Output Publicaties
Project 6: karakterisatie van MRSA ST398: het varkensgerelateerde type
met behulp van statistische programma’s geanalyseerd.
AFLP-analyses en spa-typering
De AFLP-analyses werden uitgevoerd aan DNA
geïsoleerd uit ST398-stammen van verschillende klinische en non-klinische bronnen uit zowel mensen als dieren. Met behulp van een eerder in Rotterdam gevalideerd protocol werden AFLP fingerprints gegenereerd die werden ingebed in onze AFLP-database. We scoorden 147 verschillende merkers. Tevens werd de aanwezigheid van de verschillende SCCmec-typen, het PVL toxine-gen en de sequentie van het protein A gen (spa) vastgesteld met behulp van eerder ontwikkelde protocollen.
Sequencen van het ST398-genoom
DNA van een ST398-isolaat werd geïsoleerd en gesequenced door middel van de 454 pyrosequencing technologie van Roche. De verkregen data werden met behulp van software gecombineerd tot grote fragmenten (contigs). Na analyse van de volgorde en oriëntatie van de contigs met behulp van Kodon werd met behulp van conventionele PCR en sequencing-technieken de sequentie van de ontbrekende DNA-fragmenten bepaald.
Resultaten
Microarray experimenten
Doelstelling was om meer inzicht te krijgen in de verschillen tussen ST398-isolaten en andere
Staphylococcus aureus-stammen. Hoewel de microarray-
resultaten technisch goed waren met uitstekende replica’s, bleek de analyse van de resultaten een groot probleem. Voor een goede analyse is een referentie nodig voor elk gen dat aanwezig is op de microarray. Dit bleek achteraf niet het geval (ook niet uit gepubliceerde data voor deze microarray). Er was een referentie voor slechts een deel van de genen, waarbij een referentie ontbrak voor juist die genen die variabel aanwezig zijn tussen verschillende isolaten. Met name deze variabel aanwezige genen bepalen over het algemeen phenotypische verschillen tussen stammen en vormen onder andere de verklaring voor de verschillen in pathogeniciteit en epidemisch vermogen tussen stammen. Om betere resultaten te verkrijgen zijn er vier stammen getest op een Affimetrix microarray. Deze microarray laat betere resultaten zien, maar ook hier is het moeilijk vast te stellen welke genen exact verschillend zijn. Wel is duidelijk dat er ten minste twee verschillende SCCmec-elementen aanwezig zijn. Ook zijn er verschillende bacteriofagen geïntegreerd in het genoom van verschillende ST398-stammen. Deze bacteriofagen coderen vaak voor virulentiefactoren die bijdragen aan pathogeniciteit. Sequencen van het complete genoom zal noodzakelijk zijn om vast te stellen welke genen wel en niet aanwezig zijn in deze bacteriofagen. Verder zijn er verbeterde microarrays nodig. Inmiddels hebben we deze microarrays ontworpen met het Microarray Department van de Universiteit van Amsterdam.
Concluderend kan worden gezegd, dat duidelijk geworden
is dat er ten minste twee op genniveau verschillende varianten van ST398 voorkomen. Deze varianten zijn onafhankelijk van elkaar ontstaan. Er zijn echter aanzienlijke verschillen met stafylokokken-genotypen die van humane herkomst zijn.
AFLP analyse en spa-typering
Op basis van de AFLP-analyses kon worden vastgesteld dat de ST398-stammen een echt separate groep van
S. aureus in het algemeen en MRSA in het bijzonder
vormden. Alle ST398-stammen clusterden separaat van de humane stammen. Ook bleek dat de meticillinegevoelige ST398 bloedvergiftiging konden veroorzaken. Er is dus geen reden om aan te nemen dat de ST398 MRSA dat niet ook kunnen. Spa sequencing in combinatie met pulsed field gel electroforese (PFGE) gaf aan dat significante genetische heterogeniteit onder de ST398-stammen kon worden aangetoond. Dit levert aanwijzingen voor de snelle evolutie die de initiële ST398 over de voorbije jaren blijkbaar al heeft ondergaan. De AFLP-afgeleide merkers hebben geleid tot de ontwikkeling van twee diagnostische PCR’s die (tot op heden) een 100% specificiteit laten zien.
