UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2016 - 2017
Het effect van maternale ontstekingsprocessen op de ontwikkeling van het embryo: mastitis als model
door
Ilke VAN HESE
Promotoren: Prof. dr. Geert Opsomer
Dr. Elke Depreester
Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef
© 2017 Ilke Van Hese
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2016 - 2017
Het effect van maternale ontstekingsprocessen op de ontwikkeling van het embryo: mastitis als model
door
Ilke VAN HESE
Promotoren: Prof. dr. Geert Opsomer
Dr. Elke Depreester
Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef
© 2017 Ilke Van Hese
VOORWOORD
Het afwerken van deze masterproef vormt een mooi sluitstuk van de zesjarige opleiding tot dierenarts.
Een opleiding die veel doorzettingsvermogen vraagt maar waarvan je veel unieke ervaringen in de plaats krijgt. Ik kijk dan ook tevreden terug naar de weg die ik afgelegd heb en de mensen die ik onderweg ontmoet heb.
Aangezien dit onderzoek een vervolg is op mijn literatuurstudie van vorig jaar, had ik al de kans gekregen om kennis te maken met het onderwerp. Toen al sprak deze materie me enorm aan en ik ben dan ook dankbaar dat ik over dit onderwerp een onderzoek mocht uitvoeren.
Dit werk tot een goed einde brengen zou me nooit alleen gelukt zijn. Het is dan ook vanzelfsprekend dat ik mijn dank betuig aan de mensen die mij hierin hebben bijgestaan. Allereerst wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Geert Opsomer, en mijn co-promotor, Dr. Elke Depreester, bedanken voor hun inzet en steun.
Tot slot wil ik mijn familie en vrienden bedanken omdat ik altijd bij hen terecht kan als ik hulp nodig heb.
Ze stonden altijd klaar om een luisterend oor te bieden tijdens stressmomenten. Zonder hen zou ik nooit tot aan de finish geraakt zijn.
INHOUDSOPGAVE
VOORBLAD TITELBLAD VOORWOORD INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING ... 1
INLEIDING ... 2
LITERATUURSTUDIE ... 6
1. Het effect van mastitis op de eicel ... 6
1.1. Invloed van het celgetal en de kiem ... 6
1.2. Effect van het tijdstip van optreden van klinische mastitis ... 6
1.3. Mechanismen waardoor mastitis invloed uitoefent op reproductieparameters ... 7
1.3.1. Wijzigingen in endocrinologie ... 7
1.3.2. Wijzigingen in folliculaire ontwikkeling ... 7
1.3.3. Activatie van het immuunstelsel: vrijstelling van cytokines ... 8
1.3.4. Klinische mastitis gaat gepaard met een stijging van de lichaamstemperatuur ... 10
2. Het effect van mastitis op het embryo ... 10
2.1. Het effect van cytokineproductie ... 10
2.2. Het effect van prostaglandineproductie ... 13
2.3. Het effect van een gestegen temperatuur ... 13
3. Het effect van mastitis op de foetus ... 14
3.1. Endotoxemie veroorzaakt foetale sterfte ... 14
3.2. Het effect op het centraal zenuwstelsel van de foetus ... 14
3.3. Het effect op de foetale groei ... 15
3.3.1. Aantasting van de werking van de placenta ... 15
3.3.2. Aantasting van het foetale skelet ... 16
ONDERZOEK ... 17
1. Materiaal en Methoden ... 17
1.1. Bedrijven en dieren ... 17
1.2. Statistiek ... 17
2. Resultaten ... 19
2.1. Deel 1: Beschrijvende statistiek ... 19
2.2. Deel 2: Factoren met invloed op het geboortegewicht en de borstomtrek van het kalf .... 20
2.2.1. De incidentie van subklinische mastitis tijdens de lactatie heeft een effect op het geboortegewicht van het kalf ... 20
2.2.2. De incidentie van klinische mastitis tijdens de lactatie heeft een effect op het geboortegewicht van het kalf. ... 21
2.2.3. De incidentie van subklinische mastitis in trimester 1 van de dracht heeft een effect op de borstomtrek van het kalf ... 22
3. Discussie ... 24
REFERENTIELIJST ... 25
1
SAMENVATTING
Mastitis is een frequent voorkomende ziekte die wereldwijd veel melkkoeien treft en kan leiden tot uitgesproken economische verliezen. In het hier beschreven onderzoek is deze aandoening gebruikt als model om het effect van maternale ontstekingsprocessen op de ontwikkeling van het embryo na te gaan. Ontstekingsreacties die aan de gang zijn bij het moederdier, kunnen een effect hebben op zowel de eicel, het embryo als de foetus. Het effect op de eicel en het jonge embryo uiten zich vaak in gewijzigde reproductieparameters, zoals een daling van het drachtigheidspercentage en een stijging van het aantal inseminaties per drachtig geworden dier. Door wijzigingen in de endocrinologie resulteert mastitis vaak in een gedaalde oestrusexpressie en soms zelfs in het uitblijven van de ovulatie.
Daarnaast treedt er schade op in de folliculogenese. Bij een maternaal ontstekingsproces treedt ook vaak vroeg embryonale sterfte op waardoor de dracht afgebroken wordt. Naast sterfte brengt de immuunrespons ook schade aan de ontwikkeling van het embryo teweeg. Dit effect wordt ook ondervonden door de foetus. In dit stadium zijn het vooral de negatieve effecten op de werking van de placenta en op de ossificatie die instaan voor een vertraagde ontwikkeling van de vrucht. Om de omvang van de effecten op de zich ontwikkelende vrucht weer te geven, hebben we in dit onderzoek gebruik gemaakt van de somatische celgetallen (somatic cell count (SCC)) in de melk tijdens de lactatie. Er werden gegevens verzameld van 147 lactaties via de MPR metingen afkomstig van drie Oost-Vlaamse melkveebedrijven. Van elke MPR-meting werd bijgehouden of de koe al dan niet een verhoogd SCC had (>150.000 cellen/mL bij vaarzen en >250.000 cellen/mL bij koeien). Wanneer de kalfjes geboren werden, werd hun gewicht, hoogte, borstomtrek, schouderbreedte en bekkenbreedte geregistreerd. Na analyse van de data is gebleken dat de incidentie van subklinische mastitis en de graad van subklinische mastitis een significant effect hebben op het geboortegewicht van het kalf (P<0,05 resp. P=0,1). Het voorkomen van subklinische mastitis tijdens het eerste trimester van de dracht werd significant geassocieerd met de geboorte van kalveren met een kleinere borstomtrek (P>0,05). Voortbouwend op de literatuur denken we dat deze effecten kunnen verklaard worden door de toestand van verhoogde oxidatieve stress die ontstaat ten gevolge van de maternale afweerrespons. De productie van Tumor necrosis factor-α (TNF-α) als gevolg van een infectie, zou bijvoorbeeld kunnen meespelen in de prenatale groeirestrictie die optreedt bij het kalf. Een andere verklaring zou kunnen zijn dat een gewijzigde groei optreedt door aantasting van de werking van de placenta, iets wat ook in de literatuur werd gerapporteerd bij een ontstekingsreactie bij het drachtig moederdier. Op basis van dit onderzoek is het duidelijk dat de aanwezigheid van ontstekingsprocessen bij een drachtige koe geassocieerd zijn met een intra-uteriene groeivertraging van het kalf, maar meer en diepgaander onderzoek is nodig om de onderliggende werkingsmechanismen hiervan bloot te leggen.
Kernwoorden: Maternaal ontstekingsproces – mastitis – groeirestrictie – embryo – oöcyt – foetus – melkvee
INLEIDING
Het doel van deze studie is om na te gaan wat het effect is van een ontstekingsproces die het moederdier doormaakt op de ontwikkeling van de vrucht. Om dit in kaart te brengen hebben we mastitis genomen als model voor een maternaal ontstekingsproces. Hierbij hebben we gebruik gemaakt van het celgetal in de melk van de drachtige dieren.
Het somatisch celgetal (somatic cell count (SCC)) van de melk wordt algemeen gebruikt om te waken over de uiergezondheid op het bedrijf aangezien dit de meest eenvoudige en goedkope methode is (Laevens et al., 2001). Somatische cellen zijn overwegend cellen van het immuunsysteem zoals lymfocyten, macrofagen, polymorfonucleaire cellen, daarnaast vindt men ook epitheliale cellen terug (Sordillo et al., 1997, Schukken et al., 2003). Een verhoogd somatisch celgetal kent verschillende oorzaken, zowel infectieus als niet-infectieus, al is de infectiestatus van de melkklier wel de voornaamste oorzaak van wijzigingen in het celgetal (Laevens et al., 2001). Het celgetal is daarom een weergave van de inflammatoire respons op een intramammaire infectie of een andere trigger van het immuunstelsel (Schukken et al., 2003). Staphylococcus aureus, Streptococcus species en coliformen zijn de pathogenen die de sterkste stijging van het celgetal veroorzaken en zijn daarnaast geassocieerd met enorme productieverliezen (Laevens et al., 2001). Mastitis is een ziekte die wereldwijd vaak voorkomt bij melkkoeien. Het veroorzaakt economische verliezen door een gedaalde kwantiteit en kwaliteit van de melk, de behandelingen die ingesteld worden en een stijging van het opruimingspercentage (Hogeveen en Osteras., 2005).
