze ervaringen zijn verzameld en, samen met de uitgevoerde literatuurstudie en in afstemming met PD en andere eindgebruikers, moeten deze leiden tot een eerste opzet voor de systematiek voor het uitvoeren van validatie experimenten m.b.t. detectie van plantpathogenen. Tijdens de looptijd van een project Validatie (2005-2006) en op de georganiseerde workshop is er intensief overleg geweest met de eindgebruikers van analyses en is er een duidelijk draagvlak voor het validatiesysteem gecreëerd. Uiteindelijk moet dit leiden tot een voor alle partijen aanvaardbare systematiek waarin op een veilige en verantwoorde manier nieuw analyses in de bestaande keuring en toetsingssystemen en onder de huidige kwaliteitsborgingsystemen ingepast kunnen worden. Opgemerkt dient bovendien te worden dat plantpathogenen hun specifieke kenmerken hebben m.b.t. ecologie en verspreiding in de diverse substraten (plant, grond, lucht, water), waarin ze voorkomen. Ook het tijdstip waarop bemonsterd wordt en de aard van te analyseren monster kan heel divers zijn. Derhalve is kennis omtrent de biologie en epidemiologie van het pathogeen in kwestie erg belangrijk. Controlemonsters en noodzakelijk referentiemateriaal zijn in veel gevallen niet of in beperkte mate voorradig. Al deze aspecten worden meegenomen in de manier waarop een nieuwe of bestaande analysemethode moet worden gevalideerd. Dit document, opgesteld door PRI en van commentaar voorzien door de begeleidingscommissie, bestaande uit vakdeskundigen plantenziekten van alle relevante laboratoria in Nederland, voorziet in de behoefte in een nadere toelichting en een referentiekader bij de validatie van analyses die gebruikt worden voor de detectie van plantpathogenen..

(9) 3. 2.. Validatie van detectiemethoden plantenziekten. 2.1. Wat is validatie?. Onder validatie wordt verstaan het aantonen dat de beschreven analysemethode geschikt is voor de beoogde toepassing, dat wil zeggen dat deze voldoet aan de eisen die er met betrekking tot de toepassing aan gesteld worden. De relevante prestatiekenmerken moeten worden vastgesteld, afhankelijk van de status en soort methode. Validatie is onder te verdelen in twee benaderingen: Proces-validatie en Methode-validatie.. a. Proces-validatie Een goede definitie van proces-validatie wordt gegeven door de Food and Drug Administration: ‘Establishing documented evidence which provides a high degree of assurance that a specific process will consistently produce a product meeting its predetermined specifications and quality attributes.’ De belangrijkste aspecten van deze definitie zijn: • documented evidence: objectief bewijs schriftelijk vastleggen; • high degree of assurance: gebaseerd op statistische methoden; • specific process: proces en subprocessen eenduidig beschreven; • consistently produce a product: steeds hetzelfde product/resultaat, binnen marges; • predetermined specifications: vooraf gesteld, niet achteraf; • bij deze benadering van validatie wordt uitgegaan van het hele proces wat uiteindelijk een product oplevert. Elk deelproces kent daarbij zijn eigen evaluatie: een apart validatierapport of ‘qualification’.. b. Methode-validatie Een andere benadering is de methode-validatie. Hierbij wordt niet zozeer naar het hele proces gekeken, maar specifiek naar de bepaalde methode. De definitie van methode-validatie is als volgt: ‘Validation involves documenting, through the use of specific laboratory investigations, that the performance. characteristics of the method are suitable and reliable for the intended analytical purposes’ (FDA & US Department of Health and Human Services). In de praktijk zal vaak een combinatie van methode- en proces-validatie aan de orde zijn. Immers je kunt een bepaalde analyse wel valideren, maar je zult ook je apparatuur in orde moeten hebben, de medewerkers goed geschoold moeten zijn, de analysemethode zal onderhouden moeten worden (heranalyseren van batches bijvoorbeeld), etc. Kortom, vaak zal er ook sprake moeten zijn van (een bepaalde vorm van) accreditering van een instelling. In dit toelichtend document wordt met name aandacht besteed aan methode-validatie. Proces-validatie is een voorwaarde waar een geaccrediteerde instelling aan moet voldoen en wordt uitvoerig beschreven in ISO/IEC 17025.. 2.2. Methodiek, methode en analyse. In dit document wordt er van uitgegaan dat de methode-validatie wordt toegepast op analyses en niet op methodieken of methoden. Ook al is de methodiek (het principe waarop de analyse is gebaseerd) of de methode (werkwijze) algemeen en in de literatuur goed beschreven, toch zal de specifieke analyse gevalideerd moeten worden. Als voorbeeld: een analyse voor een specifiek pathogeen is gebaseerd op de methodiek immunologie en de methode DAS-ELISA. Wanneer de prestatiekenmerken van deze analyse (een DAS-ELISA met specifieke antilichamen tegen het pathogeen) nog niet eerder zijn bepaald, zal de analyse moeten worden gevalideerd als een nieuwe analyse..

(10) 4. 2.3. De validatie van analyses. De validatie van een analyse wordt gedefinieerd als het aantonen dat de analyse geschikt is voor de beoogde toepassing. Analyses moeten gevalideerd worden, telkens wanneer het nodig is om te verifiëren dat de prestatiekenmerken geschikt zijn voor de toepassing bij een specifiek analytisch probleem. Dit is bijvoorbeeld zo voor een nieuwe analyse die met een bepaald doel ontwikkeld is, maar ook voor bestaande analyses die aangepast of uitgebreid worden, die volgens de kwaliteitscontrole veranderd zijn of die met andere apparatuur uitgevoerd worden. De uitgebreidheid van een hervalidatie hangt af van de veranderingen. Van elk validatie-onderzoek wordt een rapport gemaakt.. 2.4. Werkwijze. Voor de validatie van analyses voor plantpathogenen is het volgende validatieplan van toepassing: 1. Bepaal het doel van de analyse (benoem de meetgrootheid, het meetobject / toepassingsgebied, de analysemethode). 2. Benoem of het meetresultaat kwalitatief of kwantitatief wordt geïnterpreteerd. 3. Bepaal of de analyse een referentiemethode is (dus niet alleen de methodiek/methode, maar een analyse toegepast op het doelpathogeen) en, zo ja, of de prestatiekenmerken juistheid, selectiviteit, specificiteit, meetbereik en robuustheid in voldoende mate in de publicatie zijn beschreven of door de beroepsgroep algemeen geaccepteerd (bijv. opspoelmethoden van grondmonsters). 4. Bepaal op basis van stap 2 en 3 welke prestatiekenmerken moeten worden bepaald. 5. Bepaal per prestatiekenmerk de deeltoepassingsgebieden (bijvoorbeeld voor verschillende matrices) waarvoor afzonderlijk validatie-onderzoek nodig is. 6. Ga na of er externe eisen vastgelegd zijn voor bepaalde prestatiekenmerken. 7. Absolute limietwaarden (vastgestelde eis). 8. Standaardwaarden (uit eerder validatie-onderzoek). 9. Ga na welke monsters nodig zijn voor het validatie-onderzoek (n ≥ 8 én zie Tabel 1). 10. Voer het validatie-onderzoek uit voor afzonderlijke prestatiekenmerken of in een gecombineerde proefopzet (zie Tabel 1). 11. Beoordeel de vastgestelde prestatie in vergelijking met eventuele externe eisen. Beoordeel bij het ontbreken van externe kwantitatieve eisen rechtstreeks ten opzichte van het gebruiksdoel. 12. Rapporteer de resultaten in een validatierapport. In Figuur 1 is verkort weergegeven hoe de keuze wordt gemaakt voor de te bepalen prestatiekenmerken. Er is gestreefd naar een zo duidelijk mogelijk stroomdiagram waarin de te bepalen prestatiekenmerken eenvoudig af te lezen zijn na het doorlopen van de volgende beslisstappen. Dit stroomdiagram (Figuur 1) gaat er expliciet vanuit dat er al een duidelijke keuze gemaakt is voor de te gebruiken analyse. Bijstellen van de analyse gedurende het validatieproces is af te raden..

(11) 5 In de volgende paragrafen worden deze stappen verder toegelicht.. Figuur 1.. Stroomdiagram validatie van analyses..