Spa typering van een aantal varkensgerelateerde MRSA
uit Maleisië liet zien dat daar regionaal andere MRSA- genotypes in varkens circuleren. Deze ST9 en ST1-clones kwamen bij dieren en verzorgers voor, gelukkig nog in beperkte frquenties (respectievelijk 1,4 en 5,5%).
ST398 genooom sequencing
Het genoom van ST398-isolaat is compleet gesequenced. De resultaten laten aanzienlijke verschillen zien ten opzichte van andere stammen waarvan het complete genoom beschreven is. De belangrijkste verschillen zijn: - Er is een nieuw type SCCmec aanwezig (dit type is ook
in Taiwan gevonden en is SCCmec type VII genoemd). - Er zijn twee resistentie mechanismen voor (oxy)
tetracycline aanwezig.
- Er zijn genen aanwezig die coderen voor koperresistentie.
- Er zijn een aantal integrative conjugative elements aanwezig. Deze elementen worden verondersteld betrokken te zijn bij de overdracht van DNA en daarmee het verwerven van nieuwe virulentie- en resistentiegenen.
- Er is een uniek pathogenicity island aanwezig met varianten van genen die in andere Staphylococcus
aureus-stammen interfereren met het innate immune
system.
- De ST398-stam bezit verder twee nieuwe allotypes van νSa-elementen. Deze elementen zijn mobiel en coderen voor virulentiefactoren.
- Er ontbreken restrictie/modificatiesystemen in
vergelijking met andere S. aureus-stammen. Omdat deze systemen de introductie van DNA van andere bacteriën en daardoor ook de opname van nieuwe virulentie- en resistentiegenen beperken, zou dit kunnen betekenen dat deze ST398 minder beperkt is in het opnemen van vreemd DNA. Een consequentie hiervan kan zijn dat
deze stam sneller evolutionaire ontwikkelingen kan doormaken waardoor het fenotype van deze stam, bijvoorbeeld pathogeniciteit, sneller kan veranderen. - Verschillende bekende en veelvoorkomende
virulentiefactoren zoals PVL (Panton Valentine Leukocidin) en exotoxinen komen niet voor. Concluderend kan gezegd worden dat op basis van de genoomsequentie er duidelijke verschillen zijn tussen ST398 en andere stafylokokken-genoomsequenties.
Discussie
Ondanks de grote problemen met de analyse van de microarrays van King’s College en de beperkte mogelijkheden om met Affymetrix microarrays te werken, laten de verkregen microarray-experimenten zien dat er aanzienlijke verschillen zijn tussen ST398 en andere stafylokokkenstammen, die van humane herkomst zijn. Dit is in lijn met de spa-types en AFLP- data, waar vergelijkbare genetische heterogeniteit kon worden aangetoond. Interessant genoeg is de genetische heterogeniteit tussen ST398-stammen en stammen die veelal bij mensen voorkomen zodanig groot dat diagnostische testen konden worden ontwikkeld. De algemene verschillen zijn voor één ST398-isolaat door middel van het sequencen van het complete genoom bevestigd en in detail vastgesteld. De gevonden verschillen verklaren de resistentie tegen (oxy)tetracycline dat als selectie selectiedruk voor ST398 in varkens gezien wordt (Van Duijkeren et al., 2008). De meeste
S. aureus-stammen worden niet of zelden in varkens
gevonden. Voor de in Maleisië aangetroffen ST1- en ST9-stammen geldt overigens dat die in de MRSA- vorm wel degelijk ook bij mensen zijn aangetroffen. Een mogelijke verklaring hiervoor is een verschil in virulentiefactoren tussen humane S. aureus en ST398 wat we middels whole genome sequencing hebben gevonden. Veel virulentiefactoren die zijn beschreven in humane
S. aureus-stammen en die interfereren met het innate
immuunsysteem zijn humaan speficiek en vertonen dus geen activiteit tegen het immuunsysteem van (andere) dieren laat zien (Rooijakkers en Van Strijp, 2007). Welke genen of genenclusters daadwerkelijk een rol spelen bij gastheerspecificiteit moet nog verder worden onderzocht. Een andere belangrijke nieuwe bevinding is dat er ten minste twee keer een SCCmec-element opgenomen is door ST398-isolaten. Eén is het al langer bekende SCCmec-type IV dat ook in community-associated MRSA gevonden wordt, de ander is het hier nieuw beschreven SCCmec-type VII (Takano et al., 2008). Wij troffen ook SCCmec-types V en IVa inmiddels aan in ST398 MRSA van diverse oorsprong. Daarnaast bleek uit de microarray-experimenten dat in de verschillende ST398- stammen bacteriofagen op verschillende plaatsen in het genoom zijn geiïntegreerd. De aanwezige variabiliteit in de vier geanalyseerde ST398- stammen en de afwezigheid van restrictie/modificatie systemen suggereert een potentieel grote mate van genetische diversiteit wat betreft geninhoud binnen ST398. Dat betekent dat het niet
uitgesloten is dat er nog andere genomische subtypen van ST398 bestaan of zullen ontstaan met andere SCCmec- elementen en virulentiegenen.