DE IMMUNITEIT VAN DE MELKKLIER
De immuniteit van de melkklier wordt opgedeeld in de aangeboren en verworven immuniteit. De aangeboren immuniteit is een niet-specifieke respons die vooral in vroege stadia van een infectie domineert. Het zijn voornamelijk de macrofagen, de neutrofielen en de natural killer (NK) cellen die bij deze reactie worden aangesproken. De verworven immuniteit herkent specifieke patronen van een pathogeen waardoor dit selectief geëlimineerd wordt. Hierbij zijn het vooral lymfocyten die aan het werk worden gezet.
Pathogenen vinden hun intrede in de uier via de tepelopening. De werking van de blijvende en gerekruteerde leukocyten spelen een belangrijke rol in het tot stand komen van een intramammaire infectie. Als de leukocyten de infectie niet onder controle krijgen wordt de diapedese van deze cellen vanuit het bloed naar de uier in stand gehouden en zal het melkklierweefsel beschadigd worden waardoor de melkproductie daalt. Neutrofielen komen het meest voor vroeg in het ontstekingsproces.
Ze worden aangetrokken door cytokines, complement en prostaglandines. Een bacteriële infectie veroorzaakt de synthese en vrijstelling van cytokines en eicosanoïden (Sordillo et al., 1997). TNF-α en IL-1β zijn de belangrijkste pro-inflammatoire cytokines en zijn mediatoren van zowel de lokale als de systemische immuunrespons. Gram-negatieve bacteriën, die het endotoxine LPS bezitten, zouden een sterkere stijging van deze cytokines teweeg brengen dan Gram-positieve bacteriën (Schukken et al., 2011). Tijdens de dracht zorgen de geproduceerde hormonen, progesteron, 17β-oestradiol en
3 prostaglandine E2, voor een anti-inflammatoire invloed door de cytokine vrijstelling door antigeen presenterende cellen en T-cellen te wijzigen (Entrican, 2002).
In de studie van Sadek et al. (2017) heeft men gezien dat bij koeien met een subklinische en klinische mastitis er een stijging plaatsvond van acute fase proteïnen, zoals haptoglobine en serum amyloïd A, in het serum en de melk, alsook een stijging van pro-inflammatoire cytokines (Tumor necrosis-α (TNF-α), interleukine(IL)-1, -2 en -6) in het serum. Serum amyloid A is enkel sterk gestegen in zowel het serum als de melk bij koeien met een klinische mastitis, bij subklinische mastitis blijft deze stijging beperkt tot de melkklier. Daarnaast hadden koeien die een uierontsteking doormaakten een gestegen concentratie van malonyl dialdehyde (een eindproduct van lipide peroxidatie) en stikstofoxide (NO) in de melk en het serum en een daling van de concentratie van glutathione en van de totale antioxidant capaciteit (Sadek et al., 2017).Tijdens de immuunrespons produceren fagocyten zuurstofradicalen (ROS) om de bacteriën te kunnen afdoden. Maar dit effect kan zorgen voor oxidatieve stress wanneer de capaciteit van de antioxidanten overschreden wordt. Hierdoor kan celschade ontstaan waardoor de ontstekingsreactie verergerd wordt (Turk et al., 2012).
De verworven immuniteit herkent specifieke patronen van pathogenen waardoor selectieve eliminatie in gang wordt gezet. Deze herkenning wordt gemedieerd door antistoffen, macrofagen en lymfocyten.
Figuur 1 Schematische weergave van de aangeboren immuunrespons in de uier van een koe.
Geactiveerde macrofagen stellen cytokines zoals TNF-α en interleukine-1β (IL-1β) vrij. Deze cytokines stimuleren de endotheliale cellen van bloedvaten om adhesiemolecules vrij te stellen zodat de neutrofielen gerekruteerd kunnen worden vanuit de bloedstroom naar de plaats van infectie. (Uit Oviedo-Boyso et al., 2007)
De lymfocyten worden onderverdeeld in B en T-lymfocyten, waarbij deze laatste nog eens worden opgedeeld in T-helper-1 (Th1) en T-helper-2 (Th2) cellen. Th1 cellen produceren voornamelijk de cytokines IL-2 en interferone-γ (IFN-γ), de Th2 cellen stellen voornamelijk IL-4, -5 en -10 vrij. Deze stoffen staan in voor de stimulatie van het immuunstelsel (Sordillo, 2005). De pro-inflammatoire cytokines stimuleren de synthese van acute fase proteïnen voornamelijk in de lever maar ook in andere organen zoals in de melkklier (Turk et al., 2012).
In de studie van Albaaj et al. (2017) heeft men een verband aangetoond tussen een gestegen melkcelgetal en een daling in conceptieresultaten, hierbij is subklinische ketose een versterkende factor van het negatieve effect van een hoog celgetal. Daarnaast heeft een verhoogd celgetal na de inseminatie een grotere impact op de conceptie dan een stijging van het celgetal voor de inseminatie.
In een studie van Lundborg et al. (2003) heeft men aangetoond dat er een verband is tussen het optreden van mastitis en andere ziekten alsook het celgetal van de koe in de late dracht en de grootte van het kalf bij de geboorte. Daarenboven is een gestegen melkcelgetal een risicofactor voor het optreden van respiratoire ziekten bij het kalf.
DE FUNCTIE VAN DE PL ACENTA
Herkauwers vormen een cotyledonaire, synepitheliochoriale placenta zoals voorgesteld in Figuur 2 (Entrican, 2002). De placenta staat in voor het transport van voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen van het foetale metabolisme tussen de circulatie van het moederdier en de vrucht. De ontwikkeling van de placenta is van cruciaal belang om een optimale groei van de foetus te bewerkstellen. Het zorgt voor een groot contactoppervlak tussen het epitheel en de bloedvaten van de foetus zodat uitwisselingen van nutriënten kan plaats vinden. Daarnaast interageren de trofoblastcellen met het endometrium aangezien de klieren van de baarmoederwand instaan voor de vrijstelling van groeifactoren, nutriënten
Figuur 2. Een voorstelling van twee placentomen van de boviene placenta. De chorioallantoïs vormt villi om een zo groot mogelijk contactoppervlak met het endometrium te creëren. (Uit Schlafer et al., 2000)
5 en immuuncel regulatoren. Deze stoffen zijn nodig om de bloedvloei en de aanvoer van nutriënten naar de foetus te vergemakkelijken. Ter hoogte van de placentomen vindt het grootste aandeel van de uitwisseling van zuurstof en micronutriënten plaats want op die plaats liggen de maternale en foetale bloedvaten het dichtst bij elkaar. Tijdens de dracht is het transport van voedingsstoffen sterk afhankelijk van de uteriene bloedvloei. Al deze eigenschappen zijn van cruciaal belang voor de groei en ontwikkeling van de foetus (Dunlap et al., 2015).
LITERATUURSTUDIE
1. H ET EFFECT VAN MASTITIS OP DE EICEL
1.1. INVLOED VAN HET CELGETAL EN DE KIEM
Roth et al. (2013) onderzocht het effect van intra-mammaire infectie op de oöcyten in de ovariële pool.
Koeien met zowel een middelmatig als hoog celgetal kenden een lager percentage van embryo’s die zich tot het blastocyst stadium ontwikkelden op dag 7 en 8 na de bevruchting, in vergelijking met koeien met een laag celgetal. Het schadelijke effect van mastitis op het ontwikkelingsvermogen van de oöcyten in het ovarium is niet gelinkt aan het type mastitis. Ook andere studies bevestigen dat het type van bacterie geen invloed heeft op de reproductieparameters (Barker et al. 1998; Santos et al. 2004). Echter de studie van Asaf et al. (2014) toonde aan dat een infectie met gram-negatieve bacteriën schadelijker zou zijn voor de oöcyten dan een infectie met gram-positieve bacteriën. Een infectie met een gram- negatieve kiem brengt dan ook hogere concentraties van de acute fase proteïnen (serum amyloïd A (SAA) en haptoglobine (Hp)) met zich mee, zowel in het serum als in de melk, in vergelijking met een infectie met een gram-positieve kiem (Suojala et al., 2008). Ook de graad van stijging van het celgetal zou het ontwikkelingsvermogen van de eicellen niet beïnvloeden (schade treedt op vanaf een celgetal van 200.000 cellen/ml melk) (Roth et al., 2013). Rahman et al. (2012) stelden echter vast dat ernstig aangetaste koeien een gedaald aantal secundaire follikels hadden, terwijl er geen effect was op het aantal primordiale en primaire follikels.
