Er zijn verschillende oorzaken voor embryonale sterfte waaronder infecties of ook niet-infectieuze activatie van het immuunstelsel een belangrijke factor zijn. Zelfs als deze immuunrespons geactiveerd wordt buiten het voortplantingsstelsel kan dit een fataal effect hebben op het embryo (Hansen et al.2004;
Gilbert, 2012). Deze sterfte kan al optreden vooraleer het vruchtje de baarmoeder bereikt heeft. (Hansen et al., 2004).
2.1. HET EFFECT VAN CYTOKINEPRODUCTIE
Ooien die vroeg in de dracht (5 dagen na dekking) blootgesteld werden aan peptidoglycaan-polysaccharide (PG-PS), een onderdeel van de celwand van grampositieve bacteriën, ondergingen een systemische immuunrespons die resulteerde in koorts, vaginale uitvloei en gestegen concentraties van TNF-α (een pro-inflammatoir cytokine), SAA (een merker van inflammatie) en Hp (anti-inflammatoir agens) (Dow et al., 2010). Een infectie van de melkklier die resulteert in mastitis gaat ook gepaard met een stijging van SAA en Hp in het serum en in de melk (Suojala et al., 2008; Sadek et al., 2017).
Hill en Gilbert (2008) kweekten embryo’s in een cultuurmedium dat aangelengd werd met spoelingsvocht uit een ontstoken baarmoeder. De embryo’s vertoonden een gedaalde kwaliteit van de blastocyst, met een daling van het totaal aantal cellen. Daarnaast was er ook een daling van het aantal trofectoderm cellen en een daaruit voortkomende stijging van de binnenste celmassa:trofectoderm ratio.
Dit alles resulteert in een gedaalde leefbaarheid van het embryo (Gilbert, 2012). We zouden dus kunnen concluderen dat een maternale infectie met een daaropvolgende afweerreactie een negatief milieu creëert voor het embryo. Bij een bacteriële infectie worden de membraancomponenten LPS en PG-PS van de gram-negatieve respectievelijk gram-positieve bacterie herkend door Toll-like receptoren (TLRs), een onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. Dit zet de inflammatoire respons in gang want TLRs activeren de macrofagen om anti-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en verschillende interleukines vrij te stellen. Naast cytokines worden de macrofagen ook gestimuleerd om antimicrobiële eiwitten te produceren waaronder het stikstofoxide synthase dat instaat voor de productie van NO.
Macrofagen kunnen ook geactiveerd worden via het adaptieve immuunsysteem, namelijk door IFN-γ
11 dat vrijgesteld wordt door T-helper-1 cellen (Medzhitov, 2007). De moleculen die vrijkomen bij de afweerreactie van het moederdier beïnvloeden de kwaliteit en leefbaarheid van het embryo (Haddad et al., 1997; Leazer et al., 2002; Dow et al., 2010; Gilbert, 2012; Wuu et al., 2012)
LPS zelf is niet toxisch voor het embryo, de toxiciteit van LPS zit hem in de activatie van de maternale acute fase respons (Leazer et al., 2002). Deze respons is een vroege maar niet specifieke reactie die onder andere ontstaat bij een bacteriële infectie. De weefselmacrofaag is in de meeste gevallen de initiator van de reactie die een gamma aan mediatoren vrijstelt na stimulatie door bacteriën (Koj, 1996).
Cytokines kunnen geproduceerd worden door zowel de foetale als maternale cellen in de placenta. TNF-α, IFN-γ en IL-2 zijn de cytokines die de grootste schade veroorzaken. TNF-α kan thrombose en contractie van gladde spieren veroorzaken. Dit cytokine wordt gevormd door macrofagen en gaat de NK cellen stimuleren om IFN-γ vrij te stellen, dat op zijn beurt de macrofagen extra gaat stimuleren om TNF-α te produceren. Uiteindelijk zijn het de NK cellen die het embryo zullen doden (Entrican, 2002).