(12) 6. 2.4.1. Het bepalen van het doel van de analyse. De eerste stap is het bepalen van het doel van de analyse (scope). Vaak is dit afhankelijk van de opdrachtgever/ klant. Essentieel is hierbij dat er niet teveel beloofd wordt en dat de analyse beperkt wordt tot een zeer specifiek omschreven toepassing (afbakening). Er dient goed omschreven te worden welke analysemethode gebruikt wordt met welk pathogeen, welk gewas (deel gewas), welke matrix, onder welke omstandigheden en wat de uitslag van de analyse betekent in de betreffende context (het bepalen van dat pathogeen in die matrix met die en die methode, als voorbeeld: Het aantonen van Plum Pox Virus (PPV) in kelkblaadjes van pruim, cultivar xxx, met behulp van een DASELISA (zie hiervoor RvA T25). In de praktijk van de analyses op plantpathogenen zijn een viertal analysecategorieën te onderscheiden: 1. Een zo groot mogelijke zekerheid over aan- of afwezigheid: Quarantaine-organismen (Q-organismen). 2. Kwaliteits-organismen (K-organismen) met max % toelaatbare besmetting (bijv. van virus in pootaardappelen). 3. K-organismen met alleen bepaling aan- of afwezigheid (heb ik een probleem of niet). 4. Diagnostiek (wat is mijn probleem?). Kenmerkend voor de eerste 3 categorieën is dat je bewust test op een vooraf bepaald pathogeen met een voor dat pathogeen geschikte test of analysemethode. Dit valt onder de term Detectie. De vierde categorie omvat Diagnostiek, de poging de veroorzaker van een ziekte te identificeren. Het is goed om deze analysecategorieën te onderkennen en mee te laten wegen in de bepaling van de scope van de analyse. OPM Dit document dient beschouwd te worden als een algemene blauwdruk volgens welke analysemethoden gevalideerd kunnen worden. Echter, elke pathogeen/plant combinatie stelt door zijn specifieke eigenschappen weer speciale eisen aan de analyse en de manier waarop die uitgevoerd moet/kan worden en wellicht aan de manier waarop bepaalde prestatiekenmerken bepaald moeten worden. Het is niet mogelijk om voor elke combinatie dit in dit document tot in detail uit te werken.. 2.4.2. Is de te valideren analyse kwalitatief of kwantitatief?. Vaak kan een methode (bijvoorbeeld ELISA) voor zowel een kwalitatieve bepaling (pathogeen al dan niet aanwezig) als een kwantitatieve bepaling (er is een bepaalde hoeveelheid van het pathogeen aanwezig) worden gebruikt. In geen van de Nederlandstalige normen wordt een duidelijke definitie van kwalitatief of kwantitatief gegeven. Dit kan tot onduidelijkheden leiden. Om deze discussie helder te krijgen stellen we voor de begrippen, ongeacht de methode, als volgt te definiëren: • Kwalitatief: het vaststellen van de aanwezigheid of afwezigheid van een plantenpathogeen in een monster. • Kwantitatief: het vaststellen van een bepaalde hoeveelheid van een plantenpathogeen in een monster.. 2.4.3. Is de te valideren analyse een referentiemethode?. Veel van de voor plantpathogenen gebruikte analyses zijn in de literatuur (maar ook breder, bijv. EPPO protocollen) terug te vinden of door de praktijk (of normalisatie-instituut = referentielab = PD) algemeen geaccepteerd. Ook al zijn deze analyses te vinden in gerefereerde wetenschappelijke tijdschriften, toch worden vaak geen gedegen analyses van prestatiekenmerken gepresenteerd. Voor de prestatiekenmerken selectiviteit, specificiteit, meetbereik en robuustheid zal bekeken moeten worden of één of meerdere van deze kenmerken in de literatuur (of praktijk) op de juiste wijze zoals aangegeven in dit document bepaald zijn. Dat moet dan ook duidelijk voor de te valideren analyse (protocol en omstandigheden van uitvoering) beschreven zijn. Als dit zo is, dan kan de bepaling van dat prestatiekenmerk achterwege blijven in het validatie-onderzoek. Als dat niet zo is, moeten de betreffende prestatiekenmerken alsnog bepaald worden.

(13) 7 OPM In de literatuur dient de te gebruiken analyse beschreven te staan. Literatuur over de gebruikte methodiek of methode is niet als bron voor validatiegegevens van de analyse aan te merken. OPM Het komt ook voor dat een analyse die reeds was gevalideerd op kleine punten wordt gewijzigd (= conform referentiemethode). Voor een gewijzigde analyse is een hervalidatie nodig gericht op die prestatiekenmerken die redelijkerwijs door de verandering kunnen zijn beïnvloed. Geef derhalve precies aan wat de verandering inhoudt en welke prestatiekenmerken mogelijk zijn beïnvloed door deze verandering. Deze dienen dan opnieuw bepaald te worden. Wanneer bijv. een ander gewas wordt geanalyseerd betekent dit dat een aantal prestatiekenmerken en met name de selectiviteit opnieuw moet worden bekeken (andere matrix). Wanneer het doel van de analyse (scope) totaal wordt veranderd betekent dit in principe een nieuwe analyse en betreft het een grote verandering.. 2.4.4. Het bepalen van de prestatiekenmerken. In Bijlage 1 wordt een uitwerking van het Validatieschema voor Pepinomozaïekvirus weergegeven en wordt een toelichting gegeven op het bepalen van de prestatiekenmerken voor twee analyses (DAS-ELISA en RT-PCR) op Pepinomozaïekvirus in tomatenblad. Soms worden aan prestatiekenmerken externe eisen gesteld, bijvoorbeeld omdat opdrachtgevers/klanten een bepaalde limietwaarde aangeven. Als dit het geval is dan zal in het validatierapport aangegeven moeten worden dat het bepaalde prestatiekenmerk aan de externe eisen voldoet. Prestatiekenmerken behoeven niet in afzonderlijke onderzoeken te worden bepaald, maar kunnen ook in één gecombineerd onderzoek worden bepaald. Een schematisch voorbeeld van een analyseschema verdeeld over acht dagen is gegeven in Tabel 1 (naar NEN 7777)..

(14) 8 Tabel 1.. Schematisch voorbeeld van een minimaal onderzoek voor de gezamenlijke bepaling van prestatiekenmerken.. Laboratoriummonster. Prestatiekenmerk. Laboratoriummonster I. herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid herhaalbaarheid/ reproduceerbaarheid aantoonbaarheidsgrens. xx. x. x. xx. x. x. x. x. x. x. x. x. juistheid / specificiteit modelafwijking selectiviteit. x x xx. x x. x x. x x. x x. x x. x x. x x. robuustheid. xx. Laboratoriummonster 2 Laboratoriummonster 3 Laboratoriummonster 4 Laboratoriummonster 5 Laboratoriummonster 6 Laboratoriummonster 7 Laboratoriummonster 8 Laboratoriummonster nabij aantoonbaarheidsgrens Referentiemateriaal Standaard Monster(s)/ monster(s) met afwijkende matrix Monster(s)/ monster(s) onder afwijkende omstandigheden. x : enkelvoudige bepaling xx : duplobepaling in herhaalbaarheidsomstandigheden. Zie hoofdstuk 3.3 voor de keuze van het validatiemateriaal.. Dag 1. Dag 2. Dag 3. Dag 4. Dag 5. Dag 6. xx. x. x. xx. Dag 7. xx. x. x. xx. Dag 8. xx. x. x. xx.

(15) 9. 3.. Definities. Definities van prestatiekenmerken spelen een belangrijke rol in het proces van analysevalidatie. ‘Wat wil je waarin op welke manier onder welke voorwaarden aantonen?’ Bij het bestuderen van de literatuur blijken er verschillende definities voor dezelfde begrippen gehanteerd te worden. Definities voor de verschillende prestatiekenmerken blijken niet altijd eenduidig. Door de begeleidingcommissie is aangegeven dat de norm NEN7777 als leidraad moet worden beschouwd. In Bijlage 3 zijn de definities weergegeven zoals ze te vinden zijn in deze norm. Omdat deze norm vooral gericht is op chemische stoffen zijn haar definities niet altijd 1 op 1 over te nemen voor de plantpathogenensector. Enige aanpassing van deze definities is gewenst vanwege de specifieke problematiek van deze sector. De definities uit NEN7777 zijn door de projectgroep derhalve geïnterpreteerd voor de plantpathogenensector. Daarbij is gelet op uitvoerbaarheid en zinvolle invulling van de bepaling van het prestatiekenmerk (bijvoorbeeld: kan de concentratie van een pathogeen wel bepaald worden?). In Bijlage 3 zijn verder aanvullende termen weergegeven m.b.t. detectie en diagnostiek. Deze definities zijn opgesteld door de Koninklijke Nederlandse Plantenziektenkundige Vereniging (KNPV) en gepubliceerd in de Termenlijst: lijst van gewasbeschermingskundige termen. Gewasbescherming jaargang 28, supplement 1, 1997. In hoofdstuk 3.1 zijn van de relevante prestatiekenmerken de NEN7777 definities weergegeven gevolgd door relevante toelichtingen /opmerkingen uit het veld van de plantpathogenen. Hierop volgt dan een nieuwe definitie voor dat prestatiekenmerk, voorgesteld door de projectgroep. Tenslotte wordt per prestatiekenmerk de uitwerking ervan beschreven. Voorgesteld wordt om in de toekomst deze definities te hanteren.. 3.1. Overzicht van definities van prestatiekenmerken. Juistheid DEFINITIE NEN7777 Vermogen van een meetmethode om aanwijzingen zonder systematische afwijking weer te geven [NPR 2814]. OPM De definitie van juistheid gaat in verschillende normen uit van een gemiddelde waarde van een reeks waarnemingen. Alleen NEN7777 vermijdt het woord gemiddelde (vermogen om aanwijzingen zonder systematische afwijking weer te geven). Bij deze definities kan men de vraag stellen of juistheid dan wel past bij een kwalitatieve test waarbij het niet gaat om het vaststellen van de hoeveelheid van een pathogeen. In feite gaat het hier om de vraag of de analyse wel doet wat hij zegt dat hij doet. Wordt daadwerkelijk het gewenste organisme aangetoond? Heb ik geen isolaten gemist? Het probleem is echter dat veel laboratoriumanalyses juist worden toegepast in situaties waarin het niet vooraf al duidelijk is dat het organisme aanwezig is (bijv. symptoomloze virussen, moeilijk te beoordelen cultivars) en een vergelijking met een visuele beoordeling niet mogelijk is. Derhalve is kennis omtrent het pathogeen, de bemonstering, matrixeffecten, tijdstip van het jaar van eminent belang. Om de resultaten van de laboratoriumanalyses (het aantal als ziek beoordeelde exemplaren in een monster) op juistheid te beoordelen zou een vergelijking gemaakt kunnen worden tussen de te valideren analyse en een andere analyse gebaseerd op een andere methodiek (andere analyse of bijv. waarnemingen op symptomen). De juistheid is dan af te leiden van het percentage van de monsters dat in beide methoden eenzelfde uitslag (positief of negatief) heeft, idealiter 100%. In dit kader kunnen we diagnostische sensitiviteit en specificiteit noemen (zie onder specificiteit), maar dan zijn meer dan 8 monsters nodig om statistisch significante uitspraken doen. Deze analyses moeten dan bovendien gedaan.