1.2. EFFECT VAN HET TIJDSTIP VAN OPTREDEN VAN KLINISCHE MASTITIS
Santos et al. (2004) gingen na wat de invloed is op reproductieparameters van klinische mastitis die vroeg in de lactatie optreedt bij Holstein melkkoeien. De koeien werden opgedeeld in drie groepen en werden opgevolgd gedurende een volledige lactatie (320 dagen in melk). Een eerste groep waarbij mastitis optrad voor de eerste kunstmatige inseminatie (KI) postpartum, een tweede groep die mastitis kregen tussen de eerste KI postpartum en de drachtdiagnose en tenslotte een derde groep waarbij klinische uierontsteking werd gediagnosticeerd na drachtdiagnose. Uit de studie kon men het volgende afleiden: (i) de bevruchtingsresultaten van de eerste KI postpartum alsook de drachtresultaten bij 320 dagen in melk (DIM) waren het laagst voor de eerste en tweede groep koeien, (ii) op het einde van de studie was de proportie drachtige koeien in de controle en de derde groep groter dan bij groep 1 en 2, (iii) het aantal inseminaties per conceptie was het hoogst voor de tweede groep, (iv) de incidentie van abortus was gelijkaardig voor de drie groepen koeien, maar het optreden van klinische mastitis op gelijk welk moment in de lactatie zorgt voor een gestegen incidentie van abortus ten opzichte van de controle groep. Er werden gelijkaardige resultaten gezien bij studies op Jersey koeien (Barker et al., 1998;
Schrick et al., 2001).
Het optreden van subklinische mastitis vroeg in de lactatie zou een gelijkaardig schadelijk effect hebben op de reproductieve parameters als klinische mastitis. Als de subklinische mastitis gevolgd wordt door een klinische uierontsteking ziet men het meest negatieve effect op de reproductieparameters (Schrick et al. 2001).
7 1.3. MECHANISMEN WAARDOOR MASTITIS INVLOED UITOEFENT OP REPRODUCTIEPARAMETERS 1.3.1. Wijzigingen in endocrinologie
Klinische mastitis resulteert in een gedaalde oestrus expressie en soms falen van ovulatie. Dit vindt zijn oorsprong in de verminderde schommelingen in luteïniserend hormoon (LH). Hierdoor is de productie van estradiol-17β (E2) gedaald waardoor de oestrus expressie uitblijft (Hockett et al., 2005). In een studie van Lavon et al. (2011) werd ook een associatie gezien tussen subklinische mastitis en een abnormaal lage expressie van de luteïniserend hormoon/choriogonadotropine receptor (LHCGR) en steroïde genen in zowel de theca als granulosa cellagen. LHCGR is een G-proteïnegekoppelde receptor die de acties van het luteïniserend hormoon (LH) en choriogonadotropine medieert. Ovulatie en luteïnisatie van dominante follikels als gevolg van de LH-piek zou afhankelijk zijn van de expressie van LHCGR (Yang et al., 2012). De daling van LHCGR zorgt voor een reductie van folliculair estradiol en androsteendion in de preovulatiore follikel en is daardoor een belangrijke oorzaak van malfunctie van de preovulatoire follikel. Dit effect werd bij een derde van de geïnfecteerde koeien gezien (Lavon et al., 2011). Bij koeien met acute klinische mastitis was de LH piek afwezig waardoor de ovulatie niet plaatsvond. (Hockett et al. 2005) Dit verklaart de gestegen dagen tot eerste KI bij optreden van klinische mastitis voor de eerste KI postpartum (Barker et al., 1998; Schrick et al., 2001).
We kunnen concluderen dat mastitis de ovulatie verstoort, hieronder wordt dieper ingaan op het mechanisme dat hierachter schuilgaat. Toediening van endotoxine, meer bepaald lipopolysaccharide (LPS) (een bestanddeel van de celwand van gram negatieve bacteriën), zorgt enerzijds voor een suppressie van de LH piek en anderzijds voor een stijging van prostaglandine F2α (PGF2α)(Schrick et al.,2001). In een studie van Akema et al. (2005) op vrouwelijke ratten heeft men ontdekt dat LPS de synthese van γ-aminoboterzuur (GABA) stimuleert in de neuronen van de mediale preoptische zone (mPOA), wat op zijn beurt de LH piek voor ovulatie blokkeert. De mPOA is een onderdeel van de hypothalamus en bevat de neuronen die gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) aanmaken. GnRH wordt van daaruit getransporteerd naar de hypofyse waar het de vrijstelling van de gonadotropinen (LH en FSH) bevordert (Ard, 2013). Vermindering van de suppressieve activiteit van GABA ter hoogte van de mPOA laat de inductie van de LH piek toe (Akema et al., 2005). Het uitblijven van de LH piek zorgt voor een vertraagde of afwezige ovulatie, de gestegen PGF2α zorgt voor een daling van progesteron (P4) (Schrick et al., 2001). Hierdoor worden persisterende follikels of folliculaire cysten gevormd en wordt de preovulatoire secretie van estradiol-17β (E2) verlengd. Eicellen van persisterende follikels kunnen bevrucht worden maar ze bereiken veel minder het 16-cellig stadium dan eicellen afkomstig van groeiende follikels. Een hoge E2 concentratie wordt geassocieerd met een abnormale ontwikkeling van het embryo en wijzigingen in de oviduct waardoor uiteindelijk embryonale sterfte optreedt (Ahmad et al., 1995).
1.3.2. Wijzigingen in folliculaire ontwikkeling
Volgens Rahman et al. (2012) is de gedaalde vruchtbaarheid van koeien die chronische mastitis doormaakten ook te wijten aan het schadelijk effect op de folliculogenese. In deze studie werden melkstalen en ovaria verzameld van 68 koeien en vervolgens werden ze opgedeeld in groepen naargelang de graad van infectie op basis van de infecterende kiem en het celgetal. Men zag in het ovarium, op de plaats waar de follikels rijpen, afwijkingen in het vasculair bed. De zones waar de
vascularisatie verminderd was bevatte ook meer fibreus weefsel. Toch was er geen daling in het aantal primordiale en primaire follikels (Rahman et al., 2012). Dit zou kunnen verklaard worden doordat deze follikels zich normaal gezien in de cortex van het ovarium bevinden, een plaats waar zich weinig bloedvaten bevinden. Een lage bloedtoevoer voor de primordiale en primaire follikels zou van belang zijn om de rusttoestand te behouden (Hermann en Spanel-Borowski, 1998). Maar voor de verdere ontwikkeling en rijping van de follikels en de vorming en functie van het corpus luteum is een goede vascularisatie noodzakelijk (Berisha et al., 2015). Daarnaast is er ook sprake van een direct effect op eicel-specifieke factoren door veranderingen in expressie van maternale genen (Rahman et al., 2012;
Asaf et al., 2014). Deze wijzigingen zouden zich bevinden ter hoogte van stress-gerelateerde genen (PTGS2 en HSF1), genen die een rol spelen in de folliculogenese en vroeg embryonale ontwikkeling (GDF-9 en POU5F1) en tenslotte genen die het celmetabolisme regelen (SLC2A1). Een gedaalde expressie van heat shock transcription factor 1 (HSF1) kan leiden tot een lagere hoeveelheden van heat shock protein (HSP) waardoor de eicellen minder goed stress kunnen verdragen. HSF1 is ook van belang bij de meiose van de oöcyt waardoor mastitis ook geassocieerd wordt met een verminderde embryonale ontwikkeling. Aangezien het gen POU5F1 de vernieuwing van embryonale stamcellen regelt kan verondersteld worden dat wijzigingen aan dit gen zorgen voor een gedaald ontwikkelingsvermogen van eicellen (Asaf et al., 2014). GDF-9 is een van de groeifactoren die de vroege folliculaire groei controleren. Het bevordert de groei van de oöcyt, de proliferatie van de granulosa cellen en de differentiatie van de thecacellen (Leitão et al., 2014). Koeien die een erge vorm van mastitis doormaakten kenden door de gedaalde expressie van GDF-9 een minder effectieve ontwikkeling van de follikels (Rahman et al., 2012). Dit effect op GDF-9 zou voornamelijk aanwezig zijn bij subklinische mastitis en in mindere mate bij acute mastitis (Asaf et al., 2014).
1.3.3. Activatie van het immuunstelsel: vrijstelling van cytokines
Wanneer het afweermechanisme op gang komt, komen onder andere cytokines vrij die mee de inflammatoire reactie sturen. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is daar één van (Jackson et al., 2012).