Daarnaast stimuleert LPS zelf de vrijstelling van IFN-γ door Thelper-1 en NK cellen (zie figuur 3) (Haddad et al., 1997; Entrican, 2002). IFN-γ geeft een signaal aan de macrofagen om naast TNF-α ook
Figuur 3. (Uit Mayer en Nyland, 2017)
de NO productie in gang te zetten dat op zijn beurt tot embryonale sterfte kan leiden (Haddad et al., 1997). De ergheid van de gevolgen voor het embryo zou afhankelijk zijn van de hoeveelheid TNF-α die wordt vrijgesteld door het moederdier als reactie op de blootstelling aan LPS (Leazer et al., 2002). De eicel zou gevoeliger zijn voor lagere concentraties van TNF-α dan het embryo (Soto et al., 2003b). Bij muizen zag men infarcten ter hoogte van de placenta en anoxie van de vrucht wat doet vermoeden dat de schade zich vooral lokaliseert ter hoogte van de vascularisatie in de placenta (Leazer et al., 2002).
TNF-α zou, onder andere, ervoor zorgen dat het embryo prostaglandines produceert en deze prostaglandine productie is schadelijk voor de eigen ontwikkeling. De stijging van prostaglandineproductie door TNF-α werd ook in vivo gezien ter hoogte van het boviene endometrium (Jackson et al., 2012).
Muizenembryo’s die blootgesteld werden aan het cytokine hadden een gedaalde binnenste celmassa (Wuu et al., 1999). Dit fenomeen werd geassocieerd met een gestegen aantal cellen die in apoptose gingen (Wuu et al., 1999; Soto et al., 2003b). In de studie van Soto et al. (2003b) heeft men gezien dat TNF-α apoptose induceert bij ontwikkelende embryo’s vanaf het negencellig stadium, maar zou weinig tot geen effect hebben op het twee- en viercellig embryo. TNF-α bezit namelijk de mogelijkheid om de cascade van celdood in gang te zetten door te binden op de TNF-receptor. Het is mogelijk dat embryo’s in een vroeg stadium minder gevoelig zijn voor TNF-α-geïnduceerde apoptose door een lagere expressie van de TNF-receptor. Ondanks het feit dat er meer apoptose optrad bij de embryo’s, konden zij toch ontwikkelen tot het blastocyst-stadium (Soto et al., 2003b). Wanneer men deze embryo’s in vitro liet innestelen waren zij minder succesvol om hun cellen gestructureerd in een cluster vast te houden ter hoogte van de trofectoderm uitgroei. Hoewel men geen verschil kon vinden in de gemiddelde oppervlakte van zowel de behandelde (blootstelling aan TNF-α) als onbehandelde embryo’s na uitgroei, hadden de vruchtjes die blootgesteld waren aan het cytokine opvallend minder nucleï (Wuu et al., 1999).
Wanneer de embryo’s ingeplant werden in recipiënt muizen zag men geen verschil in het aantal ingenestelde embryo’s uit de behandelde en controlegroep, maar bij de behandelde groep trad meer resorptie van de vruchtjes op (Wuu et al., 1999). Dit zou kunnen verklaard worden door het feit dat de trofectoderm cellen instaan voor de productie van interferon tau (IFN-τ). Aangezien voornamelijk deze cellen aangetast zijn, veronderstelt men dat het embryo moeite heeft om de baarmoeder te informeren over een geslaagde bevruchting waardoor het moeilijk wordt om de dracht in stand te houden (Gilbert, 2012). Bij ooien die blootgesteld waren aan PG-PS zag men op dag 14 en dag 21 een verlaagde concentratie van progesteron, dit wijst erop dat corpora lutea regresseren. Dit kan men eveneens verklaren door een niet geslaagde maternale herkenning van de vrucht (Dow et al., 2010). De blootgestelde vruchtjes die overleefden na embryotransplantatie naar recipiënt muizen hadden een lager gewicht ten opzichte van de controlegroep (Wuu et al., 1999).
De vraag blijft wel of koeien die een periode van uierontsteking doormaken een dermate gestegen concentratie aan TNF-α bekomen zodat het schadelijk zou zijn voor het embryo (Soto et al., 2003b;
Jackson et al., 2012).