Concluderend kan worden gezegd dat de verschillen tussen ST398 en stammen van humane herkomst aanzienlijk zijn en dat er binnen ST398 genetische, duidelijk verschillende, genomische subtypen zijn.
Aanbevelingen
1. Het sequencen van meer ST398-stammen. Hier wordt op dit moment door onze afdeling aan gewerkt. 2. Het kloneren en tot expressie brengen van
relevante virulentiefactoren, de functie vaststellen en het gastheerbereik vaststellen. Dit is een zeer veelomvattend onderzoek en wordt voor een klein aantal virulentiefactoren van één stam uitgevoerd door onze afdeling. Om tot een goede evaluatie te komen van het potentieel van ST398 is een grotere inzet vereist.
3. De microarray-werkzaamheden uitbreiden om een beter inzicht te krijgen in de genetische diversiteit van ST398. Voor een deel gebeurt dit in het kader van CONtrol of COmmunity-acquired MRSA: Rationale and Development of counteractions (CONCORD) een FP7-project van de Europese Unie waarvan Dr. A.C. Fluit projectleider is.
4. Het uitvoeren van humane kolonisatiestudies met varkens (dier) geadapteerde stammen om gastheerspecificiteit nader te onderbouwen.
5. Het uitvoeren van serologisch onderzoek (multiplex Luminex aanpak) bij wel en niet met varkens of humane S. aureus-stammen gekoloniseerde of geïnfecteerde varkens. Dit levert mogelijk data over, wederom, gastheerspecificiteit en serologische merkers daarvoor. Vraag is of verschillende vormen van immuniteit infectiepreventief zouden kunnen werken.
Gerelateerde projecten
Dit project is voor een klein deel gerelateerd aan CONtrol of COmmunity-acquired MRSA: Rationale and Development of counteractions (CONCORD), een FP7-project van de Europese Unie waarvan Dr. A.C. Fluit projectleider is. Tevens is er beperkte overlap met ‘Preventing community and nosocomial spread of infection with MRSA ST-398 – instruments for accelerated control and integrated risk management of antimicrobial resistance’ (PILGRIM), een FP7-project waarin de Rotterdamse onderzoeksgroep participeert.
Output
Maarten J Schijffelen, C H Edwin Boel, Jos A G van Strijp, Ad C Fluit . 2009. Whole Genome Analysis of a Pig-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus
aureus ST398 Isolate from a Case of Human Endocarditis.
BMC Genomics. Sumitted. Accepted pending modification.
Neeltje Carpaij, Ad C. Fluit, Jodi A. Lindsay, Marc J.M. Bonten and Rob J.L. Willems. New methods to analyse microarray data that partially lack a reference signal. BMC Genomics. Sumitted. Accepted pending modification.
C.H.E. Boel, M.J. Schijffelen, W. van Workum, G. te Meerman, and A.C. Fluit. 2008. Single feature polymorphisms using Affymetrix microarray analysis reveals substantial differences between pig-related ST398 MRSA isolates. Voorjaarsbijeenkomst Ned. Ver. Med. Microbiol. Ned. Tijdschr. Med. Microbiol. 16 (Suppl.): Abstract P46, pS98.