TNF-α verhindert het stimulerend effect dat FSH uitoefent op de granulosa cellen zodanig dat deze cellen niet meer reageren op LH tijdens de maturatie in het ovarium (Darbon et al., 1989). Suppressie van LH tast het rijpingsproces van de eicel aan en verhindert de expansie van de cumulus cellen (Schrick et al., 2001). In de studie van Jackson et al. (2012) heeft men gekeken naar het effect van de blootstelling aan TNF-α op de ontwikkeling van in vitro bevruchte runderembryo’s. Het resultaat van deze studie was dat het aantal oöcyten die ontwikkelen tot blastocyst gedaald was indien de oöcyten blootgesteld waren aan TNF-α. Echter de studie van Soto et al. (2003b) beweert dat als de blootstelling aan TNF-α plaatsvindt wanneer de oöcyt reeds bevrucht werd en een embryo werd gevormd dan zouden deze embryo’s wel tot het blastocyst stadium kunnen ontwikkelen. Het cytokine heeft dan weer wel een schadelijk effect vanaf dat het embryo het 9-cellig stadium heeft bereikt, men ziet dan een gestegen apoptose van de blastomeren (Soto et al., 2003b).
Bacteriën zorgen voor een gestegen secretie van prostaglandine-F2α (PGF2α). Dit is ook een mediator van de inflammatie en kan aanleiding geven tot premature luteolyse (Hockett et al., 2004;
Huszenicza et al., 2004; Santos et al., 2004). Daarnaast heeft PGF2α ook een schadelijk effect op de
9 eicellen. Bij blootstelling tijdens de maturatie was het aantal eicellen dat het blastocyststadium bereikten op dag 8 gedaald. Anderzijds, als de blootstelling aan PGF2α plaatsvindt na de bevruchting ziet men
geen effect op het delingsritme of de proportie eicellen die ontwikkelen tot blastocyst op dag 8 (Soto et al., 2003a). Ook koorts kan een gestegen productie van PGF2α veroorzaken (Santos et al., 2004).
Naast het ontwikkelingsvermogen schaadt mastitis ook de nucleaire en cytoplasmatische maturatie van de oöcyten. Bovendien zouden de wijzigingen in transcriptielevels in de oöcyt overgedragen worden naar het viercellig embryostadium (Asaf et al. 2014). In een studie van Soto et al. (2003a) heeft men gezien dat blootstelling aan hoge concentraties van lipopolysaccharide (LPS) schadelijk is voor de eicellen. Er was een reductie in oöcyten die het blastocyst-stadium op dag 8 na bevruchting bereiken.
Men zag ook een gedaald delingsritme van de eicellen. Naast het schadelijk effect dat LPS rechtstreeks heeft op de oöcyten zorgt het daarnaast ook voor een gestegen synthese van stikstofoxide (NO). LPS is een transcriptionele activator van stiktstofoxide synthase-2 (NOS2) dat macrofagen stimuleert om grote hoeveelheden NO vrij te stellen (Bogdan, 2015). Ook TNF-α en PGF2α kunnen verantwoordelijk zijn voor een stijging van NO (Soto et al., 2003a). Stikstofoxide heeft geen effect op het delingsritme of het percentage van eicellen die het blastocyst-stadium bereiken indien de blootstelling plaatsvindt tijdens de maturatie van de eicellen. Echter wanneer de eicellen in contact komen met hoge concentraties van NO na de bevruchting kunnen de oöcyten zich niet meer ontwikkelen tot blastocyst (Soto et al, 2003a). Hieruit zouden we kunnen concluderen dat vooral de afweerreactie van de gastheer Figuur 2. Mogelijke processen die in gang worden gezet na intramammaire infectie die een effect hebben op de eicel en het embryo. Centraal staat de vrijstelling van cytokines, dit kan zowel rechtstreeks in de uier en drainerende lymfeknopen als in andere weefsels als antwoord op uit de melkklier gestuurde signalen. (Uit Hansen et al., 2004)
op de infectie aanleiding geeft tot een daling in fertiliteit en dat het type van infectie waarschijnlijk ook de omvang van de afweerreactie van de gastheer bepaalt.
1.3.4. Klinische mastitis gaat gepaard met een stijging van de lichaamstemperatuur
Een gestegen temperatuur kan zowel de deling als maturatie van de eicellen verstoren, hierdoor is het aantal embryo’s dat het blastocyst stadium bereiken gedaald. De mate van temperatuurstijging bepaalt de schade die wordt toegebracht. Hoe hoger de temperatuur, hoe groter de schade. Ook het stadium waarin de oocyt zich bevindt gedurende de stijging speelt een rol. De eicel is vooral tijdens de eerste 12 uur van de rijping gevoelig voor hitte. Dit zou te wijten zijn aan wijzigingen in de eiwitsynthese en het onvermogen om heat shock proteïnen te induceren (Edwards en Hansen,1996) want deze eiwitten bieden bescherming tegen te hoge temperaturen (Asaf et al., 2014).
2. H ET EFFECT VAN MASTITIS OP HET EMBRYO
Er zijn verschillende oorzaken voor embryonale sterfte waaronder infecties of ook niet-infectieuze activatie van het immuunstelsel een belangrijke factor zijn. Zelfs als deze immuunrespons geactiveerd wordt buiten het voortplantingsstelsel kan dit een fataal effect hebben op het embryo (Hansen et al.2004;
Gilbert, 2012). Deze sterfte kan al optreden vooraleer het vruchtje de baarmoeder bereikt heeft. (Hansen et al., 2004).
2.1. HET EFFECT VAN CYTOKINEPRODUCTIE
Ooien die vroeg in de dracht (5 dagen na dekking) blootgesteld werden aan peptidoglycaan- polysaccharide (PG-PS), een onderdeel van de celwand van grampositieve bacteriën, ondergingen een systemische immuunrespons die resulteerde in koorts, vaginale uitvloei en gestegen concentraties van TNF-α (een pro-inflammatoir cytokine), SAA (een merker van inflammatie) en Hp (anti-inflammatoir agens) (Dow et al., 2010). Een infectie van de melkklier die resulteert in mastitis gaat ook gepaard met een stijging van SAA en Hp in het serum en in de melk (Suojala et al., 2008; Sadek et al., 2017).
Hill en Gilbert (2008) kweekten embryo’s in een cultuurmedium dat aangelengd werd met spoelingsvocht uit een ontstoken baarmoeder. De embryo’s vertoonden een gedaalde kwaliteit van de blastocyst, met een daling van het totaal aantal cellen. Daarnaast was er ook een daling van het aantal trofectoderm cellen en een daaruit voortkomende stijging van de binnenste celmassa:trofectoderm ratio.
Dit alles resulteert in een gedaalde leefbaarheid van het embryo (Gilbert, 2012). We zouden dus kunnen concluderen dat een maternale infectie met een daaropvolgende afweerreactie een negatief milieu creëert voor het embryo. Bij een bacteriële infectie worden de membraancomponenten LPS en PG-PS van de gram-negatieve respectievelijk gram-positieve bacterie herkend door Toll-like receptoren (TLRs), een onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. Dit zet de inflammatoire respons in gang want TLRs activeren de macrofagen om anti-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en verschillende interleukines vrij te stellen. Naast cytokines worden de macrofagen ook gestimuleerd om antimicrobiële eiwitten te produceren waaronder het stikstofoxide synthase dat instaat voor de productie van NO.
Macrofagen kunnen ook geactiveerd worden via het adaptieve immuunsysteem, namelijk door IFN-γ
11 dat vrijgesteld wordt door T-helper-1 cellen (Medzhitov, 2007). De moleculen die vrijkomen bij de afweerreactie van het moederdier beïnvloeden de kwaliteit en leefbaarheid van het embryo (Haddad et al., 1997; Leazer et al., 2002; Dow et al., 2010; Gilbert, 2012; Wuu et al., 2012)
LPS zelf is niet toxisch voor het embryo, de toxiciteit van LPS zit hem in de activatie van de maternale acute fase respons (Leazer et al., 2002). Deze respons is een vroege maar niet specifieke reactie die onder andere ontstaat bij een bacteriële infectie. De weefselmacrofaag is in de meeste gevallen de initiator van de reactie die een gamma aan mediatoren vrijstelt na stimulatie door bacteriën (Koj, 1996).
Cytokines kunnen geproduceerd worden door zowel de foetale als maternale cellen in de placenta. TNF- α, IFN-γ en IL-2 zijn de cytokines die de grootste schade veroorzaken. TNF-α kan thrombose en contractie van gladde spieren veroorzaken. Dit cytokine wordt gevormd door macrofagen en gaat de NK cellen stimuleren om IFN-γ vrij te stellen, dat op zijn beurt de macrofagen extra gaat stimuleren om TNF-α te produceren. Uiteindelijk zijn het de NK cellen die het embryo zullen doden (Entrican, 2002).
