1. Doel
Aantonen van de aanwezigheid van PepMV met behulp van een Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) in tomatenblad. De meetgrootheid is de aanwezigheid van een PCR-product van de juiste grootte zoals bepaald m.b.v. agarose- gelelectroforese gevolgd door kleuring van het DNA m.b.v. ethidiumbromide.
2. RT-PCR
RT-PCR is een bekende en bestaande methodiek. Uitvoering volgens de procedure zoals beschreven in Verhoeven
et a.l, 2003. De RT-PCR methode voor PepMV wordt derhalve beschouwd al een referentiemethode. Als primer- combinatie in de RT-PCR wordt echter gebruikt gemaakt van de volgende primers:
1e strengs cDNA primer: 5’-CTGTATTGGGATTTGAGAAGTC -3’ (PepMV-15RC) 2e strengs PCR primer: 5’-GTCCCACATTACACTTCCTTCAG – 3’ (PepMV-11)
Deze primercombinatie levert na amplificatie een DNA-een fragment van 973 bp op.
J.Th.J. Verhoeven, R.A.A. van der Vlugt & J.W. Roenhorst (2003). High similarity between tomato isolates of Pepino mosaic virus suggest a common origin. European Journal of Phytopathology 109: 419-425.
3.
Te bepalen prestatiekenmerken
De uitslag van de RT-PCR-test zal kwalitatief geïnterpreteerd worden omdat het alleen gaat om het aantonen van de aanwezigheid van het virus in het bladmateriaal, niet om de exacte hoeveelheid.
De te bepalen prestatiekenmerken zijn: • Juistheid
• Aantoonbaarheidsgrens • Reproduceerbaarheid • Herhaalbaarheid
Voor de volledigheid zal ook aangeven worden hoe een aantal extra prestatiekenmerken die voor een nieuwe analyse gelden, bepaald worden.
• Selectiviteit • Specificiteit
4. Uitwerking prestatiekenmerken
In deze test wordt alleen de aan- of afwezigheid van een PepMV specifiek PCR-product op gel bepaald als respec- tievelijk positief of negatief. Indien de uitslag van de test niet duidelijk genoeg is omdat het PCR-product op de gel niet duidelijk genoeg zichtbaar is, wordt de uitslag als dubieus beoordeeld. De beoordeling dient altijd door twee personen uitgevoerd te worden.
Juistheid
De definitie van juistheid is beschreven in 3.1.
In de praktijk betekent dit dat je moet laten zien dat de test ook aantoont wat je aan wilt tonen.
Juistheid van de PCR-methode kan zowel theoretisch (‘in–silico’) als in de praktijk gecontroleerd worden bijv. aan de hand van referentiemateriaal, aanwezig in bijv. binnen- of buitenlandse referentiecollecties. We gebruiken in deze validatietesten het typemateriaal van de tomatenstam van PepMV (PD99901066, Van der Vlugt et al., 2002) zoals dat in de collectie van Plant Research International aanwezig is. Daarnaast dient ook steeds een negatieve controle
meegenomen te worden. Hiervoor moet gebruik gemaakt worden van bladmateriaal dat afkomstig is van tomatenplanten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde tomatenplanten.
In de praktijk betekent dit dat je moet laten zien dat de test ook aantoont wat je aan wilt tonen.
Juistheid van de PCR-methode kan in de praktijk gecontroleerd worden bijv. aan de hand van referentiemateriaal, aanwezig in bijv. binnen- of buitenlandse referentiecollecties. We gebruiken in deze validatietesten het typemateriaal van de tomatenstam van PepMV (PD99901066, Van der Vlugt et al., 2002) zoals dat in de collectie van Plant Research International aanwezig is. Daarnaast dient ook steeds een gezonde controle meegenomen te worden. Hiervoor moet gebruik gemaakt worden van bladmateriaal dat afkomstig is van tomatenplanten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde tomatenplanten.
Uitvoering
Op bladmateriaal afkomstig uit de referentiecollectie van Plant Research International en geïnfecteerd met de tomatenstam van PepMV, werd volgens voorschrift een standaard RT-PCR uitgevoerd op de aanwezigheid van PepMV. Dit geldt voor de gehele procedure inclusief RNA-extractie. Dezelfde standaard RT-PCR werd ook uitgevoerd op gezond tomatenblad (= gezonde controle).