13 2.2. HET EFFECT VAN PROSTAGLANDINEPRODUCTIE
Tijdens de ontstekingsreactie treedt er in verschillende weefsels een verhoogde synthese van prostaglandine F2α op. Deze synthese wordt voornamelijk gestimuleerd door LPS, NO en cytokines zoals TNF-α en interleukine-1 β (Soto et al., 2003a). Men heeft in verschillende studies kunnen aantonen dat PGF2α een schadelijk effect heeft op het ontwikkelende embryo (Buford et al., 1996; Hockett et al., 2004; Scenna et al., 2004).
Frequente injecties met PGF2α van dag 4 tot 7 of van dag 5 tot 8 na bevruchting zorgde voor een regressie van het corpus luteum. Dit verlies werd gecompenseerd door toediening van progesteron.
Toch had de groep dieren die deze behandeling kregen een lager drachtigheidspercentage (Buford et al., 1996). De overlevingskansen van het embryo werden groter indien men het regresserende corpus luteum verwijderde en als de koe flunixine meglumine, een inhibitor van de synthese van PGF2α, toegediend kreeg (Buford et al., 1996). Dit zou erop kunnen wijzen dat PGF2α verantwoordelijk is voor de synthese van een embryotoxische molecule die zijn origine vindt in het corpus luteum (Hansen et al., 2004).
Een gelijkaardig studie van Hockett et al. (2004) versterkt dit vermoeden. Hierbij werden embryo’s van 70 koeien (vleeskoeien) onderzocht op het effect van maternale administratie van PGF. Ze werden allen gesupplementeerd met progesteron vanaf dag 3 tot 8 na kunstmatige inseminatie. De groep werd willekeurig in een behandelings- en controlegroep gesplitst waarbij de behandelde groep PGF intramusculair toegediend kreeg en de controlegroep een zoutoplossing. De embryo’s werden gespoeld en gecontroleerd op kwaliteit en ontwikkeling op basis van volgende parameters: vorm, ontwikkelingsstadium, leefbaarheid, afwijkingen. De embryo’s kregen een score toegekend tussen 1 en 4, score 1 werd gegeven aan een normaal en gezond embryo en score 4 aan embryo’s die een vertraagde of degeneratieve groei kenden of wanneer ze niet meer leefbaar waren. In de behandelde groep kregen slechts enkele embryo’s score 1, het merendeel kreeg score 4, terwijl bij de controle groep geen enkel embryo deze slechte score kreeg. Embryo’s met een score van 1, 2 of 3 kwamen nog in aanmerking voor embryotransplantatie. Alle embryo’s van de controlegroep zou men kunnen transplanteren naar draagkoeien, van de behandelde groep zou dit slechts bij 36% mogelijk zijn.
In een studie van Scenna et al. (2004) onderzocht men het effect van PGF2α op de ontwikkeling van het embryo op verschillende tijdstippen (voor en na de compactie). Embryo’s die zich bevonden in het 16 tot 32-cellig stadium (voor de compactie) kenden een verminderde ontwikkeling tot blastocyst indien zij blootgesteld werden aan PGF2α. Wanneer men PGF2α toevoegde aan het cultuurmedium van embryo’s in het morula stadium (na compactie) zag men geen wijzigingen in de ontwikkeling tot blastocyst. Maar het aantal embryo’s dat uiteindelijk uitkipt was wel gedaald ten opzichte van de controle groep.
2.3. HET EFFECT VAN EEN GESTEGEN TEMPERATUUR
Bevruchte eicellen die gekweekt werden in cultuur aan 40°C hadden een gedaald vermogen om te ontwikkelen: er was een lager percentage aan oöcyten die zich omgevormd hadden tot morula of blastocyst zes dagen na de bevruchting. De embryo’s die gekweekt werden in het milieu van 40°C hadden een kleiner aantal cellen en minder trofectoderm cellen dan embryo’s die zich in een milieu van
38,5°C bevonden (Sakatani et al., 2012). De morula zou veel beter bestand zijn tegen een stijging in temperatuur dan het embryo in het twee- tot achtcellig stadium (Edwards en Hansen, 1997).