Daarnaast stimuleert LPS zelf de vrijstelling van IFN-γ door Thelper-1 en NK cellen (zie figuur 3) (Haddad et al., 1997; Entrican, 2002). IFN-γ geeft een signaal aan de macrofagen om naast TNF-α ook
Figuur 3. (Uit Mayer en Nyland, 2017)
de NO productie in gang te zetten dat op zijn beurt tot embryonale sterfte kan leiden (Haddad et al., 1997). De ergheid van de gevolgen voor het embryo zou afhankelijk zijn van de hoeveelheid TNF-α die wordt vrijgesteld door het moederdier als reactie op de blootstelling aan LPS (Leazer et al., 2002). De eicel zou gevoeliger zijn voor lagere concentraties van TNF-α dan het embryo (Soto et al., 2003b). Bij muizen zag men infarcten ter hoogte van de placenta en anoxie van de vrucht wat doet vermoeden dat de schade zich vooral lokaliseert ter hoogte van de vascularisatie in de placenta (Leazer et al., 2002).
TNF-α zou, onder andere, ervoor zorgen dat het embryo prostaglandines produceert en deze prostaglandine productie is schadelijk voor de eigen ontwikkeling. De stijging van prostaglandineproductie door TNF-α werd ook in vivo gezien ter hoogte van het boviene endometrium (Jackson et al., 2012).
Muizenembryo’s die blootgesteld werden aan het cytokine hadden een gedaalde binnenste celmassa (Wuu et al., 1999). Dit fenomeen werd geassocieerd met een gestegen aantal cellen die in apoptose gingen (Wuu et al., 1999; Soto et al., 2003b). In de studie van Soto et al. (2003b) heeft men gezien dat TNF-α apoptose induceert bij ontwikkelende embryo’s vanaf het negencellig stadium, maar zou weinig tot geen effect hebben op het twee- en viercellig embryo. TNF-α bezit namelijk de mogelijkheid om de cascade van celdood in gang te zetten door te binden op de TNF-receptor. Het is mogelijk dat embryo’s in een vroeg stadium minder gevoelig zijn voor TNF-α-geïnduceerde apoptose door een lagere expressie van de TNF-receptor. Ondanks het feit dat er meer apoptose optrad bij de embryo’s, konden zij toch ontwikkelen tot het blastocyst-stadium (Soto et al., 2003b). Wanneer men deze embryo’s in vitro liet innestelen waren zij minder succesvol om hun cellen gestructureerd in een cluster vast te houden ter hoogte van de trofectoderm uitgroei. Hoewel men geen verschil kon vinden in de gemiddelde oppervlakte van zowel de behandelde (blootstelling aan TNF-α) als onbehandelde embryo’s na uitgroei, hadden de vruchtjes die blootgesteld waren aan het cytokine opvallend minder nucleï (Wuu et al., 1999).
Wanneer de embryo’s ingeplant werden in recipiënt muizen zag men geen verschil in het aantal ingenestelde embryo’s uit de behandelde en controlegroep, maar bij de behandelde groep trad meer resorptie van de vruchtjes op (Wuu et al., 1999). Dit zou kunnen verklaard worden door het feit dat de trofectoderm cellen instaan voor de productie van interferon tau (IFN-τ). Aangezien voornamelijk deze cellen aangetast zijn, veronderstelt men dat het embryo moeite heeft om de baarmoeder te informeren over een geslaagde bevruchting waardoor het moeilijk wordt om de dracht in stand te houden (Gilbert, 2012). Bij ooien die blootgesteld waren aan PG-PS zag men op dag 14 en dag 21 een verlaagde concentratie van progesteron, dit wijst erop dat corpora lutea regresseren. Dit kan men eveneens verklaren door een niet geslaagde maternale herkenning van de vrucht (Dow et al., 2010). De blootgestelde vruchtjes die overleefden na embryotransplantatie naar recipiënt muizen hadden een lager gewicht ten opzichte van de controlegroep (Wuu et al., 1999).
De vraag blijft wel of koeien die een periode van uierontsteking doormaken een dermate gestegen concentratie aan TNF-α bekomen zodat het schadelijk zou zijn voor het embryo (Soto et al., 2003b;
Jackson et al., 2012).
13 2.2. HET EFFECT VAN PROSTAGLANDINEPRODUCTIE
Tijdens de ontstekingsreactie treedt er in verschillende weefsels een verhoogde synthese van prostaglandine F2α op. Deze synthese wordt voornamelijk gestimuleerd door LPS, NO en cytokines zoals TNF-α en interleukine-1 β (Soto et al., 2003a). Men heeft in verschillende studies kunnen aantonen dat PGF2α een schadelijk effect heeft op het ontwikkelende embryo (Buford et al., 1996; Hockett et al., 2004; Scenna et al., 2004).
Frequente injecties met PGF2α van dag 4 tot 7 of van dag 5 tot 8 na bevruchting zorgde voor een regressie van het corpus luteum. Dit verlies werd gecompenseerd door toediening van progesteron.
Toch had de groep dieren die deze behandeling kregen een lager drachtigheidspercentage (Buford et al., 1996). De overlevingskansen van het embryo werden groter indien men het regresserende corpus luteum verwijderde en als de koe flunixine meglumine, een inhibitor van de synthese van PGF2α, toegediend kreeg (Buford et al., 1996). Dit zou erop kunnen wijzen dat PGF2α verantwoordelijk is voor de synthese van een embryotoxische molecule die zijn origine vindt in het corpus luteum (Hansen et al., 2004).
Een gelijkaardig studie van Hockett et al. (2004) versterkt dit vermoeden. Hierbij werden embryo’s van 70 koeien (vleeskoeien) onderzocht op het effect van maternale administratie van PGF. Ze werden allen gesupplementeerd met progesteron vanaf dag 3 tot 8 na kunstmatige inseminatie. De groep werd willekeurig in een behandelings- en controlegroep gesplitst waarbij de behandelde groep PGF intramusculair toegediend kreeg en de controlegroep een zoutoplossing. De embryo’s werden gespoeld en gecontroleerd op kwaliteit en ontwikkeling op basis van volgende parameters: vorm, ontwikkelingsstadium, leefbaarheid, afwijkingen. De embryo’s kregen een score toegekend tussen 1 en 4, score 1 werd gegeven aan een normaal en gezond embryo en score 4 aan embryo’s die een vertraagde of degeneratieve groei kenden of wanneer ze niet meer leefbaar waren. In de behandelde groep kregen slechts enkele embryo’s score 1, het merendeel kreeg score 4, terwijl bij de controle groep geen enkel embryo deze slechte score kreeg. Embryo’s met een score van 1, 2 of 3 kwamen nog in aanmerking voor embryotransplantatie. Alle embryo’s van de controlegroep zou men kunnen transplanteren naar draagkoeien, van de behandelde groep zou dit slechts bij 36% mogelijk zijn.
In een studie van Scenna et al. (2004) onderzocht men het effect van PGF2α op de ontwikkeling van het embryo op verschillende tijdstippen (voor en na de compactie). Embryo’s die zich bevonden in het 16 tot 32-cellig stadium (voor de compactie) kenden een verminderde ontwikkeling tot blastocyst indien zij blootgesteld werden aan PGF2α. Wanneer men PGF2α toevoegde aan het cultuurmedium van embryo’s in het morula stadium (na compactie) zag men geen wijzigingen in de ontwikkeling tot blastocyst. Maar het aantal embryo’s dat uiteindelijk uitkipt was wel gedaald ten opzichte van de controle groep.
2.3. HET EFFECT VAN EEN GESTEGEN TEMPERATUUR
Bevruchte eicellen die gekweekt werden in cultuur aan 40°C hadden een gedaald vermogen om te ontwikkelen: er was een lager percentage aan oöcyten die zich omgevormd hadden tot morula of blastocyst zes dagen na de bevruchting. De embryo’s die gekweekt werden in het milieu van 40°C hadden een kleiner aantal cellen en minder trofectoderm cellen dan embryo’s die zich in een milieu van
38,5°C bevonden (Sakatani et al., 2012). De morula zou veel beter bestand zijn tegen een stijging in temperatuur dan het embryo in het twee- tot achtcellig stadium (Edwards en Hansen, 1997).
3. H ET EFFECT VAN MASTITIS OP DE FOETUS
3.1. ENDOTOXEMIE VEROORZAAKT FOETALE STERFTE
In de studie van Xu et al. (2006b) waarbij men drachtige muizen injecteerde met LPS in het laatste stadium van de dracht was er een stijging in foetale sterfte. Deze stijging was afhankelijk van de toegediende dosis van LPS. Dit effect zou het gevolg zijn van de maternale reactie op de administratie van het endotoxine, waarbij TNF-α een belangrijke mediator blijkt van de LPS-geïnduceerde foetale sterfte (Silver et al., 1994). Een verklaring hiervoor is mogelijks een verstoorde integriteit van de placenta aangezien schade aan de placenta waarneembaar is na toediening van het endotoxine aan drachtige muizen (Gendron et al., 1990; Silver et al., 1994).