C. H. E. Boel, M. J. Schijffelen, W. van Workum, G. J. te Meerman, A. C. Fluit. 2008. Single feature polymorphisms using Affymetrix microarray analysis reveals substantial differences between pig-related ST398 MRSA isolates. 108th American Society for Microbiology General Meeting, Boston, MA. Abstract C-345.
M.J. Schijffelen, C.H.E. Boel, J.A.G. van Strijp, A.C. Fluit. 2009. Whole genome analysis shows substantial diversivication between pig-associated methicillin- resistant Staphylococcus aureus ST398 isolates. 13th International Symposium on Staphylococci and
Staphylococcal infections, Cairns, Australia. Abstract 423. M.J. Schijffelen, C.H.E. Boel, J.A.G. van Strijp, A.C. Fluit. 2009. Whole genome analysis shows substantial diversivication between pig-associated methicillin- resistant Staphylococcus aureus ST398 isolates.
Voorjaarsbijeenkomst Ned. Ver. Med. Microbiol. Antonie van Leeuwenhoek 95: 95, Suppl. 1, abstract O095, p.49- 50.
A. van Belkum, D.C. Melles, J.K. Peters, W.B. van Leeuwen, E. van Duijkeren, X.W. Huijsdens, E. Spalburg, A.J. de Neeling, H.A. Verbrugh on behalf of SOM. 2008. Methicillin resistant and susceptible Staphylococcus aureus sequence type 398 in pigs and humans. Emerging Infectious Diseases 14, 479-483.
W.J.B. van Wamel, S. Hansenova, A.C. Fluit, H.A. Verbrugh, A.J. de Neeling, E. van Duijkeren, A. van Belkum. 2009. Short term micro-evolution of methicillin- resistant and susceptibel Staphylococcus aureus sequence type 398. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, in press.
V. Neela, M.Z. Arif, M.N Shamsudin, A. van Belkum, L.Y. Khoon, E.G. Rad. Prevalence of ST-9 MRSA among pigs and pig handlers in Malaysia. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, in press.
Literatuur
De Neeling AJ, van den Broek MJ, Spalburg EC, van Santen-Verheuvel MG, Dam-Deisz WD, Boshuizen HC, van de Giessen AW, van Duijkeren E, Huijsdens XW. High prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in pigs. VetMicrobiol. 2007;122:366-7
Rooijakkers en SH, vVan Strijp JA. Bacterial complement evasion. Mol Immunol., 2007;44:23-32.
Takano T, Higuchi W, Otsuka T, Baranovich T, Enany S, Saito K, Isobe H, Dohmae S, Ozaki K, Takano M, Iwao Y, Shibuya M, Okubo T, Yabe S, Shi D, Reva I, Teng LJ, Yamamoto T. Novel characteristics of community- acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains belonging to multilocus sequence type 59 in Taiwan. Antimicrob Agents Chemother., 2008;52:837-45. Van Duijkeren E, Ikawaty R, Broekhuizen-Stins MJ, Jansen MD, Spalburg EC, de Neeling AJ, Allaart JG, van Nes A, Wagenaar JA, Fluit AC. Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains between different kinds of pig farms. Vet Microbiol. 2008 126:383-9.
Projectleider
X.W. Huijsdens, Laboratorium voor Infectieziekten en Screening, CIb-RIVM.
Projectteam
X.W. Huijsdens en T. Bosch: CIb-RIVM.
Samenwerking
Niet van toepassing.
Samenvatting
Project 7 had als doel om alle ingezonden MRSA-isolaten uit de verschillende deelprojecten te typeren. Typering is nodig om samen met epidemiologische gegevens een conclusie te kunnen trekken over bijvoorbeeld verspreiding en/of overdracht. De typering vond plaats door middel van een zogenaamde Staphylococcus proteïne A (spa) typering. Dit is een typering die gebaseerd is op de DNA-sequentie van het spa-gen. Het resultaat, een
spa-type, werd teruggekoppeld naar de desbetreffende
deelprojectleider. Voor project 7 zijn in totaal 2662 isolaten voor typering opgestuurd. In bijna alle gevallen kon direct het spa-type bepaald worden, echter bij 150 isolaten moest eerst nog een aparte DNA-isolatie uitgevoerd worden om tot een spa-type te komen. Aan de hand van het spa-type kan men meestal zien of het om een veegerelateerd type gaat. In 27 gevallen was echter nog een extra typering (MLST) nodig voor nadere analyse.