(16) 10 worden met materiaal waarvan vaststaat dat het het juiste pathogeen betreft, zoals dat voorkomt in een referentiecollectie. Dit hoeft niet als de tweede methode de referentiemethode is. DEFINITIE TDVDP Juistheid is het vermogen van de analyse om te doen wat hij zegt te doen (bijv. detectie van organisme A in matrix X). UITWERKING Voer de analyse (n≥8) uit op het doelorganisme, verkregen uit een kwalitatieve goede referentiecollectie (indien mogelijk), of op een monster, waarvan in een andere test (gevalideerd en gebaseerd op een ander principe) is vastgesteld dat deze het doelorganisme bevat. Ook wordt er in de praktijk met positieve controles gewerkt die altijd tijdens de uitvoering van de methode worden meegenomen. Zie ook Tabel 1 en 2.. Aantoonbaarheidsgrens DEFINITIE NEN7777 Laagste concentratie van de component in het laboratoriummonster waarvan de aanwezigheid nog met een bepaalde betrouwbaarheid kan worden vastgesteld. OPM De aantoonbaarheidsgrens kan niet altijd absoluut worden vastgesteld bij de detectie van plantpathogenen. Vaak wordt de aantoonbaarheidsgrens gedefinieerd in termen van ‘de kleinste aan te tonen hoeveelheid’. Voor chemische stoffen (NEN7777) hoeft dit geen probleem te zijn omdat die vaak in een zuivere vorm met precies bekende concentratie beschikbaar zijn; echter voor plantpathogenen ligt dit niet zo duidelijk. Vaak wordt bij het vaststellen van de kleinst aan te tonen hoeveelheid een verdunningsreeks gebruikt. Dan dient echter de beginconcentratie van de aan te tonen stof bekend te zijn. Voor plantpathogenen is dit zeker niet altijd mogelijk. Er zijn bovendien ook niet-kweekbare organismen (obligate pathogenen), die alleen in de plant aanwezig zijn en waarbij zuivering niet altijd mogelijk is. Derhalve is de exacte concentratie van plantpathogenen vaak niet of nauwelijks nauwkeurig vast te stellen en daarom moet men werken met schattingen. Zelfs bij plantpathogenen, die wel te zuiveren zijn (veel bacteriën en virussen), is een evt. te bepalen concentratie niet meer dan een goede schatting (bijv. CFU’s of mg/ml). Dit omdat de concentratiebepaling vaak gebaseerd is op een indirecte meting. OPM Bij het aantonen van cysten in grondmonsters kan je 1 cyst toevoegen aan het grondmonster en deze opspoelen: aantoonbaarheidsgrens 1 cyst per xx cc grond. Voor het aantonen van vrijlevende aaltjes kan je met je pipet er 1, 2 of 5 uit halen en deze opwerken en testen in een PCR: aantoonbaarheid is dan 1, 2 of 5 aaltjes van een te benoemen soort. Voor het aantonen van virussen in blad kan je van een positieve plant één blaadje plukken en dit samenvoegen met 3, 9 of meer blaadjes van een gezonde plant. Wanneer dit sap in de ELISA nog een positieve reactie geeft dan is de aantoonbaarheid van het virus in die bepaalde matrix 1 in 4, 10 of meer. Er zijn nog veel meer voorbeelden te bedenken. Op deze manier is de aantoonbaarheidsgrens voor plantpathogenen wellicht beter te bepalen. Een beslisgrens is bijv. de extinctie van een monster moet groter of gelijk zijn aan 0.15 of 0.20 o.i.d. of de Ct waarde moet kleiner zijn dan 35 in het geval van een RT-PCR. OPM Bij het vaststellen van de aantoonbaarheidsgrens gaat het in feite om de beslissing of het pathogeen wel of niet in dit monster aanwezig is. Is mijn monster wel of niet gezond? Op welk punt beslis ik dat mijn monster niet meer gezond is? Het matrixmateriaal kan hierbij vaak een belangrijke rol spelen. In tegenstelling tot chemische analyses vinden analyses van plantpathogenen vaak in heel complexe matrices plaats. Achtergrondreacties met andere componenten kunnen snel tot vals-positieve reacties leiden. De mate van achtergrondreacties vormt een belangrijk criterium bij het vaststellen van deze grens. Deze kun je dan ook vaststellen aan de hand van gezond plantmateriaal waarin je het pathogeen aan wil tonen (dezelfde matrix). Bij ELISA kan bijvoorbeeld vastgesteld worden wat de gemiddelde.

(17) 11 achtergrond is. Daarbij wordt dan vaak een bepaalde veiligheidsmarge opgeteld. Dat samen geeft een waarde die dan als beslisgrens gehanteerd wordt. DEFINITIE TDVDP De aantoonbaarheidsgrens is: De detectielimiet (indien het pathogeen in bekende concentratie voorhanden is), dan wel de grens waarbij de kans op vals-positieven minimaal is (als de concentratie van het pathogeen niet bekend is). UITWERKING Concentratie wel bekend: • Analyseer een achttal verdunningsreeksen in stappen van twee van het pathogeen in de matrix. • Bepaal de laagste concentratie die nog een signaal geeft boven de achtergrond van de gezonde controle. • Bepaal het gemiddelde van deze concentraties. • Bepaald de standaarddeviatie van deze metingen. • Bereken de aantoonbaarheidsgrens als het gemiddelde van de meetwaarden plus 3 x de standaardafwijking: AG = x + 3δ . • Vergelijk de maximale verdunning waarbij het signaal verdwijnt met de gebruikte verdunning in de analysemethode. Concentratie niet bekend: • Analyseer een achttal verdunningen van gezond plantmateriaal (van dezelfde waardplantsoort(en) die geanalyseerd gaat(n) worden), in de standaardverdunning met de standaard analysemethode. • Bepaald het gemiddelde van de gezondwaarden-reeks. • Bepaald de standaarddeviatie van de gezondwaarden-reeks. • Stel de aantoonbaarheidsgrens op het gemiddelde van de meetwaarden plus 3 x de standaardafwijking: AG = x + 3δ . Volgens NEN7777 moet na het vaststellen van de aantoonbaarheidsgrens, de aantoonbaarheid van het pathogeen gecontroleerd worden door achtmaal een laboratoriummonster nabij de aantoonbaarheidsgrens te analyseren. Zie ook Tabel 1 en 2.. Herhaalbaarheid DEFINITIE NEN7777 Mate van overeenstemming tussen de resultaten van opeenvolgende metingen van dezelfde meetgrootheid, die onder dezelfde meetomstandigheden zijn verricht [NPR 2814]. OPM Bij het vaststellen van de herhaalbaarheid van een analyse moet worden bepaald in hoeverre de analyse (on)gevoelig is voor de variaties die in de wijze van uitvoering onder routinematige omstandigheden kunnen optreden. In de praktijk betekent dit dat nagegaan moet worden of en in hoeverre er spreiding in de uitslagen van de analyses voorkomt bij de uitvoering binnen één laboratorium, door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur. OPM De herhaalbaarheid van een PCR wordt vastgesteld door 8x een deelmonster uit een groot homogeen positief laboratoriummonster te analyseren (zowel DNA/RNA extractie alsook RT-PCR). De herhaalbaarheid van bijv. het opspoelen van grondmonsters, zou kunnen worden vastgesteld (is nl. niet altijd mogelijk of zinvol) door 8x een deelmonster uit een groot homogeen monster te analyseren. DEFINITIE TDVDP Mate van overeenstemming tussen de resultaten van opeenvolgende metingen van dezelfde meetgrootheid, die onder dezelfde omstandigheden door dezelfde persoon op één lab zijn verricht in een bepaalde tijdspanne..