Bewijs m.b.v. een andere methode dat inderdaad het pathogeen aanwezig is in het bladmateriaal, bijv. DAS-ELISA.
Aantoonbaarheidsgrens
De definitie van aantoonbaarheidsgrens is beschreven in 3.1.
In tegenstelling tot dat wat bij DAS-ELISA gesteld is, is het bepalen van het gemiddelde van deze PCR op gezonde controles onmogelijk. In dit geval is de aantoonbaarheidsgrens ook te interpreteren als een detectielimiet of als de analytische sensitiviteit. Voor de RT-PCR test vast te stellen door een vergelijking met aantoonbaarheidsgrens van een referentietest, in dit geval de DAS-ELISA.
Dit kan door in analogie met de DAS-ELISA test te bepalen bij welke verdunning van het bladmateriaal de uitslag van de analyse negatief wordt.
Omdat de extractie van RNA uit het bladmateriaal een vast onderdeel van de RT-PCR analyse is, moet het gehele RT-PCR protocol worden toegepast op alle verdunningen uit de verdunningsreeks en/of positief materiaal in nega- tieve matrix.
Uitvoering
• In analogie met de test voor de DAS-ELISA wordt een verdunningsreeks gemaakt uitgaande van RNA gezuiverd uit onverdund bladsap.
• De verdunningsreeks wordt m.b.v. de standaard RT-PCR methode geanalyseerd op de aanwezigheid van een PCR-product van de juiste grootte.
• De uiterste verdunning van het RNA die nog als positief kan worden benoemd in de RT-PCR wordt bepaald. • De hoogste verdunningen die nog positief zijn in de RT-PCR analyse en in de DAS-ELISA.
Uit deze test komt een vergelijking van waarden tussen de RT-PCR analyse en een referentiemethode (in dit geval DAS-ELISA).
Herhaalbaarheid / Reproduceerbaarheid
De definitie van herhaalbaarheid / reproduceerbaarheid is beschreven in 3.1.
In de praktijk betekent dit dat de hele procedure voor de RT-PCR analyse diverse malen herhaald moet worden. De herhalingen moeten op verschillende dagen door verschillende mensen met evt. verschillende apparatuur, uitgevoerd worden. Gebruik voor de testen bij voorkeur besmette (laboratorium)monsters uit de praktijk.
NEN7777 geeft voor de uitvoering een standaardschema (Tabel 18). Ga bij de bepaling van de herhaalbaarheid uit van analyse van 8 monsters op 8 verschillende dagen. Houdt er rekening mee dat het schema voorschrijft dat op bepaalde dagen een duplo-bepaling uitgevoerd moet worden.
Uitvoering
Voer op 8 deelmonsters op 8 verschillende dagen, uit een groot praktijkmonster besmet met PepMV volgens voor- schrift een standaard RT-PCR uit de aanwezigheid van PepMV. Dit geldt voor de gehele procedure inclusief RNA- extractie. Ga uit van een groot mengmonster dat in acht submonsters verdeeld wordt. De testen dienen door verschillende personen uitgevoerd te worden op verschillende laboratoria. Hierbij wordt dan steeds verschillende apparatuur gebruikt. Tegelijk wordt met elk besmet deelmonster ook een gezond controle monster, afkomstig van een gezonde tomatenplant, meegenomen in de analyse.
Specificiteit
De definitie van specificiteit is beschreven in 3.1.
In de praktijk is specificiteit nauw verbonden met (maar niet gelijk aan) selectiviteit;
‘
het vermogen van een detectie- methode om het pathogeen te onderscheiden van andere componenten van het monster (matrixeffecten).’De specificiteit moet op twee manieren onderzocht worden. Ten eerste de theoretische mogelijkheid dat de te gebruiken primers een vals positieve reactie met niet-viraal RNA zullen geven. Dit kan ‘in silico’ gedaan worden en geeft een indicatie van de te verwachten kruisreacties.
De tweede manier is in de praktijk waarbij de afwezigheid van een vals-positief signaal met verwante virussen en niet verwante virussen uit tomaat ook geverifieerd wordt.
Met betrekking tot specificiteit is het echter ook belangrijk na te gaan in hoeverre bekende isolaten en stammen van het te analyseren pathogeen reageren in de analyse.