3.2. HET EFFECT OP HET CENTRAAL ZENUWSTELSEL VAN DE FOETUS
Het effect dat maternale LPS toediening heeft op het foetale brein zou eerder het gevolg zijn van een indirecte werking ter hoogte van de placenta langs moeders kant dan van een direct effect op de foetus zelf (Ashdown et al., 2006). Na maternale blootstelling aan LPS vindt er een stijging van TNF-α, IL-1β en IL-6 plaatst ter hoogte van de placenta. Dit effect wordt meest waarschijnlijk veroorzaakt door de stimulerende werking die LPS uitoefent op de placentale cellen waardoor de expressie van inflammatoire mediatoren verhoogd wordt (Ashdown et al., 2006). In de hersenen van de foetussen ziet men een inductie van TNF-α en IL-1β mRNA wanneer het moederdier een endotoxemie ondergaat. Via immunohistochemie heeft men gezien dat er belangrijke veranderingen zichtbaar zijn op de myelinesatie en astrogliose in het neonatale brein na maternale toediening van LPS (Cai et al., 2000). Aangezien men in meerdere studies (Ashdown et al., 2006; Hutton et al., 2007) geen bewijs kon vinden dat LPS door de placenta kan migreren is een direct effect van dit endotoxine minder waarschijnlijk. Na intraperitoneale toediening aan drachtige ratten kon men LPS terug vinden in de maternale weefsels zoals bloed, lever, nier en placenta. Echter in de foetus was het afwezig, alsook een inductie van cytokines in de foetale lever en de hersenen was niet waarneembaar (Ashdown et al., 2006).
In de studie van Lanté et al. (2007), waarbij drachtige muizen blootgesteld werden aan LPS in de late dracht, merkte men een gegeneraliseerde oxidatieve stress op ter hoogte van de hippocampus van de foetussen. Hierdoor hadden deze nakomelingen een abnormale werking van de synaps en van bepaalde processen in het ruimtelijk inzicht. Indien er prenataal een behandeling plaatsvond met antioxidantia, waren er geen abnormaliteiten. Opmerkelijk is dat in deze studie enkel de nakomelingen van het mannelijk geslacht aangetast waren.
In een studie van Hutton et al. (2007) werden drachtige ooien met LPS geïnjecteerd in de uteriene arterie. In deze studie spitsten men zich vooral toe op afwijkingen in het cerebellum die veroorzaakt werden door de ontstekingsreactie die volgde op de endotoxemie. Volgende afwijkingen werden gevonden: activatie van microgliacellen, macrofagen infiltratie, gestegen lipideperoxidatie, albumine
15 opname door Purkinje- en andere cellen en tenslotte een gestegen expressie van een eiwit typisch voor een apoptose in een laat stadium. De verklaring voor deze effecten is onduidelijk. LPS kon niet gedetecteerd worden in de foetale circulatie en ook de concentraties van cytokines zoals TNF-α, IL-1β en IL-6 waren slechts matig gestegen. Bovendien is niet bewezen dat het cerebellum specifiek gevoelig is voor de foetale hypoxemie en acidose en de maternale hyperthermie die optreedt als reactie op de LPS administratie. Opvallend was dat de laagste dosis van LPS resulteerde in de hoogste kans op foetale sterfte. Het zou mogelijk zijn dat elke dosis van LPS een verschillende respons veroorzaakt en dus resulteert in verschillende graden van hersenschade.
3.3. HET EFFECT OP DE FOETALE GROEI
3.3.1. Aantasting van de werking van de placenta
De placenta staat in voor het transport van nutriënten, respiratoire gassen naar de foetus en afvoer van afvalstoffen gevormd door het foetale metabolisme. Een goede placentale groei is noodzakelijk voor de groei van de foetus. De bloedvloei verandert in de loop van de dracht en de umbilicale bloedvloei stijgt opvallend in de late dracht zodat kan voldoen worden aan de hoge metabole noden van de snel groeiende vrucht (Wu et al., 2006). Bij koeien heeft men gezien dat er een sterke correlatie is tussen het gewicht van het pasgeboren kalf en de totale cotyledonaire oppervlakte van de placenta (Kamal et al., 2017).
Uteroplacentale bloedvloei is een belangrijke factor dat de beschikbaarheid van voedingsstoffen voor de groei en ontwikkeling van de foetus beïnvloedt. De efficiëntie van de placenta wordt niet alleen bepaalt door het gewicht en de grootte van de placenta maar ook door de microvasculaire densiteit.
Daarnaast speelt de interdigitatie van de placenta met het maternale endometrium ook een rol, want dat zorgt ervoor dat een zo groot mogelijk contactoppervlak nagestreefd wordt. Tenslotte is de bloedvoorziening van de placenta bepalend voor een efficiënte werking. Het transplacentale transport van stoffen wordt bepaald door zowel de bloedvloei en de concentratie van de stof in het arteriële en veneuze bloed. Reductie in placentale groei, angiogenese en placentale vascularisatie worden geassocieerd met een gedaald placentaal transport van zuurstof en nutriënten van de moeder naar de foetus (Wu et al., 2006).
LPS administratie in de tweede helft van de dracht veroorzaakt bij drachtige ratten een daling van het gewicht, de oppervlakte en de dikte van de placenta, alsook een gedaalde verhouding van het placentaal gewicht ten opzichte van het foetaal gewicht. Deze afwijkingen aan de placenta zouden te wijten zijn aan een gedaalde perfusie van de placenta (Cotechini et al., 2014b). In de studie van Lang et al. (2003) heeft men ook gezien dat restrictie van de uteriene bloedvloei in het laatste derde van de dracht aanleiding geeft tot wijzigingen in het groeipatroon van de foetus en placenta. Er treedt een algemene restrictie van de foetale ontwikkeling op. Deze afwijkingen in de placenta zouden dus de foetale groeirestrictie kunnen verklaren, echter de studie van Straley et al. (2014) spreekt dit tegen. De verklaring voor een ongewijzigd foetaal gewicht zou liggen in een compensatie die optreedt in de placenta.
TNF-α zou een grote rol spelen in het ontstaan van gedaalde perfusie van de placenta. Als reactie op LPS administratie stelt het moederdier TNF-α vrij. Dit cytokine is onder andere verantwoordelijk voor een stijging van de arteriële druk. Door de gestegen concentratie van TNF-α in het bloed en de gestegen arteriële bloeddruk zou er een restrictie ontstaan in de uteroplacentale perfusie en dit zou leiden tot de foetale groeirestrictie. Deze concentratiestijging en bloeddrukwijziging zou enkel plaatsvinden bij drachtige dieren. (Cotechini et al., 2014a)
3.3.2. Aantasting van het foetale skelet
Wanneer men LPS toedient aan het moederdier, ziet men een stijging van het mRNA van TNF-α in de maternale lever en de placenta. Een enkele dosering van LPS brengt een significante stijging van de TNF-α concentratie teweeg in het maternaal serum en het amnionvocht. Daarnaast zag men ook een stijging van de lipide peroxidatie in de maternale lever en de placenta. Daarenboven veroorzaakt LPS administratie een gluthatione depletie in de lever van zowel de moeder als de foetus. Dit kan erop wijzen dat LPS niet alleen zorgt voor een stijging van TNF-α, maar dat ook mechanismen als ROS en NO een aandeel hebben in de aantasting van de foetussen door LPS administratie (Xu et al., 2006a).
In de studie van Xu et al. (2006b) injecteerde men intraperitoneaal LPS bij muizen in een laat stadium van de dracht. Man zag naast een daling in het foetaal gewicht ook een vermindering in de lengte van de kroon tot de romp en de staartlengte. Daarenboven zag men een vertraagde ossificatie in de caudale vertebra, de phalangen en het supraoccipitaal bot. Deze effecten zouden deels te wijten zijn aan de vorming van radicalen (ROS) als reactie op de blootstelling aan LPS. Deze radicalen kon men terugvinden in de lever van de moeder en in de placenta, daarnaast zou ook de foetale lever te maken krijgen met oxidatieve stress. Wanneer men de muizen behandelde met een stof die radicalen capteert werden de negatieve effecten ongedaan gemaakt. Xu et al. (2006a) heeft een gelijkaardige studie uitgevoerd maar deze keer om de bijdrage van TNF-α te onderzoeken. Aangezien de effecten van de LPS toediening teniet worden gedaan wanneer men een inhibitor van de TNF-α synthese toedient, kan men afleiden dat TNF-α ook betrokken is in de LPS-geïnduceerde foetale sterfte, de foetale groeirestrictie en de vertraagde ontwikkeling van het skelet (Xu et al., 2006a).