(18) 12 UITWERKING De herhalingen (n ≥8) worden binnen een lab, door dezelfde persoon op hetzelfde apparaat uitgevoerd. De herhaalbaarheid wordt bepaald door identieke (goed gehomogeniseerde) praktijkmonsters (of 8 submonsters van één goed gehomogeniseerd praktijkmonster) in één meetserie (reeks) te onderzoeken. In de dagelijkse praktijk wordt de herhaalbaarheid van analyses continu gemeten. Aan de hand van verschillen in de waarnemingen wordt de spreiding van de meting bepaald. Zie ook Tabel 1 en 2.. Reproduceerbaarheid DEFINITIE NEN7777 Mate van overeenstemming tussen de meetresultaten van dezelfde meetgrootheid, verkregen onder wisselende meetomstandigheden [NPR 2814]. OPM De reproduceerbaarheid die in officiële validatierapporten genoemd staat, is meestal bepaald aan de hand van een intralaboratoriumonderzoek dat is uitgevoerd conform ISO 5725 (dit is voor plantpathogenen vaak niet mogelijk. Een andere mogelijkheid is de interlaboratorium-reproduceerbaarheid vast te stellen op basis van een aantal bepalingen uitgevoerd op natuurlijk geïnfecteerde monsters op verschillende laboratoria op verschillende tijdstippen. DEFINITIE TDVDP Mate van overeenstemming tussen de meetresultaten van dezelfde meetgrootheid, verkregen onder wisselende, gespecificeerde, omstandigheden bij voorkeur door verschillende personen binnen één lab. UITWERKING Binnen één lab wordt de reproduceerbaarheid bepaald door de analyses te laten uitvoeren op verschillende dagen en indien mogelijk ook door verschillende personen. Goed gehomogeniseerde praktijkmonsters (met een voldoende concentratie van het aan te tonen pathogeen) of controlemonsters, waaraan een bekende hoeveelheid pathogeen is toegevoegd, worden hiervoor gebruikt. Zie ook Tabel 1 en 2.. Specificiteit DEFINITIE NEN7777 Geen definitie in NEN7777, maar wel een opmerking: Specificiteit is een term die op een andere wijze hetzelfde fenomeen beschrijft als selectiviteit. OPM Identificatie van organismen/pathogenen en het vaststellen van verwantschappen tussen organismen/ pathogenen wordt uitgevoerd door het vaststellen van morfologische, biochemische en recentelijk ook moleculaire kenmerken, vaak sequenties. Met behulp van dergelijke kenmerken kan dus ook aangegeven worden welk organisme nauw verwant is aan het te detecteren organisme en waarvan verwacht kan worden dat er een (theoretische) mogelijkheid is op een kruisreactie in de analyse. Daarnaast komen in een bepaald gewas ook andere niet direct taxonomisch verwante pathogenen (organismen) voor (bijv. menginfecties met meerdere virussen). Dan moet een mogelijke kruisreactie in de te valideren analyse met deze pathogenen (organismen) worden uitgesloten. Ook de variatie binnen de soort moet goed worden bekeken. Toont de analyse alle varianten (serotypen) aan binnen de soort? Voor PCR dient derhalve ook sequentie informatie voor meerdere isolaten van het doelorganisme beschikbaar te zijn. We hebben het hier over analytische specificiteit. In de diagnostiek wordt vaak gesproken over diagnostische sensitiviteit / specificiteit, waarin: • Diagnostische sensitiviteit = A/(A+C); waarin A = # echt positieven en C = # vals negatieven • Diagnostische specificiteit = D/(D+ B); waarin B = # vals positieven en D = # echt negatieven Deze worden bepaald aan de hand van een gouden standaard. De gouden standaard is een analyse (of een combinatie van analyses) die algemeen geaccepteerd wordt/worden. Criteria dienen hiervoor te worden vastgelegd..

(19) 13 DEFINITIE TDVDP Specificiteit is het vermogen van een detectiemethode om het pathogeen te onderscheiden van andere, (al dan niet) verwante organismen en de mate waarin de analyse (bekende) varianten van het organisme kan onderscheiden. UITWERKING Voer de analyse (indien mogelijk c.q. van toepassing) uit op een aantal varianten (isolaten) van de soort en ook op een aantal fylogenetisch nauwverwante soorten. Ga uit van bestaande kennis en stel vast welke andere plantpathogenen kunnen voorkomen in het te testen gewas. Test de meest voorkomende organismen hiervan. Zie ook Tabel 1 en 2.. Selectiviteit DEFINITIE NEN7777 Afhankelijkheid van het meetresultaat van een andere grootheid dan de meetgrootheid [ISO 6879]. OPM Plantpathogenen komen vaak in meerdere gewassen en/of cultivars van een gewas voor. In de praktijk moet er rekening gehouden worden met het feit dat die verschillende gewassen of zelfs cultivars invloed uit kunnen oefenen op de betrouwbaarheid van de uitslag van de analyse. In feite gaat het hier om het vaststellen van de mogelijke invloed van het materiaal waar het pathogeen in aangetoond moet worden (‘de matrix’) op de betrouwbaarheid van de analyse-uitslag. Selectiviteit dient niet verwisseld te worden met specificiteit. Selectiviteit slaat alleen op de matrix en specificiteit slaat op het organisme. Welke achtergrond is er mogelijk? Is belangrijk te bepalen bij een eigen/nieuwe methode. DEFINITIE TDVDP Selectiviteit is het vermogen van een detectiemethode om het pathogeen te onderscheiden van andere componenten van het monster (matrixeffecten). UITWERKING Bepaal gezondwaarde voor verschillende cultivars van het te analyseren gewas. Bepaal bovendien de invloed van de matrix na toevoegen van het positieve monster aan sap van diverse cultivars van het gewas. Zie ook Tabel 1 en 2.. Meetbereik (werkgebied, bereik) DEFINITIE NEN7777 Geen. OPM Dit prestatiekenmerk wordt vaak door de gebruiker en klant samen bepaald. Het meetbereik is gedefinieerd voor de ''gehele’ meetmethode (alle verschillende stappen van de methode tezamen). Als verdunning van het monster een expliciet onderdeel is van de vastgelegde meetmethode, dan behoort dit bij kwantificering van het meetbereik te worden inbegrepen. In sommige analyses werkt de analyse niet naar behoren onder/of boven een bepaalde concentratie van het pathogeen. Het is derhalve noodzakelijk vast te stellen binnen welk bereik (onder- en bovengrens) de analyse functioneert. Zuiver referentiemateriaal of geïnfecteerd praktijkmateriaal is hiervoor noodzakelijk. DEFINITIE TDVDP Grenzen waarbinnen de analyse betrouwbaar kan worden toegepast..

(20) 14 UITWERKING Test m.b.v. verdunningen in de matrix binnen welke grenzen (onder- en bovengrens) de test voldoet. Zie ook Tabel 1 en 2.. Meetonzekerheid DEFINITIE NEN7777 In verband met het resultaat van een meting staande parameter die de spreiding van waarden, die redelijkerwijs aan de meetgrootheid kunnen worden toegekend, karakteriseert [NPR 2814]. OPM Dit is voor kwantitatieve analyses van belang. Bij de detectie van plantpathogenen is het niet mogelijk of zinvol de meetonzekerheid van kwalitatieve verrichtingen te bepalen, omdat de exacte concentratie van de plantpathogenen vaak niet of nauwelijks nauwkeurig vast te stellen is (zie aantoonbaarheidsgrens). DEFINITIE TDVDP Onzekerheid van het resultaat van de meting. UITWERKING Voor de bepaling van de meetonzekerheid van detectiemethoden voor plantpathogenen verwijzen wij naar de ontwerpnormen 7779 (milieu-onzekerheid van meetresultaten) en 8004 (microbiologie-onzekerheid van meetresultaten). Zie ook Tabel 1 en 2.. Modelafwijking DEFINITIE NEN7777 Afwijking van het aangenomen verband tussen meetgrootheid en meetsignaal. OPM Modelafwijking is alleen relevant in geval van een kwantitatieve analysemethode waarbij de concentratie van het te bepalen pathogeen exact bekend is. Kan dus wel voor bijv. aantal cysten of sporen maar niet voor concentratie virus. NEN7777: Modelafwijking alleen vast te stellen aan de hand van een kalibratiestandaard. Als deze niet te koop is (bijna altijd) dan moet zelf een standaard worden gemaakt/bepaald (bijv. cysten toevoegen aan grond). DEFINITIE TDVDP De afwijking van de gevonden waarde t.o.v. de standaardwaarde. UITWERKING Je maakt zelf de standaard m.b.v. een bekende hoeveelheid/concentratie van het pathogeen in een bepaalde matrix. Dan stel je proefondervindelijk vast wat de afwijking en de spreiding is in de analyse t.o.v. de standaard (op 8 verschillende dagen volgens NEN7777).. Robuustheid DEFINITIE NEN7777 Mate van ongevoeligheid van het meetresultaat voor afwijkingen in uitvoering, omstandigheden en hoedanigheid van materialen, zoals deze in de praktijk kunnen voorkomen. OPM In de plantpathogenensector is robuustheid een belangrijk prestatiekenmerk. Vooral bij de invoering van nieuwe (grootschalige) analyses moet aangetoond worden dat de analyse ongevoelig is voor variaties in uitvoering, personen, omstandigheden en hoedanigheid van materialen..

