1.1. INVLOED VAN HET CELGETAL EN DE KIEM
Roth et al. (2013) onderzocht het effect van intra-mammaire infectie op de oöcyten in de ovariële pool.
Koeien met zowel een middelmatig als hoog celgetal kenden een lager percentage van embryo’s die zich tot het blastocyst stadium ontwikkelden op dag 7 en 8 na de bevruchting, in vergelijking met koeien met een laag celgetal. Het schadelijke effect van mastitis op het ontwikkelingsvermogen van de oöcyten in het ovarium is niet gelinkt aan het type mastitis. Ook andere studies bevestigen dat het type van bacterie geen invloed heeft op de reproductieparameters (Barker et al. 1998; Santos et al. 2004). Echter de studie van Asaf et al. (2014) toonde aan dat een infectie met gram-negatieve bacteriën schadelijker zou zijn voor de oöcyten dan een infectie met positieve bacteriën. Een infectie met een gram-negatieve kiem brengt dan ook hogere concentraties van de acute fase proteïnen (serum amyloïd A (SAA) en haptoglobine (Hp)) met zich mee, zowel in het serum als in de melk, in vergelijking met een infectie met een gram-positieve kiem (Suojala et al., 2008). Ook de graad van stijging van het celgetal zou het ontwikkelingsvermogen van de eicellen niet beïnvloeden (schade treedt op vanaf een celgetal van 200.000 cellen/ml melk) (Roth et al., 2013). Rahman et al. (2012) stelden echter vast dat ernstig aangetaste koeien een gedaald aantal secundaire follikels hadden, terwijl er geen effect was op het aantal primordiale en primaire follikels.
1.2. EFFECT VAN HET TIJDSTIP VAN OPTREDEN VAN KLINISCHE MASTITIS
Santos et al. (2004) gingen na wat de invloed is op reproductieparameters van klinische mastitis die vroeg in de lactatie optreedt bij Holstein melkkoeien. De koeien werden opgedeeld in drie groepen en werden opgevolgd gedurende een volledige lactatie (320 dagen in melk). Een eerste groep waarbij mastitis optrad voor de eerste kunstmatige inseminatie (KI) postpartum, een tweede groep die mastitis kregen tussen de eerste KI postpartum en de drachtdiagnose en tenslotte een derde groep waarbij klinische uierontsteking werd gediagnosticeerd na drachtdiagnose. Uit de studie kon men het volgende afleiden: (i) de bevruchtingsresultaten van de eerste KI postpartum alsook de drachtresultaten bij 320 dagen in melk (DIM) waren het laagst voor de eerste en tweede groep koeien, (ii) op het einde van de studie was de proportie drachtige koeien in de controle en de derde groep groter dan bij groep 1 en 2, (iii) het aantal inseminaties per conceptie was het hoogst voor de tweede groep, (iv) de incidentie van abortus was gelijkaardig voor de drie groepen koeien, maar het optreden van klinische mastitis op gelijk welk moment in de lactatie zorgt voor een gestegen incidentie van abortus ten opzichte van de controle groep. Er werden gelijkaardige resultaten gezien bij studies op Jersey koeien (Barker et al., 1998;
Schrick et al., 2001).
Het optreden van subklinische mastitis vroeg in de lactatie zou een gelijkaardig schadelijk effect hebben op de reproductieve parameters als klinische mastitis. Als de subklinische mastitis gevolgd wordt door een klinische uierontsteking ziet men het meest negatieve effect op de reproductieparameters (Schrick et al. 2001).
7 1.3. MECHANISMEN WAARDOOR MASTITIS INVLOED UITOEFENT OP REPRODUCTIEPARAMETERS 1.3.1. Wijzigingen in endocrinologie
Klinische mastitis resulteert in een gedaalde oestrus expressie en soms falen van ovulatie. Dit vindt zijn oorsprong in de verminderde schommelingen in luteïniserend hormoon (LH). Hierdoor is de productie van estradiol-17β (E2) gedaald waardoor de oestrus expressie uitblijft (Hockett et al., 2005). In een studie van Lavon et al. (2011) werd ook een associatie gezien tussen subklinische mastitis en een abnormaal lage expressie van de luteïniserend hormoon/choriogonadotropine receptor (LHCGR) en steroïde genen in zowel de theca als granulosa cellagen. LHCGR is een G-proteïnegekoppelde receptor die de acties van het luteïniserend hormoon (LH) en choriogonadotropine medieert. Ovulatie en luteïnisatie van dominante follikels als gevolg van de LH-piek zou afhankelijk zijn van de expressie van LHCGR (Yang et al., 2012). De daling van LHCGR zorgt voor een reductie van folliculair estradiol en androsteendion in de preovulatiore follikel en is daardoor een belangrijke oorzaak van malfunctie van de preovulatoire follikel. Dit effect werd bij een derde van de geïnfecteerde koeien gezien (Lavon et al., 2011). Bij koeien met acute klinische mastitis was de LH piek afwezig waardoor de ovulatie niet plaatsvond. (Hockett et al. 2005) Dit verklaart de gestegen dagen tot eerste KI bij optreden van klinische mastitis voor de eerste KI postpartum (Barker et al., 1998; Schrick et al., 2001).