17
ONDERZOEK
1. M ATERIAAL EN M ETHODEN
1.1. BEDRIJVEN EN DIEREN
De data die gebruikt werden in dit onderzoek zijn afkomstig van drie Oost-Vlaamse melkveebedrijven, de schoolhoeve Axelwalle in Oudenaarde, de proefboerderij van het ILVO in Melle en tot slot de proefhoeve van de Universiteit van Gent, Agri-Vet, in Melle. In totaal werden de gegevens van 146 volledige lactaties van melkkoeien verzameld. De cijfers werden afgelezen van de MPR-uitslagen die maandelijks geregistreerd werden door het CRV in de periode van 2010 tot 2013. Van de 147 koeien waren er 78 die hun eerste lactatie doormaakten, bij de geboorte van hun onderzochte kalf waren dit dus de tweede-kalfs koeien. De kalveren werden bij de geboorte onderzocht op gewicht, hoogte, kop- staart lengte, borstomtrek, schouderbreedte en bekkenbreedte.
1.2. STATISTIEK
Een eerste data-verwerking en beschrijvende statistiek gebeurde in Microsoft® Excel® 2016. Op die manier werd een dataset met gegevens van 146 kalf-moederdier paren bekomen, bestaande uit de volgende elementen.
Benaming Beschrijving Herd Bedrijf van afkomst
ID_SANITEL Geregistreerd Sanitel oornummer van de koe
C_PREVCALV De kalfdatum van de voorgaande kalving
LACT Geeft weer in de hoeveelste lactatie het dier zich bevond
DAT_DRY Datum van droogzetten
C_CALV De laatste kalfdatum
QUARTER Kwartaal waarin de koe kalfde
C_DRACHT De drachtduur (in dagen)
C_dr_lact Het aantal dagen dat het dier drachtig was tijdens de laatste lactatie
SKM Het aantal keer dat het SCC verhoogd was tijdens de lactatie
TRIM1 Het aantal keer dat het SCC verhoogd was in de eerste trimester van de dracht
TRIM2 Het aantal keer dat het SCC verhoogd was in de tweede trimester van de dracht
TRIM3 Het aantal keer dat het SCC verhoogd was in de derde trimester van de dracht
PRECONC Het aantal keer dat het SCC verhoogd was voor de conceptiedatum
SKM_SCORE De som de graden per meting gedurende de volledige lactatie waarbij graad 1 werd toegekend aan een SCC tussen 250.000 en 500.000 cellen/mL melk en graad 2 aan een SCC hoger dan 500.000 cellen/mL
CA_WEIGHT Geboortegewicht van het kalf
CA_GIRTH Borstomtrek van het kalf bij de geboorte
Voor het analyseren van de volledige dataset werd gebruik gemaakt van R 3.4.0. ®
Vooraleer de statistische modellen uit te werken, werd de normaliteit van de verschillende variabelen geëvalueerd op basis van de Kolmogorov-Smirnov test en het bekijken van Q-Q plots. Vervolgens werden lineaire mixed-effect modellen opgesteld, met als uitkomstvariabele het geboortegewicht van het kalf. M.b.v. ANOVA-procedures werden de modellen onderling vergeleken en op die manier het model uitgekozen dat het geboortegewicht van het kalf het best verklaarde a.h.v. de hogervermelde factoren. Hetzelfde werd uitgevoerd voor de borstomtrek van het kalf. Als significantieniveau werd steeds P<0.05 gebruikt.
19
2. R ESULTATEN
2.1. DEEL 1:BESCHRIJVENDE STATISTIEK
Aangezien het geboortegewicht van het kalf kan verschillen naargelang de pariteit (Kertz et al., 1997) hebben we een onderscheidt gemaakt tussen de koeien in eerste lactatie en de koeien vanaf de tweede lactatie zoals in onderstaande tabel wordt weergegeven.
Aantal koeien in
eerste lactatie 78 Aantal koeien vanaf de tweede lactatie 68
In de onderstaande tabel (Tabel 1.) staan de belangrijkste variabelen opgelijst met hun gemiddelde en standaardafwijking.
Tabel 1.
Variabele Gemiddelde Standaardafwijking
LACT 1,94 1,31
C_DRACHT (in dagen)
277,70 67,85
C_dr_lact (in dagen)
218,99 67,85
DAYS_DRY (in dagen)
58,71 18,04
SKM 1,33 1,79
TRIM1 0,32 0,73
TRIM2 0,37 0,65
TRIM3 0,21 0,42
PRECONC 0,42 0,76
SKM_SCORE 1,90 2,67
CA_WEIGHT 42,30 5,17
CA_GIRTH 80,97 3,44
2.2. DEEL 2:FACTOREN MET INVLOED OP HET GEBOORTEGEWICHT EN DE BORSTOMTREK VAN HET KALF
2.2.1. De incidentie van subklinische mastitis tijdens de lactatie heeft een effect op het geboortegewicht van het kalf
Er is een significant verschil (P<0,05) waarneembaar in het geboortegewicht voor het aantal verhogingen van het SCC in een lactatie (zie Figuur 4.). De koeien met het meest aantal stijgingen van het SCC hadden de lichtste kalveren. Het gemiddelde van het geboortegewicht van de kalveren van koeien die het meest stijgingen hadden lag 5,95 kg lager dan bij koeien die nooit een verhoogd SCC hadden. Het aantal verhogingen heeft echter geen significante invloed op de borstomtrek bij de geboorte van het kalf, hoewel wel een trend te zien is van een lager geboortegewicht bij een groot aantal verhogingen (zie Figuur 5.).
SKM
Gemiddelde van CA_WEIGHT
0 41,25
1 44,28
2 42,41
3 41,83
4 42,48
5 41,48
6 43,87
7 39,10
8 35,30
Eindtotaal 42,30
Figuur 4: Tabel 2 met grafiek
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Gemiddeld geboortegewicht
SKM
Het effect van het aantal verhogingen
van het SCC op het geboortegewicht
21 2.2.2. De graad van subklinische mastitis tijdens de lactatie heeft een effect op het
geboortegewicht van het kalf.
Het effect van de graad van de verhoging van het SCC op het geboortegewicht van het kalf is significant op het 90%-niveau (P-waarde is 0,1) (zie Figuur 6.). Hoe vaker een koe een sterke stijging doormaakt van haar SCC, hoe lager het geboortegewicht zal zijn van het kalf waarvan de koe drachtig was tijdens die lactatie. Het verschil in geboortegewicht tussen de hoogste en laagste score bedraagt 4,75 kg. Er was ook deze keer geen significant effect van de graad van stijging op de borstomtrek van het kalf nochtans geeft ook hier de grafiek de indruk van wel (zie Figuur 7.).
SKM
Gemiddelde van CA_GIRTH
0 80,52
1 82,07
2 80,62
3 81,50
4 81,40
5 80,83
6 81,00
7 78,00
8 76,00
Eindtotaal 80,97
Figuur 5.: Tabel 3. met grafiek
SKM_Score
Gemiddelde van CA_WEIGHT
0 41,25
1 44,87
2 43,47
3 42,06
4 40,60
5 42,10
6 42,20
7 41,70
8 43,70
9 44,80
10 43,90
11 33,00
12 37,60
13 36,50
Eindtotaal 42,30
Figuur 6.: Tabel 4 met grafiek
72,00 73,00 74,00 75,00 76,00 77,00 78,00 79,00 80,00 81,00 82,00 83,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Borstomtrek kalf bij geboorte
SKM
Het effect van het aantal verhogingen op de borstomtrek van het kalf bij
geboorte
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Gemiddeld Geboortegewicht
SKM_Score
Het effect van de graad van verhoging
op het geboortegewicht
2.2.3. De incidentie van subklinische mastitis in trimester 1 van de dracht heeft een effect op de borstomtrek van het kalf
TRIM1
Gemiddelde van CA_GIRTH
0 81,25
1 79,87
2 79,38
3 80,20
Eindtotaal 80,97
Figuur 8: Tabel 6 met grafiek
De data-analyse heeft aangetoond dat het aantal stijgingen van het SCC die plaatsvinden in de eerste trimester van de dracht een significant effect (P<0,05) hebben op de borstomtrek van het kalf bij de geboorte (zie Figuur 8.). Het geboortegewicht zou niet lijden onder het aantal stijgingen van het SCC in
SKM_Score
Gemiddelde van CA_GIRTH
0 80,52
1 82,39
2 81,41
3 81,00
4 79,71
5 82,00
6 81,25
7 81,67
8 81,67
9 82,00
10 80,00
11 74,00
12 78,00
13 76,00
Eindtotaal 80,97 .