(21) 15 De mate waarin onbedoelde variaties in omstandigheden (die ook redelijkerwijs zouden kunnen optreden) invloed kunnen uitoefenen op de betrouwbaarheid van de analyses wordt vaak experimenteel onderzocht. De resultaten zijn nuttig bij het bepalen van de vereiste nauwkeurigheid van stoven, koelkasten, de samenstelling en pH van buffers, de condities van de monsters, de mate waarin ze bewaard kunnen worden etc. De stabiliteit van een virus in een bepaalde extractiebuffer kan erg variëren. Dit kan invloed hebben op de uitslag van de analyse, maar heeft in principe niets van doen met de validatie van de analyse. Het is wel belangrijk om de stabiliteit van het virus te weten. DEFINITIE TDVDP Mate van ongevoeligheid van het meetresultaat voor afwijkingen in uitvoering, omstandigheden en hoedanigheid van materialen. UITWERKING Schat in welke parameters van invloed zouden kunnen zijn op de uitslag van de analyse op het lab met de aanwezige apparatuur en het beschikbare personeel. Test met gehomogeniseerde laboratoriummonsters van natuurlijk geïnfecteerd of artificieel geïnoculeerd en gezond plantmateriaal in welke vorm variaties in deze parameters de uitslag beïnvloeden. Zie ook Tabel 1 en 2. De analyse is de monsterbereiding plus de extractie plus de uitvoering van de specifieke analyse (bijv. PCR, ELISA, etc.). Robuustheid heeft dan ook betrekking op alle stappen hiervan.. 3.2. Overzicht van overige definities. Analyse / Test De uitvoering van een methode om een bepaald target (in ons geval een bepaald plantpathogeen) aan te tonen. Bijv. DAS-ELISA voor PepMV in bladmateriaal van tomaat.. Analysemonster Monster dat conform de meetprocedure is bereid uit het laboratoriummonster.. Detectie Detectie is een activiteit die gericht is op het aantonen van de aanwezigheid (of afwezigheid) van een bepaald pathogeen waarvan bekend is of vermoed wordt dat het voorkomt. Dit kan zowel kwantitatief als ook kwalitatief. Routine-detectie heeft daarom de neiging om het onbekende over het hoofd te zien. In dit verband moet monitoring of screening gezien worden als detectie omdat men in zo’n geval op zoek gaat naar bepaalde pathogenen in plant en vector populaties of specifieke planten of vectoren in het kader van ecologische of epidemiologische studies. OPM Onderscheid dient te worden gemaakt tussen de diagnostiek of herkenning van een ziekteverwekker of parasiet als veroorzaker van een ziekte of beschadiging en de meestal routinematige detectie van een bekende ziekteverwekker of parasiet ten behoeve van kwaliteits- en gezondheidscertificering.. Diagnostiek Herkenning van ziekten en beschadigingen aan de hand van de voorgeschiedenis (anamnese) en van de karakteristieke symptomen en zoveel mogelijk op grond van de veroorzaker of oorzaak (etiologische diagnostiek, zie ook etiologie)..

(22) 16 OPM Vaak is het organisme dan al zuiver in handen. Is het organisme dat geïsoleerd is uit een geïnfecteerde plant echt het quarantaine-organisme of niet? In principe moeten de postulaten van Koch bewezen worden. Het is gewenst om in de gewasbescherming de termen diagnose en diagnostiek zoveel mogelijk te reserveren voor de herkenning van ziekten en beschadigingen. Voor het onderscheid tussen diagnostiek en detectie, zie toelichting aldaar.. Eigen methode (NEN7777) Een methode die door het laboratorium geheel zelf is ontwikkeld.. Etiologie Wetenschap van de oorzaken van een ziekte en van de aard en relaties daarvan met de waard. OPM Interpretaties van de term lopen uiteen van slechts het identificeren van de oorzaak van een ziekte tot het bestuderen van de hele opeenvolging van gebeurtenissen die leiden tot een ziekte.. Identificatie Bepalen van de identiteit van het organisme onder studie. OPM Vaak is het organisme dan al zuiver in handen. Is het organisme dat geïsoleerd is uit een geïnfecteerde plant echt het quarantaine-organisme of niet? In principe moeten de postulaten van Koch bewezen worden.. Laboratoriummonster Hoeveelheid voor onderzoek bestemd materiaal in de vorm en toestand waarin het is afgeleverd bij het laboratorium.. Methode Een methode beschrijft een procedure/werkwijze om een bepaald doel te bereiken. Een methode is een manier om iets te doen. Het woord komt van het Grieks methodos, met' hodos. Bijv. DAS-ELISA of PCR.. Methodiek Onder methodiek wordt verstaan een algemeen principe van methoden. Bijv. Immunologie of moleculaire methoden.. Monitoring Het op grootschalige wijze in kaart brengen van de aanwezigheid van een aantal organismen in plaats en tijd. Zie ook Detectie, Screening. OPM Monitoring wordt vaak uitgevoerd om in een bepaald gewas (of groep van gewassen) in een bepaald land de aanwezigheid van een bepaald organisme te bepalen (pest status)..

(23) 17. Referentiemethode (RvA T01) Hieronder wordt een methode verstaan die: • nationaal of internationaal door een normalisatie-instituut, het bevoegd gezag of vergelijkbaar, als methode is vastgesteld of, • binnen een branche als methode algemeen is geaccepteerd, of • is gepubliceerd in de (inter)nationale wetenschappelijke literatuur. Zie in deze context ook T001 van de RvA, vnl. met betrekking tot ‘conform referentiemethode’, ‘gelijkwaardig aan referentiemethode’ en ‘eigen methode’.. Screening Uitvoeren van detectie op een bepaald organisme in een groot aantal monsters. Zie ook Detectie, Monitoring.. Standaardmethode (NEN7777) Een door de gebruikersgroep geaccepteerde en gevalideerde methode.. 3.3. Validatiemateriaal. Voor het valideren van een detectiemethode voor een plantenpathogeen is het in handen hebben van het doelorganisme van eminent belang. Derhalve zijn in de wereld op verschillende plaatsen collecties aangelegd om groep(en) van organismen te bewaren (referentiemateriaal). Dit is echter geen garantie dat het gevraagde organisme verkrijgbaar is en dat de identiteit klopt. Validatie is dan ook niet altijd mogelijk. Voor het analyseren van plantpathogenen in plantmateriaal is niet altijd voldoende materiaal voor handen of niet op het juiste tijdstip in het jaar. Ook moet de verdeling van het pathogeen in het te analyseren materiaal meegenomen worden in aard en omvang van het monster. Een goede beoordeling van deze materie vereist vakkennis. Welke meetobjecten zijn nodig voor het validatie-onderzoek: a. De omvang van het labmonster is voldoende voor het verkrijgen van tenminste 2 analysemonsters. b. De omvang van het labmonster laat slechts één analyse toe. Aanbevolen wordt om mengmonsters te nemen i.v.m. niet-uniforme verdeling van het pathogeen in plantaardig materiaal en om voldoende materiaal (indien voorradig) te nemen voor meerdere analyses. Het mengmonster moet wel goed homogeen zijn zodat hieruit kan een submonster genomen worden voor verdere analyse. Bijvoorbeeld besmet bladmateriaal wordt voor homogenisatie gemengd en vermalen in vloeibare stikstof of in een buffer (uit bijv. een kit). Een submonster van 200 mg wordt gebruikt voor de RNA extractie (RT-PCR) of voor de ELISA. Tabel 6 (NEN7777) geeft aanvullende aanwijzingen bij de keuze van materiaal voor validatie. Voor plantpathogenen betreft het dan: • het organisme in een zuivere vorm, • plantmateriaal gespiked met het organisme of • natuurlijk of artificieel geïnfecteerd plantmateriaal. In onderstaande tabel is de volgorde van validatiemateriaal weergegeven..

(24) 18 Tabel 2.. Aanwijzingen bij de keuze van validatiemateriaal.. Prestatiekenmerk. Aanwijzingen Gebruik in volgorde van beschikbaarheid. Juistheid. a. representatief referentiemateriaal uit (inter)nationale collecties b. natuurlijk geïnfecteerd of geïnoculeerd plantmateriaal waarvan m.b.v. een andere test is vastgesteld dat het plantpathogeen aanwezig is. Aantoonbaarheidsgrens. a. gezonde gehomogeniseerde laboratoriummonsters uit de praktijk b. verdunningsreeks van gehomogeniseerde laboratoriummonsters met bekende concentratie (indien aantoonbaarheidsgrens = detectielimiet). Reproduceerbaarheid. a. gehomogeniseerde laboratoriummonsters (positieve en negatieve) uit de praktijk. Herhaalbaarheid Specificiteit (analytisch). a. meerdere isolaten van de targetsoort b. aan pathogeen verwante soorten afkomstig uit (referentie) collecties én c. overige organismen die voorkomen in het te analyseren gewas afkomstig uit (referentie)collecties. Selectiviteit. a. gehomogeniseerde laboratoriummonsters van natuurlijk geïnfecteerd of geïnoculeerd en gezond plantmateriaal van diverse cultivars van het te analyseren gewas. Robuustheid Meetbereik. a. verdunningsreeks van referentiemonsters (verdunningen maken in matrix van te analyseren gewas) b. verdunningsreeks van gehomogeniseerde laboratoriummonsters van natuurlijk of artificieel geïnfecteerd plantmateriaal; verdunningen maken in matrix van te analyseren gewas). Meetonzekerheid. a. gehomogeniseerde laboratoriummonsters (positieve en negatieve) uit de praktijk. Modelafwijking. a. standaard met bekende concentratie van het pathogeen in de matrix.