Uitvoering
In silico
VergelijkdetegebruikerprimersviaeenBLASTsearchopdeEMBL-EBIserver
(http://www.ebi.ac.uk/blastall/index.html) op mogelijke homologieën met verwante of niet verwante sequenties en stel het aantal matches en mismatches vast met andere verwante sequenties, aanwezig in de NCBI database.
Praktijktest
A. Reactie met isolaten en stammen van PepMV
Ga na of er inderdaad positieve reacties optreden met de verschillende bekende stammen en isolaten van PepMV. Dit kan door analyseren van referentiemateriaal aanwezig in bijv. binnen- of buitenlandse referentiecollecties voor zover beschikbaar.
B. Reactie met andere tomatenvirussen
Betrek referentiemateriaal uit de viruscollectie van Plant Research International van de volgende virussen die wel in tomaat voor kunnen komen maar niet hetzelfde zijn als PepMV:
Potato virus X (PVX), Tomato mosaic virus (ToMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Potato aucuba mosaic virus (PAMV),
Cucumber mosaic virus (CMV), Tomato aspermy virus (TAV) en Tomato spotted wilt virus (TSWV).
Extraheer uit dit referentiemateriaal totaal RNA en voer hierop een standaard RT-PCR m.b.v. de PepMV specifieke primers uit volgens Bijlage 4.2. (NEN7777 geeft in Tabel 18 maar één test aan, geen herhalingen).
Selectiviteit
De definitie van selectiviteit is beschreven in 3.1.
Plantpathogenen komen vaak in meerdere gewassen en/of cultivars van een gewas voor. In de praktijk blijken die verschillende gewassen of zelfs cultivars hun invloed uit te oefenen op de betrouwbaarheid van de uitslag van de analyse. In feite gaat hier om het vaststellen van de mogelijke invloed van het materiaal waar het pathogeen in aangetoond moet worden (‘de matrix’) op de betrouwbaarheid van de analyse-uitslag. Je moet dus vaststellen dat er geen reactie met gezond tomatenblad optreedt. Dit is aan te tonen door in de RT-PCR bladmateriaal te testen dat afkomstig is van planten die onder virusvrije omstandigheden zijn opgekweekt uit zaad van gezonde planten. Deze negatieve controle moet binnen elk experiment meegenomen worden.
Uitvoering
Extraheer uit gezond tomatenblad totaal RNA en voer hierop een standaard RT-PCR uit. (NEN7777 geeft in Tabel 18 maar één test aan, geen herhalingen). Controleer m.b.v. agarose-gelelectroforese de afwezigheid van een PCR product.
Robuustheid
De definitie van robuustheid is beschreven in 3.1.
In de praktijk betekent dit dat aangetoond moet worden dat de betrouwbaarheid van de meetresultaten niet aange- tast wordt door (kleine) afwijkingen van het standaardprotocol. In principe is dit te meten door in de uitvoering van de RT-PCR analyse opzettelijk veranderingen aan te brengen en na te gaan in hoeverre die van invloed zijn op de uitslag. Hierbij dient steeds het standaardprotocol en een positief virus monster als referentie.
Voorbeelden van afwijkingen in het standaardprotocol die geanalyseerd zouden kunnen worden: • Pipetteerfouten: hierbij worden bewust afwijkingen aangebracht in de volumina van RT-mix en RNA.
• Batches RT-PCR kit: analyseer de invloed die verschillende batches RT-PCR kit kunnen hebben op de uitslag van de analyse.
• PCR apparatuur: ga na of verschillende PCR apparaten invloed hebben op de uitslag van de analyse.
Afhankelijk van de individuele situatie kunnen andere aandachtspunten geanalyseerd worden.
5.
Verslaglegging en verantwoording
Alsonderdeelvanhetvalidatierapportmoetendetestenvoorhetvaststellenvandeverschillendeprestatiekenmerken, zoals die aan de hand van bovenstaand validatieschema vastgesteld zijn, uitgewerkt en toegelicht worden. Met name wat de uitslag van de bepaling van het prestatiekenmerk betekent voor de routinematige toepassing van de analyse- analyse, verdient aandacht.
Elke bepaling van het prestatiekenmerk wordt afgesloten met een conclusie.