Datum rapportage : november 2006
Periode van uitvoering : september – oktober 2006 Uitgevoerd door : M. de Weerdt, R. van der Vlugt
Pepinomozaïekvirus (PepMV) is een virusziekte die hoofdzakelijk op tomaat kan worden aangetroffen. Het virus heeft een quarantainestatus op tomatenzaad. Volgens EU-richtlijn 2004/200/EC moeten handelspartijen zaad aantoon- baar vrij zijn van het virus. Aantonen van het virus kan middels een klassieke DAS-ELISA dan wel een RT-PCR. DAS- ELISA is een serologische methodiek waarmee de aanwezigheid van het manteleiwit van het virus vastgesteld kan worden.
Inleiding
Pepinomozaïekvirus (PepMV) is een virusziekte die hoofdzakelijk op tomaat kan worden aangetroffen. Het is geen officieel quarantaine organisme maar staat wel op de EPPO Alert list. Volgens EU-richtlijn 2004/200/EC moeten handelspartijen zaad aantoonbaar vrij zijn van het virus. Aantonen van het virus kan middels een klassieke DAS-ELISA dan wel een RT-PCR. DAS-ELISA is een serologische methode waarmee de aanwezigheid van het manteleiwit van het virus vastgesteld kan worden. RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) is een detectietechniek waarmee de aanwezigheid van het viraal RNA, het genetisch materiaal van het virus, vastgesteld kan worden.
De RT-PCR test voor het aantonen van Pepinomozaïekvirus (PepMV) in tomatenblad wordt uitgevoerd volgens de procedure zoals beschreven in Verhoeven et al., 2003. (J.Th.J. Verhoeven, R.A.A. van der Vlugt & J.W. Roenhorst, 2003). High similarity between tomato isolates of Pepino mosaic virus suggest a common origin. European Journal of Phytopathology 109: 419-425.)
Als primercombinatie in de RT-PCR wordt echter gebruikt gemaakt van de volgende primers: 1e strengs cDNA primer: 5’-CTGTATTGGGATTTGAGAAGTC -3’ (PepMV-15RC)
2e strengs PCR primer: 5’-GTCCCACATTACACTTCCTTCAG – 3’ (PepMV-11)
Deze primercombinatie levert na amplificatie een DNA-fragment van 973 bp op.
De procedure omvat de isolatie van totaal RNA uit bladmonsters, het uitvoeren van de RT-PCR, de gel-electroforese om de evt. PCR producten zichtbaar te maken en de beoordeling van de testresultaten.
In deze test wordt alleen de aan- of afwezigheid van een PepMV specifiek PCR-product op gel bepaald als respectie- velijk positief of negatief. Indien de uitslag van de test niet duidelijk genoeg is omdat het PCR-product op de gel niet duidelijk genoeg zichtbaar is, wordt de uitslag als dubieus beoordeeld. De beoordeling dient altijd door twee perso- nen uitgevoerd te worden.
Vaststellen van prestatiekenmerken
De uitslag van de PCR-test zal kwalitatief geïnterpreteerd worden omdat het alleen gaat om het aantonen van de aanwezigheid van het virus in het bladmateriaal, niet om de exacte hoeveelheid.
Aan de hand van het stroomdiagram uit het toelichtend document zijn de te bepalen prestatiekenmerken: • Juistheid • Aantoonbaarheidsgrens • Herhaalbaarheid • Reproduceerbaarheid • Selectiviteit • Specificiteit • Meetbereik • Robuustheid
De laatste vier prestatiekenmerken worden meegenomen daar ze in de publicatie niet goed beschreven zijn.
Uitvoering, resultaten en conclusies
Juistheid
De definitie van juistheid is beschreven in 3.1.
De uitvoering van juistheid is beschreven in Bijlage 1.2.
Tomatenbladmateriaal, geïnfecteerd met de tomatenstam van PepMV, afkomstig uit de viruscollectie van Plant Research International werd m.b.v. een eerder gepubliceerde RT-PCR methode, getoetst op de aanwezigheid van het virus.
Resultaat
De RT-PCR test op het referentie-isolaat van PepMV was met een PCR-product van de verwachte grootte duidelijk positief, de negatieve controle liet geen PCR-fragment zien. Ook m.b.v. ELISA kon de aanwezigheid van PepMV in het referentieisolaat worden aangetoond.
Conclusie
De gebruikte RT-PCR methode inclusief de primerset is juist want toont inderdaad de aanwezigheid van PepMV aan in tomatenblad aan.
Aantoonbaarheidsgrens
De definitie van aantoonbaarheidsgrens is beschreven in 3.1.
De uitvoering van aantoonbaarheidsgrens is beschreven in Bijlage 1.2.