(25) 19. 4.. Rapportage. 4.1. Validatierapport. Het schrijven van een validatierapport staat in NEN 7777 goed omschreven. Vermeld in het validatierapport ten minste de volgende informatie: A) De gevalideerde meetprocedure of een ondubbelzinnige verwijzing ernaar. B) Een beschrijving van: a. het meetdoel (doeltreffendheid); b. de meetgrootheid; c. het meetobject; d. het toepassingsgebied (matrix/meetbereik); e. het meetresultaat, voor zover niet vervat in de meetprocedure. C) Een motivatie van het al dan niet betrekken in de validatie van prestatiekenmerken die niet verplicht zijn, maar waarvoor in deze norm een afweging van de relevantie wordt gevraagd. D) Een beschrijving van een eventuele opsplitsing in deeltoepassingsgebieden waarvoor afzonderlijk is gevalideerd, met motivatie. E) Een beschrijving van externe eisen die van toepassing zijn, met hun status (absolute limietwaarde, geschatte limietwaarde, standaardwaarde). F) Beschrijving van de proefopzet van het validatie-onderzoek, inclusief de onderzoeksperiode, en een beschrijving van de gebruikte laboratoriummonsters. G) De afwijking van deze norm. H) De oorspronkelijke meetresultaten. I) De gevolgde rekenwijze, indien deze niet ondubbelzinnig volgt uit deze norm. J) De berekende waarde van de prestatiekenmerken tezamen met de omstandigheden waarvoor deze geldig zijn, indien van toepassing. K) Optioneel: over deeltoepassingsgebieden heen geïntegreerde beschrijvingen van prestatiekenmerken*); L) De beoordeling van prestatiekenmerken tegen externe eisen; bij het ontbreken van externe eisen: een eigen inschatting van de doeltreffendheid van de methode voor het meetdoel. M) Een verwijzing naar norm NEN7777. N) De naam van de verantwoordelijke onderzoeker en de inrichting. *). Als er geen aanwijzingen zijn voor verschillen in de waarde van een prestatiekenmerk tussen verschillende deeltoepassingsgebieden (matrix/meetbereik), dan kan een gepoolde waarde worden berekend en gerapporteerd. Als er een functioneel verband tussen prestatiekenmerk en de waarde van de meetgrootheid kan worden aangenomen, dan kan dit verband worden gepresenteerd ten behoeve van het inschatten van het prestatiekenmerk bij andere niveaus dan de onderzochte.. In Bijlage 2 zijn twee validatierapporten weergegeven: • DAS-ELISA en RT-PCR voor Pepinomozaïekvirus in tomatenblad..

(26) 20.

(27) 21. 5.. Lijst met aanbevelingen. Het Toelichtend Document voor de Validatie van Detectiemethoden van Plantpathogenen en -aantasters is besproken met de Raad van Accreditatie (RvA). Deze onderstreept het belang van een dergelijk document en juicht de totstandkoming ervan nadrukkelijk toe. Zij raadt echter aan zorg te dragen voor regelmatig onderhoud en updating van het document. Wij delen deze aanbeveling en onderstrepen het belang ervan. Het Toelichtend Document dient onder zoveel mogelijk geïnteresseerden verspreid en onder hun aandacht gebracht te worden. Te denken valt aan Plantenziektenkundige Dienst, keuringsdiensten, instituten, laboratoria, veredelingsbedrijven, zaadbedrijven etc. In verband met verdere internationalisering dient het document in een Europees kader en wellicht verder verspreid te worden. Vertaling in het Engels maakt dat het een rol kan gaan spelen binnen Europa en Nederland hierin een belangrijke speler vormt. Derhalve bevelen wij krachtig de vertaling van dit document aan. Uit dit document mag het belang van referentiecollecties blijken. Wij onderstrepen derhalve de noodzaak tot het in stand houden van goede referentiecollecties voor plantpathogenen..

(28) 22.

(29) 23. Bijlage 1. Uitwerking Validatie schema Pepinomozaïekvirus (PepMV) B1.1. DAS-ELISA PepMV. 1.. Doel. Aantonen van de aanwezigheid van PepMV met behulp van een double-antibody sandwich (=DAS-ELISA, hierna te noemen ELISA) in bladsap geperst uit een tomatenblad. De meetgrootheid is de extinctie bij 405 nm (A405) zoals gemeten op een spectrofotometer.. 2.. DAS-ELISA. DAS-ELISA is een bekende en bestaande methodiek. Uitvoering volgens de standaard DAS-ELISA methode (zie Bijlage 1.3) m.b.v. een antiserum geproduceerd tegen de tomatenstam van het virus (Van der Vlugt et al., 2002). R.A.A. van der Vlugt, C. Cuperus, J. Vink, C.C.M.M. Stijger, D.-E. Lesemannn, J.Th.J. Verhoeven & J.W. Roenhorst (2002). Identification and characterization of Pepino mosaic virus in tomato. EPPO Bulletin 32: 503-508.. 3.. Te bepalen prestatiekenmerken. De uitslag van de ELISA-test zal kwalitatief geïnterpreteerd worden omdat het alleen gaat om het aantonen van de aanwezigheid van het virus in het bladmateriaal, niet om de exacte hoeveelheid. Aan de hand van het stroomdiagram (Fig. 1 uit 2.4) zijn de te bepalen prestatiekenmerken: 1. Juistheid 2. Aantoonbaarheidsgrens 3. Herhaalbaarheid 4. Reproduceerbaarheid Voor de volledigheid zal ook aangeven worden hoe de extra prestatiekenmerken die voor een nieuwe analyse gelden, bepaald worden. • Specificiteit • Selectiviteit • Meetbereik • Robuustheid De validatie van elk prestatiekenmerk wordt afgesloten met een conclusie.. 4.. Uitwerking prestatiekenmerken. Juistheid De definitie van juistheid is beschreven in 3.1. In de praktijk betekent dit dat je moet laten zien dat de test ook aantoont wat je aan wilt tonen. Wij stellen hier vast dat dit gedaan kan worden door het analyseren van referentiemateriaal aanwezig in bijv. binnenof buitenlandse referentiecollecties. We gebruiken in deze validatietesten het typemateriaal van de tomatenstam van PepMV (PD99901066, Van der Vlugt et al., 2002) zoals dat in de collectie van Plant Research International aanwezig.

(30) 24 is. Daarnaast dient ook steeds een negatieve controle meegenomen te worden. Hiervoor moet gebruik gemaakt worden van bladmateriaal dat afkomstig is van tomatenplanten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde tomatenplanten.. Uitvoering • • • • • • • • • • •. Maal PepMV geïnfecteerd tomatenblad 1: 10 (w/v) met ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3). Maal gezond tomatenblad 1: 10 (w/v) met ESB als negatieve controle. Maak een 2x verdunningsreeks (1:2; 1:4; t/m 1:128 (v/v)) in ESB vanuit beide bladsappen. Coat een ELISA plaat met een standaardverdunning van PepMV coating antiserum. Analyseer alle verdunningen op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning in duplo opgebracht wordt. Breng ter controle minimaal 8 monsters van de 1:2 verdunning van gezond bladsap op de plaat ter bepaling van de aantoonbaarheidsgrens. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol m.b.v. het standaard antiserum tegen de tomatenstam van PepMV (Prime Diagnostics). Bepaal de aantoonbaarheidsgrens (zijnde het gemiddeld van de gezond reeks plus 3x de standaarddeviatie van die reeks). Meet de A405 30 en 60 minuten na het inbrengen van het substraat. Bepaal de aanwezigheid van een positief signaal in de referentiemonsters en de afwezigheid van een positief signaal in het gezond controle materiaal. Bewijs m.b.v. een andere methode dat inderdaad het pathogeen aanwezig is in het bladmateriaal, bijv. RT-PCR.. Aantoonbaarheidsgrens De definitie van aantoonbaarheidsgrens is beschreven in 3.1. Hier wordt gesteld dat in een standaard DAS-ELISA als aantoonbaarheidsgrens geldt: de gemiddelde A405 van de gezonde controles met daarbij opgeteld 3x de standaarddeviatie van extinctiewaarden van de gezonde controlereeks.. Uitvoering • • • • • • • •. Maal gezond tomatenblad 1: 10 (w/v) met ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3) als negatieve controle. Maal PepMV geïnfecteerd bladmateriaal 1: 10 (w/v) met ESB. Maak een verdunningsreeks (1:10; 1:20 t/m 1:1280) in ESB vanuit beide bladsappen. Coat een ELISA plaat met PepMV coating (Prime Diagnostics) in de standaard verdunning. Analyseer alle verdunningen op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning van het gezond bladsap in 8-voud en elke verdunning van het ziek bladsap in duplo opgebracht wordt. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol. Meet de A405 10 en 30 minuten na het inbrengen van het substraat. Bepaal de aantoonbaarheidsgrens (zijnde het gemiddeld van de extinctiewaarden (A405) van de gezond reeks plus 3x de standaarddeviatie van de extinctiewaarden (A405) van die reeks ( AG = x + 3δ ).. Herhaalbaarheid De definitie van herhaalbaarheid is beschreven in 3.1. In de praktijk betekent dit dat de hele procedure voor de DAS-ELISA analyse binnen een lab en door dezelfde persoon diverse malen herhaald moet worden, om inzicht te krijgen in de mate van afwijking. De herhalingen moeten op verschillende dagen door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur, uitgevoerd worden. Gebruik voor de testen bij voorkeur geïnfecteerde (laboratorium)monsters uit de praktijk..