Figuur 7. Tabel 5 met grafiek
68,00 70,00 72,00 74,00 76,00 78,00 80,00 82,00 84,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Borstomtrek kalf bij geboorte
SKM_Score
Het effect van de graad van verhoging op de borstomtrek
78,00 78,50 79,00 79,50 80,00 80,50 81,00 81,50
0 1 2 3
Borstomtrek Kalf bij geboorte
aantal stijgingen TRIM1
Effect van het aantal stijgingen in
trimester 1 op de borstomtrek
23 de eerste trimester van de dracht, maar ook hier doet de grafiek vermoeden van wel (zie Figuur 9.). Met deze cijfers lijkt het alsof de waarden van het kalf weer stijgen na 3 verhogingen van het SCC, maar aangezien er slechts één dier was met 3 stijgingen in het eerste trimester geeft dit een vertekend beeld.
TRIM1
Gemiddelde van CA_WEIGHT
0 42,48
1 41,61
2 39,95
3 43,78
Eindtotaal 42,30
Figuur 9.: Tabel 7 met grafiek
38,00 39,00 40,00 41,00 42,00 43,00 44,00 45,00
0 1 2 3
Geboortegewicht kalf
TRIM1
Effect van het aantal stijgingen in
trimester 1 op het geboortegewicht
3. D ISCUSSIE
In deze studie hebben we gezien dat de incidentie van subklinische mastitis en de graad van subklinische mastitis tijdens de lactatie een significant effect heeft op het geboortegewicht van het kalf.
Daarenboven heeft de incidentie van subklinische mastitis tijdens de eerste trimester van de dracht een effect op de borstomtrek van het kalf bij de geboorte. In de studie van Lundborg et al. (2003) heeft men ook gezien dat het optreden van klinische mastitis en het celgetal van de koe in de late dracht geassocieerd zijn met de grootte van het pasgeboren kalf.
Een verklaring voor dit effect zou kunnen liggen in de oxidatieve stress die ontstaat bij een ontsteking (Turk et al., 2012). In de studie van Xu et al. (2006b) heeft men gezien dat vruchtjes van ratten die aan oxidatieve stress zijn blootgesteld geweest, een gedaald foetaal gewicht hadden.
Daarnaast kan ook de vrijstelling van TNF-α een rol spelen in de groeirestrictie van het kalf. TNF-α heeft op zowat elk ontwikkelingsstadium van de vrucht een negatieve invloed. Studies hebben aangetoond dat de ontwikkeling van zowel de eicel (Jackson et al., 2012), het embryo (Wuu et al., 1999; Soto et al., 2003b) als de foetus (Xu et al., 2006a) worden afgeremd bij blootstelling aan TNF-α. Daarenboven toonden Leazer et al. (2002) aan dat de schade die door blootstelling aan TNF-α toegebracht wordt aan het embryo concentratieafhankelijk is. Dit zou in onze studie een verklaring kunnen zijn waarom de graad van stijging van het SCC een effect heeft op de borstomtrek van het kalf. Het zou dus kunnen dat de groeirestrictie die ontstaat bij een klinische mastitis het gevolg is van een dermate stijging van TNF- α.
Een andere verklaring voor de groeirestrictie kan liggen in een aantasting van de functie van de placenta. Aangezien de placenta instaat voor het transport van nutriënten naar de foetus is het niet ondenkbaar dat een verstoring van deze functie kan leiden tot een gedaald gewicht. LPS administratie leidt bij drachtige ratten tot een gedaalde perfusie van de placenta (Cotechini et al., 2014b). In de studie van Lang et al. (2003) heeft men aangetoond dat een wijziging van de bloedtoevoer naar de placenta kan leiden tot een restrictie van de foetale ontwikkeling.
Het merendeel van de studies die het effect van een maternaal ontstekingsproces op de ontwikkeling van de vrucht hebben onderzocht, zijn uitgevoerd op muizen en ratten. De vraag blijft of de resultaten van deze studies kunnen worden ge-extrapoleerd naar andere diersoorten zoals het rund.
Desalniettemin zijn deze studies een goede basis om gelijkaardige onderzoeken uit te voeren bij melkvee teneinde de onderliggende werkingsmechanismen van klinische en subklinische mastitis op de zich ontwikkelende vrucht beter te kunnen begrijpen.
25
REFERENTIELIJST
1. Ahmad, N., Schrick, F. N., Butcher, R. L., & Inskeep, E. K. (1995). Effect of persistent follicles on early embryonic losses in beef cows. Biology of reproduction, 52(5), p. 1129-1135.
2. Akema, T., He, D., & Sugiyama, H. (2005). Lipopolysaccharide Increases γ‐Aminobutyric Acid Synthesis in Medial Preoptic Neurones in Association with Inhibition of Steroid‐Induced Luteinising Hormone Surge in Female Rats. Journal of neuroendocrinology, 17(10), p. 672-678.
3. Albaaj, A., Foucras, G., & Raboisson, D. (2017). High somatic cell counts and changes in milk fat and protein contents around insemination are negatively associated with conception in dairy cows.
Theriogenology, 88, p. 18-27.
4. Ard, M.D. (2013). Fundamental Neuroscience for Basic and clinical applications. 4th edition.
Elsevier Health Sciences, Philadelphia, p. 419
5. Asaf, S., Leitner, G., Furman, O., Lavon, Y., Kalo, D., Wolfenson, D., & Roth, Z. (2014). Effects of Escherichia coli-and Staphylococcus aureus-induced mastitis in lactating cows on oocyte
developmental competence. Reproduction, 147(1), p. 33-43.
6. Ashdown, H., Dumont, Y., Ng, M., Poole, S., Boksa, P., & Luheshi, G. N. (2006). The role of cytokines in mediating effects of prenatal infection on the fetus: implications for schizophrenia.
Molecular psychiatry, 11(1), p. 47-55.
7. Barker, A. R., Schrick, F. N., Lewis, M. J., Dowlen, H. H., & Oliver, S. P. (1998). Influence of clinical mastitis during early lactation on reproductive performance of Jersey cows. Journal of dairy science, 81(5), p. 1285-1290.
8. Berisha, B., Schams, D., Rodler, D., & Pfaffl, M. W. (2015). Angiogenesis in the ovary–the most important regulatory event for follicle and corpus luteum development and function in cow–An overview. Anatomia, histologia, embryologia.
9. Bogdan, C. (2015). Nitric oxide synthase in innate and adaptive immunity: an update. Trends in immunology, 36(3), p. 161-178.
10. Buford, W. I., Ahmad, N., Schrick, F. N., Butcher, R. L., Lewis, P. E., & Inskeep, E. K. (1996).
Embryotoxicity of a regressing corpus luteum in beef cows supplemented with progestogen.
Biology of reproduction, 54(3), p. 531-537.
11. Cai, Z., Pan, Z. L., Pang, Y. I., Evans, O. B., & Rhodes, P. G. (2000). Cytokine induction in fetal rat brains and brain injury in neonatal rats after maternal lipopolysaccharide administration.
Pediatric research, 47(1), p. 64-64.
12. Cotechini, T., Hopman, W. J., & Graham, C. H. (2014b). Inflammation-induced fetal growth restriction in rats is associated with altered placental morphometrics. Placenta, 35(8), p. 575-581.
13. Cotechini, T., Komisarenko, M., Sperou, A., Macdonald-Goodfellow, S., Adams, M. A., & Graham, C. H. (2014a). Inflammation in rat pregnancy inhibits spiral artery remodeling leading to fetal growth restriction and features of preeclampsia. The Journal of Experimental Medicine, 211(1), p.165–179.
14. Darbon, J. M., Oury, F., Laredo, J., & Bayard, F. (1989). Tumor necrosis factor-α inhibits follicle- stimulating hormone-induced differentiation in cultured rat granulosa cells. Biochemical and biophysical research communications, 163(2), p. 1038-1046.
15. Dow, T. L., Rogers-Nieman, G., Holaskova, I., Elsasser, T. H., & Dailey, R. A. (2010). Tumor necrosis factor-α and acute-phase proteins in early pregnant ewes after challenge with peptidoglycan-polysaccharide. Domestic animal endocrinology, 39(2), p. 147-154.
16. Dunlap, K. A., Brown, J. D., Keith, A. B., & Satterfield, M. C. (2015). Factors controlling nutrient availability to the developing fetus in ruminants. Journal of animal science and biotechnology, 6(1), p. 16.
17. Edwards, J. L., & Hansen, P. J. (1996). Elevated temperature increases heat shock protein 70 synthesis in bovine two-cell embryos and compromises function of maturing oocytes. Biology of Reproduction, 55(2), p. 341-346.
18. Edwards, J. L., & Hansen, P. J. (1997). Differential responses of bovine oocytes and
preimplantation embryos to heat shock. Molecular reproduction and development, 46(2), p. 138- 145.
19. Gendron, R. L., Nestel, F. P., Lapp, W. S., & Baines, M. G. (1990). Lipopolysaccharide-induced fetal resorption in mice is associated with the intrauterine production of tumour necrosis factor- alpha. Journal of reproduction and fertility, 90(2), p. 395-402.