Resultaat
Figuur 7 geeft de resultaten weer van de bepaling van de aantoonbaarheidsgrens van de analyse. Links staat de marker als controle op de fragmentgrootte van de PCR producten. Vervolgens van links naar rechts de RT-PCR producten verkregen uit een verdunningsreeks (onverdund, 2x, 4x, 8, 16x, 32x, 64x, 128x) van RNA gezuiverd uit een geïnfecteerde plant.
M
Figuur 7. Agarosegel van RT-PCR test op vaststellen van de aantoonbaarheidsgrens.
M = 100 bp marker, Van links naar recht de RT-PCR producten verkregen uit een verdunningsreeks (onverdund, 2x, 4x, 8, 16x, 32x, 64x, 128x) van RNA gezuiverd uit een geïnfecteerde plant.
Een vergelijking met de eerder verkregen waarden uit ELISA voor het vaststellen van de aantoonbaarheidsgrens is weergegeven in de volgende tabel.
Tabel 4.
Verdunning RNA ELISA
Onverdund + 3.148 2x + 3.150 4x + 3.121 8x + 3.088 16x + 2.984 32x + 2.864 64x + 2.708 128x ± 2.475 Conclusie
Een verdunning van 64x van het RNA gezuiverd uit een PepMV geïnfecteerde tomatenblad, geeft nog steeds een positief signaal in een RT-PCR analyse op PepMV. De aantoonbaarheidsgrens voor de RT-PCR analyse ligt bij een bladsapverdunning van 64x.
Opmerking: Bij volgende bepalingen is het aan te bevelen om de RT-PCR niet uit te voeren op verdunningen van het gezuiverde RNA maar eerst RNA te zuiveren uit verdunningen van het geïnfecteerd bladsap en dan RT-PCR op deze RNA extracten.
Herhaalbaarheid/Reproduceerbaarheid
De definitie van herhaalbaarheid/reproduceerbaarheid is beschreven in 3.1.
De uitvoering van herhaalbaarheid/reproduceerbaarheid is beschreven in Bijlage 1.2.
Omdat in deze validatie de analyses zijn uitgevoerd op een onderzoekslaboratorium, waarbij niet voldoende kon worden gevarieerd met apparatuur en menskracht, is in dit voorbeeldrapport alleen de herhaalbaarheid uitgewerkt.
Resultaat
Figuur 8 geeft de resultaten weer van de test op herhaalbaarheid van de analyse. Links staat de marker als controle op de fragmentgrootte van de PCR producten. Vervolgens van links naar rechts steeds per dag de negatieve controle naast het praktijkmonster.
M PC
Figuur 8. Agarosegel van RT-PCR test op herhaalbaarheid. M = 1 Kb marker, Van links naar recht afwisselend de resultaten van de analyse op 8 verschillende dagen van gezond en PepMV geïnfecteerd tomaten- blad. Uiterst rechts de positieve controle (PC) op de werking van de RT-PCR kit.
Conclusie
De herhaalbaarheid van de analyse is 100%. Voor elke dag waarop de analyse is uitgevoerd is het resultaat identiek; d.w.z. dat PepMV kon worden aangetoond.
Specificiteit
De definitie van specificiteit is beschreven in 3.1.
De uitvoering van specificiteit is beschreven in Bijlage 1.2.
Resultaat
In silico
In de BLAST searches werden alleen homologieën (100%) met PepMV isolaten uit de EMBL database gevonden. Met geen enkel andere sequentie werd een homologie gevonden.
Praktijktest
De RT-PCR analyse gaf met geen enkel virus, behalve met PepMV als positieve controle, een PCR product (zie Figuur 9).
M 1 2 3 4 5 6 7 PC
Figuur 9. Agarosegel van RT-PCR test op specificiteit.
M= 100 bp marker, 1 = TAV, 2= CMV, 3= PVX, 4= ToMV, 5= TMV, 6= TSWV, 7= PepMV, PC= positieve controle op werking van RT-PCR kit.
Conclusie
De RT-PCR analyse is specifiek voor PepMV.
Selectiviteit
De definitie van selectiviteit is beschreven in 3.1.
De uitvoering van de bepaling van de selectiviteit voor de analyse staat beschreven in Bijlage 1.2 en bestaat uit het bepalen van de mogelijkheid van vals positieve achtergrondreacties bij uitvoering van de analyse op verschillende tomatencultivars.
Resultaat
Van de volgende gezonde tomatencultivars werd totaal RNA geïsoleerd en getoetst op een mogelijk vals-positief signaal (Figuur 10); cultivars Extase, Roma vF, San Marzano, Fabiola, VW700, VW63 en E114. Ter controle op een juiste werking van de RT-PCR, werd ook RNA geïsoleerd uit een met PepMV geïnfecteerd tomatenblad (PC), controle RNA uit de RT-PCR kit en water (MQ) in de analyse meegenomen.