(31) 25 De NEN7777 norm geeft voor de herhaling van dit experiment een standaardschema (Tabel 18). Ga bij de bepaling van de herhaalbaarheid uit van analyse van 8 monsters op 8 verschillende dagen. Houdt er rekening mee dat het schema voorschrijft dat op bepaalde dagen een duplo-bepaling uitgevoerd moet worden (totaal 24 herhalingen).. Uitvoering • • • • • • • •. Maal PepMV geïnfecteerd tomatenblad 1: 10 (w/v) met ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3). Maal gezond tomatenblad 1: 10 (w/v) met ESB als negatieve controle. Maak een 2x verdunningsreeks (1:10; 1:20; t/m 1:1280) in ESB vanuit beide bladsappen. Coat een ELISA plaat met een standaardverdunning van PepMV coating antiserum (Prime Diagnostics). Analyseer alle verdunningen op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning in duplo opgebracht wordt. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol m.b.v. het standaard antiserum tegen de tomatenstam van PepMV (Prime Diagnostics). Meet de A405 10 en 30 minuten na het inbrengen van het substraat. Bepaal de aanwezigheid van een positief signaal in de referentiemonsters en de afwezigheid van een positief signaal in het gezond controle materiaal.. Reproduceerbaarheid De definitie van reproduceerbaarheid is beschreven in 3.1. In de praktijk betekent dit dat de hele procedure voor de DAS-ELISA test diverse malen herhaald moet worden, zonder dat de resultaten tussen de herhalingen mogen afwijken. De herhalingen moeten op verschillende dagen door verschillende mensen met eventueel verschillende apparatuur, uitgevoerd worden. Gebruik voor de testen bij voorkeur geïnfecteerde (laboratorium)monsters uit de praktijk.. Uitvoering • • • • • • • •. Maal PepMV geïnfecteerd tomatenblad 1: 10 (w/v) met ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3). Maal gezond tomatenblad 1: 10 (w/v) met ESB als negatieve controle. Maak een 2x verdunningsreeks (1:2; 1:4; t/m 1:128 (v/v)) in ESB vanuit beide bladsappen. Coat een ELISA plaat met een standaardverdunning van PepMV coating antiserum. Analyseer alle verdunningen op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning in duplo opgebracht wordt. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol m.b.v. het standaard antiserum tegen de tomatenstam van PepMV (Prime Diagnostics). Meet de A405 30 en 60 minuten na het inbrengen van het substraat. Bepaal de aanwezigheid van een positief signaal in de referentiemonsters en de afwezigheid van een positief signaal in het gezond controle materiaal.. NEN7777 geeft voor de herhaling van dit experiment een standaardschema (Tabel 18). Ga bij de bepaling van de reproduceerbaarheid uit van analyse van 8 monsters op 8 verschillende dagen. Houdt er rekening mee dat het schema voorschrijft dat op bepaalde dagen een duplo-bepaling (herhaalbaarheid) uitgevoerd moet worden.. Specificiteit De definitie van specificiteit is beschreven in 3.1. Analyseren op ‘specificiteit’ betekent dus dat aangetoond moet worden dat in de ELISA er: • positieve reacties optreden met de verschillende bekende stammen en isolaten van PepMV. Dit kan door analyse van referentiemateriaal aanwezig in bijv. binnenof buitenlandse referentiecollecties voor zover beschikbaar; • geen kruisreacties met verwante virussen; • geen kruisreactie optreedt met positieve controles van andere virussen die ook in tomaat voor kunnen komen. Dit kan door gebruik te maken van gecertificeerd antiserum. D.w.z. dat het antiserum dat gebruikt wordt voor de.

(32) 26 ELISA (coating en conjugaat) voorzien is van een kwaliteitscertificaat dat aantoont dat het geen kruisreactiviteit vertoont met andere tomatenvirussen. Indien er geen gecertificeerd antiserum beschikbaar is, zal een evt. kruisreactie met andere tomatenvirussen uitgesloten moeten worden door deze testen zelf uit te voeren. Hiervoor kan positieve controle materiaal gebruikt worden dat evt. van de leverancier van de antisera afgenomen wordt. Virussen waarop minimaal op kruisreactiviteit getest moet worden zijn: PVX, PAMV, TMV, ToMV, TSWV en CMV.. Uitvoering • • • • • • • • • • • •. Maal PepMV geïnfecteerd bladmateriaal 1: 10 (w/v) met ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3). Maal gezond tomatenblad 1: 10 (w/v) met ESB als negatieve controle. Maal geïnfecteerd materiaal 1:10 (w/v) van de te testen virussen in ESB of gebruik positieve controles van deze virussen (in dit voorbeeld gebruikt: PVX, PAMV, TMV, ToMV, TSWV, CMV, TAV en HVX). Maak een verdunningsreeks (1:10; 1:20, 1:40) in ESB vanuit de bladsappen. Coat een ELISA plaat met PepMV coating (Prime Diagnostics) in de standaard verdunning. Coat op de zelfde plaat ook putjes (wells) in de standaard verdunning met antiserum tegen de te testen virussen (4 putjes voor elk te testen virus). Analyseer alle verdunningen op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning in duplo in elke kolom opgebracht wordt. Breng ter controle minimaal 8 monsters van de 1:10 verdunning van gezond bladsap op de plaat ter bepaling van de aantoonbaarheidsgrens. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol. Bepaal de aantoonbaarheidsgrens (zijnde het gemiddelde van de gezonde reeks plus 3x de standaarddeviatie van die reeks). Meet de A405 10 en 30 minuten na het inbrengen van het substraat. Bepaal de afwezigheid van een positief signaal in het gezond controle materiaal en de evt. aanwezigheid van een positief signaal in de te analyseren monsters.. Selectiviteit De definitie van selectiviteit is beschreven in 3.1. Plantpathogenen komen vaak in meerdere gewassen en/of cultivars van een gewas voor. In de praktijk blijken die verschillende gewassen of zelfs cultivars hun invloed uit te oefenen op de betrouwbaarheid van de uitslag van de analyse. In feite gaat hier om het vaststellen van de mogelijke invloed van het materiaal waar het pathogeen in aangetoond moet worden (‘de matrix’) op de betrouwbaarheid van de analyse-uitslag. Je moet dus vaststellen dat er geen reactie met gezond tomatenblad optreedt. Dit is aan te tonen door in de ELISA bladmateriaal te testen dat afkomstig is van planten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde planten. Deze negatieve controle moet op elke ELISA plaat meegenomen worden.. Uitvoering • • • • • • • •. Maal gezond tomatenblad 1: 10 (w/v) met ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3) van minimaal 6 verschillende cultivars. Voeg aan dit gezond sap een hoeveelheid virus of ziek plantsap toe. Coat een ELISA plaat met PepMV coating (Prime Diagnostics) in de standaard verdunning. Analyseer gezond en gespiked bladsap op dezelfde ELISA-plaat waarbij elk monster in duplo opgebracht wordt. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol. Meet de A405 10 en 30 minuten na het inbrengen van het substraat. Vergelijk de verkregen waarden van alle reeksen. Bepaal in hoeverre de veranderingen in cultivar effect hebben op de meetwaarden..