Spa-type t011 en t108 werden het vaakst aangetroffen. Dit
komt overeen met de meestgevonden veegerelateerde spa- typen bij mensen in Nederland. Uiteindelijk is voor alle ingestuurde isolaten een spa-type bepaald.
Summary
The goal of Project 7 was to type all MRSA isolates which were sent by the different projects within the LNV MRSA program. Typing, together with epidemiological data, is necessary to draw conclusions whether there is e.g. spread and/or transmission of MRSA. Staphylococcus proteïn A (spa) typing was chosen as the method of choice. Spa typing is based on the DNA sequence of the spa gene. The result of a spa typing, a spa type, was reported to the project leader. In total 2662 isolates were sent in for typing. In almost all cases the spa type could immediately be determined. However, in 150 cases DNA isolation was necessary to determine the spa type. Based on the spa type itself one can tell if the spa type is livestock-associated or not. In 27 cases another typing method (MLST) was used for further analysis. The two most prevalent spa types were t011 and t108. These two spa types are also the two most frequently found types among MRSA isolates
in the Dutch population. For all isolates a spa type was determined.
Inleiding
In het kader van epidemiologisch onderzoek, bron- contact onderzoek, monitoring- en nationale surveillance (‘vinger aan de pols’)-programma’s worden bacteriën van diverse geslachten en soorten getypeerd. Deze bacteriën kunnen uit mens, dier of het milieu geïsoleerd zijn. De typeermethoden die gebruikt worden zijn zowel gebaseerd op fenotypische (serotypering, faagtypering, antibiogram) als ook op genotypische kenmerken (DNA). De methoden en resultaten worden zo veel mogelijk internationaal getoetst. Typering gebaseerd op DNA-sequentie heeft de voorkeur in verband met ondubbelzinnige en nauwkeurige resultaten. Tevens bieden op DNA-sequentie gebaseerde typeermethoden betere mogelijkheden voor het opstellen van (internationale) databases. Door middel van typering kan bijvoorbeeld worden vastgesteld of er sprake is van verspreiding of overdracht van dier op mens.
Sinds 1 januari 2008 wordt voor de nationale methicilline- resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-surveillance de Staphylococcus proteïne A (spa) typering gebruikt. De techniek is gebaseerd op de DNA-sequentie van een bepaald gedeelte van het proteïne A-gen. Een belangrijk kenmerk van deze bepaling is het universele karakter van het typeerresultaat. Het resultaat van een spa- typering wordt weergegeven in een bepaald nummer, het zogenaamde spa-type. Het spa-type is afhankelijk van de gevonden DNA-sequentie en ligt internationaal vast. Hierdoor is vergelijking van MRSA-isolaten op nationaal en internationaal gebied mogelijk. Aan elk MRSA-isolaat kan door middel van spa-typering een spa-type toegekend worden. Op basis van de spa-typen van twee of meer isolaten kan men een uitspraak doen over een eventuele epidemiologische relatie.
In 2003 werden in Nederland voor het eerst MRSA- isolaten gevonden met een tot dan toe onbekend
typeerresultaat. Na onderzoek bleken deze MRSA-isolaten een epidemiologische relatie te hebben met varkens (Voss et al., 2005; Huijsdens et al., 2006). Vervolgonderzoek in Nederland heeft uitgewezen dat het hier om een ‘live- stock associated’ (LA)-MRSA gaat (De Neeling et al., 2007; Van Loo et al., 2007; Van den Broek et al., 2008; De Boer et al., 2009). Typering van LA-MRSA-isolaten met verschillende typeermethoden heeft laten zien dat alle LA-MRSA tot een bepaalde groep MRSA behoren, de zogenaamde ST398 groep. Binnen de ST398-groep kunnen MRSA-isolaten verschillen van elkaar, onder andere in spa-type.
De spa-typering is gebruikt voor het typeren van de