(33) 27 Meetbereik De definitie van meetbereik is beschreven in 3.1. In de praktijk moet aangetoond worden dat extreem lage of hoge concentraties van het te analyseren pathogeen niet leiden tot grote afwijkingen in de betrouwbaarheid van de bepaling. Het is derhalve noodzakelijk vast te stellen binnen welk bereik (onder- en bovengrens) de analyse functioneert. Zuiver referentiemateriaal of geïnfecteerd praktijkmateriaal is hiervoor noodzakelijk. In feite kan het meetbereik alleen betrouwbaar bepaald worden als er een rechtstreekse vergelijking gemaakt kan worden tussen geïnfecteerd praktijkmateriaal en een verdunningsreeks van gezuiverd pathogeen. Uitvoering • • • • • • • • • • •. Maak van een gezuiverde oplossing van PepMV met bekende concentratie, een verdunningsreeks in ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3). Maal gezond tomatenblad 1:10 (w/v) met ESB als negatieve controle. Maal PepMV geïnfecteerd bladmateriaal 1: 10 (w/v) met ESB. Maak een verdunningsreeks in stappen van 2 (v/v) in ESB vanuit beide bladsappen. Coat een ELISA plaat met PepMV coating (Prime Diagnostics) in de standaard verdunning. Analyseer alle verdunningen van gezuiverd virus, gezond en ziek bladsap op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning in duplo opgebracht wordt. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol. Meet de A405 10 en 30 minuten na het inbrengen van het substraat Zet de gemeten verdunningen en bijbehorende A405 extinctiewaarden grafisch tegen elkaar uit en trek een lijn door de meetpunten van de verdunningsreeks van het gezuiverde virus. Bepaal bij de zeer lage verdunningen en de zeer hoge verdunningen in hoeverre de meetwaarden afwijken van de referentielijn voor het gezuiverde PepMV. Bepaal uit de analyses voor de bepaling van de herhaalbaarheid in hoeverre die meetwaarden voor PepMV binnen het lineaire deel van de meetbereikcurve vallen.. Robuustheid De definitie van robuustheid is beschreven in 3.1. In de praktijk betekent dit dat aangetoond moet worden dat de betrouwbaarheid van de meetresultaten niet aangetast wordt door (kleine) afwijkingen van het standaardprotocol. In principe is dit te meten door onder wisselende omstandigheden steeds een verdunningsreeks van gezuiverd virus op dezelfde ELISA-plaat te vergelijkingen met een verdunningsreeks van een of meerdere praktijkmonsters. Uitvoering • • • • • • • • • •. Maak van een gezuiverde oplossing van PepMV met bekende concentratie, een verdunningsreeks in ELISA Sample Buffer (ESB; zie Bijlage 1.3). Maal gezond tomatenblad 1: 1 (w/v) met ESB als negatieve controle. Maal PepMV geïnfecteerd bladmateriaal 1: 1 (w/v) met ESB. Maak een verdunningsreeks in stappen van 2 (v/v) in ESB vanuit beide bladsappen. Coat een ELISA plaat met PepMV coating (Prime Diagnostics) in de standaard verdunning. Analyseer alle verdunningen van gezuiverd virus, gezond en ziek bladsap op dezelfde ELISA-plaat waarbij elke verdunning in duplo opgebracht wordt. Voer de ELISA uit volgens het standaard protocol. Meet de A405 30 en 60 minuten na het inbrengen van het substraat. Vergelijk de verkregen waarden van alle reeksen verkregen onder wisselende omstandigheden. Bepaal in hoeverre de veranderingen in omstandigheden en/of uitvoering effect hebben op de meetwaarden..

(34) 28. 5.. Verslaglegging en verantwoording. Als onderdeel van het validatierapport moeten de testen voor het vaststellen van de verschillende prestatiekenmerken, zoals die aan de hand van bovenstaand validatieschema vastgesteld zijn, uitgewerkt en toegelicht worden. Met name wat de uitslag van de bepaling van het prestatiekenmerk betekent voor de routinematige toepassing van de analyseanalyse, verdient aandacht. Elke bepaling van het prestatiekenmerk wordt afgesloten met een conclusie.. 6.. Eindconclusie. Stel op basis van de resultaten van de bepalingen voor alle bepaalde prestatiekenmerken een eindconclusie op..

(35) 29. B1.2. RT-PCR PepMV. 1.. Doel. Aantonen van de aanwezigheid van PepMV met behulp van een Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) in tomatenblad. De meetgrootheid is de aanwezigheid van een PCR-product van de juiste grootte zoals bepaald m.b.v. agarosegelelectroforese gevolgd door kleuring van het DNA m.b.v. ethidiumbromide.. 2.. RT-PCR. RT-PCR is een bekende en bestaande methodiek. Uitvoering volgens de procedure zoals beschreven in Verhoeven et a.l, 2003. De RT-PCR methode voor PepMV wordt derhalve beschouwd al een referentiemethode. Als primercombinatie in de RT-PCR wordt echter gebruikt gemaakt van de volgende primers: 1e strengs cDNA primer: 5’-CTGTATTGGGATTTGAGAAGTC -3’ (PepMV-15RC) 2e strengs PCR primer: 5’-GTCCCACATTACACTTCCTTCAG – 3’ (PepMV-11) Deze primercombinatie levert na amplificatie een DNA-een fragment van 973 bp op. J.Th.J. Verhoeven, R.A.A. van der Vlugt & J.W. Roenhorst (2003). High similarity between tomato isolates of Pepino mosaic virus suggest a common origin. European Journal of Phytopathology 109: 419-425.. 3.. Te bepalen prestatiekenmerken. De uitslag van de RT-PCR-test zal kwalitatief geïnterpreteerd worden omdat het alleen gaat om het aantonen van de aanwezigheid van het virus in het bladmateriaal, niet om de exacte hoeveelheid. De te bepalen prestatiekenmerken zijn: • Juistheid • Aantoonbaarheidsgrens • Reproduceerbaarheid • Herhaalbaarheid Voor de volledigheid zal ook aangeven worden hoe een aantal extra prestatiekenmerken die voor een nieuwe analyse gelden, bepaald worden. • Selectiviteit • Specificiteit. 4.. Uitwerking prestatiekenmerken. In deze test wordt alleen de aan- of afwezigheid van een PepMV specifiek PCR-product op gel bepaald als respectievelijk positief of negatief. Indien de uitslag van de test niet duidelijk genoeg is omdat het PCR-product op de gel niet duidelijk genoeg zichtbaar is, wordt de uitslag als dubieus beoordeeld. De beoordeling dient altijd door twee personen uitgevoerd te worden.. Juistheid De definitie van juistheid is beschreven in 3.1. In de praktijk betekent dit dat je moet laten zien dat de test ook aantoont wat je aan wilt tonen. Juistheid van de PCR-methode kan zowel theoretisch (‘in–silico’) als in de praktijk gecontroleerd worden bijv. aan de hand van referentiemateriaal, aanwezig in bijv. binnenof buitenlandse referentiecollecties. We gebruiken in deze validatietesten het typemateriaal van de tomatenstam van PepMV (PD99901066, Van der Vlugt et al., 2002) zoals dat in de collectie van Plant Research International aanwezig is. Daarnaast dient ook steeds een negatieve controle.

(36) 30 meegenomen te worden. Hiervoor moet gebruik gemaakt worden van bladmateriaal dat afkomstig is van tomatenplanten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde tomatenplanten. In de praktijk betekent dit dat je moet laten zien dat de test ook aantoont wat je aan wilt tonen. Juistheid van de PCR-methode kan in de praktijk gecontroleerd worden bijv. aan de hand van referentiemateriaal, aanwezig in bijv. binnenof buitenlandse referentiecollecties. We gebruiken in deze validatietesten het typemateriaal van de tomatenstam van PepMV (PD99901066, Van der Vlugt et al., 2002) zoals dat in de collectie van Plant Research International aanwezig is. Daarnaast dient ook steeds een gezonde controle meegenomen te worden. Hiervoor moet gebruik gemaakt worden van bladmateriaal dat afkomstig is van tomatenplanten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde tomatenplanten.. Uitvoering Op bladmateriaal afkomstig uit de referentiecollectie van Plant Research International en geïnfecteerd met de tomatenstam van PepMV, werd volgens voorschrift een standaard RT-PCR uitgevoerd op de aanwezigheid van PepMV. Dit geldt voor de gehele procedure inclusief RNA-extractie. Dezelfde standaard RT-PCR werd ook uitgevoerd op gezond tomatenblad (= gezonde controle). Bewijs m.b.v. een andere methode dat inderdaad het pathogeen aanwezig is in het bladmateriaal, bijv. DAS-ELISA.. Aantoonbaarheidsgrens De definitie van aantoonbaarheidsgrens is beschreven in 3.1. In tegenstelling tot dat wat bij DAS-ELISA gesteld is, is het bepalen van het gemiddelde van deze PCR op gezonde controles onmogelijk. In dit geval is de aantoonbaarheidsgrens ook te interpreteren als een detectielimiet of als de analytische sensitiviteit. Voor de RT-PCR test vast te stellen door een vergelijking met aantoonbaarheidsgrens van een referentietest, in dit geval de DAS-ELISA. Dit kan door in analogie met de DAS-ELISA test te bepalen bij welke verdunning van het bladmateriaal de uitslag van de analyse negatief wordt. Omdat de extractie van RNA uit het bladmateriaal een vast onderdeel van de RT-PCR analyse is, moet het gehele RT-PCR protocol worden toegepast op alle verdunningen uit de verdunningsreeks en/of positief materiaal in negatieve matrix.. Uitvoering • • • •. In analogie met de test voor de DAS-ELISA wordt een verdunningsreeks gemaakt uitgaande van RNA gezuiverd uit onverdund bladsap. De verdunningsreeks wordt m.b.v. de standaard RT-PCR methode geanalyseerd op de aanwezigheid van een PCR-product van de juiste grootte. De uiterste verdunning van het RNA die nog als positief kan worden benoemd in de RT-PCR wordt bepaald. De hoogste verdunningen die nog positief zijn in de RT-PCR analyse en in de DAS-ELISA.. Uit deze test komt een vergelijking van waarden tussen de RT-PCR analyse en een referentiemethode (in dit geval DAS-ELISA).. Herhaalbaarheid / Reproduceerbaarheid De definitie van herhaalbaarheid / reproduceerbaarheid is beschreven in 3.1. In de praktijk betekent dit dat de hele procedure voor de RT-PCR analyse diverse malen herhaald moet worden. De herhalingen moeten op verschillende dagen door verschillende mensen met evt. verschillende apparatuur, uitgevoerd worden. Gebruik voor de testen bij voorkeur besmette (laboratorium)monsters uit de praktijk..

No results found