We kunnen concluderen dat mastitis de ovulatie verstoort, hieronder wordt dieper ingaan op het mechanisme dat hierachter schuilgaat. Toediening van endotoxine, meer bepaald lipopolysaccharide (LPS) (een bestanddeel van de celwand van gram negatieve bacteriën), zorgt enerzijds voor een suppressie van de LH piek en anderzijds voor een stijging van prostaglandine F2α (PGF2α)(Schrick et al.,2001). In een studie van Akema et al. (2005) op vrouwelijke ratten heeft men ontdekt dat LPS de synthese van γ-aminoboterzuur (GABA) stimuleert in de neuronen van de mediale preoptische zone (mPOA), wat op zijn beurt de LH piek voor ovulatie blokkeert. De mPOA is een onderdeel van de hypothalamus en bevat de neuronen die gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) aanmaken. GnRH wordt van daaruit getransporteerd naar de hypofyse waar het de vrijstelling van de gonadotropinen (LH en FSH) bevordert (Ard, 2013). Vermindering van de suppressieve activiteit van GABA ter hoogte van de mPOA laat de inductie van de LH piek toe (Akema et al., 2005). Het uitblijven van de LH piek zorgt voor een vertraagde of afwezige ovulatie, de gestegen PGF2α zorgt voor een daling van progesteron (P4) (Schrick et al., 2001). Hierdoor worden persisterende follikels of folliculaire cysten gevormd en wordt de preovulatoire secretie van estradiol-17β (E2) verlengd. Eicellen van persisterende follikels kunnen bevrucht worden maar ze bereiken veel minder het 16-cellig stadium dan eicellen afkomstig van groeiende follikels. Een hoge E2 concentratie wordt geassocieerd met een abnormale ontwikkeling van het embryo en wijzigingen in de oviduct waardoor uiteindelijk embryonale sterfte optreedt (Ahmad et al., 1995).
1.3.2. Wijzigingen in folliculaire ontwikkeling
Volgens Rahman et al. (2012) is de gedaalde vruchtbaarheid van koeien die chronische mastitis doormaakten ook te wijten aan het schadelijk effect op de folliculogenese. In deze studie werden melkstalen en ovaria verzameld van 68 koeien en vervolgens werden ze opgedeeld in groepen naargelang de graad van infectie op basis van de infecterende kiem en het celgetal. Men zag in het ovarium, op de plaats waar de follikels rijpen, afwijkingen in het vasculair bed. De zones waar de
vascularisatie verminderd was bevatte ook meer fibreus weefsel. Toch was er geen daling in het aantal primordiale en primaire follikels (Rahman et al., 2012). Dit zou kunnen verklaard worden doordat deze follikels zich normaal gezien in de cortex van het ovarium bevinden, een plaats waar zich weinig bloedvaten bevinden. Een lage bloedtoevoer voor de primordiale en primaire follikels zou van belang zijn om de rusttoestand te behouden (Hermann en Spanel-Borowski, 1998). Maar voor de verdere ontwikkeling en rijping van de follikels en de vorming en functie van het corpus luteum is een goede vascularisatie noodzakelijk (Berisha et al., 2015). Daarnaast is er ook sprake van een direct effect op eicel-specifieke factoren door veranderingen in expressie van maternale genen (Rahman et al., 2012;
Asaf et al., 2014). Deze wijzigingen zouden zich bevinden ter hoogte van stress-gerelateerde genen (PTGS2 en HSF1), genen die een rol spelen in de folliculogenese en vroeg embryonale ontwikkeling (GDF-9 en POU5F1) en tenslotte genen die het celmetabolisme regelen (SLC2A1). Een gedaalde expressie van heat shock transcription factor 1 (HSF1) kan leiden tot een lagere hoeveelheden van heat shock protein (HSP) waardoor de eicellen minder goed stress kunnen verdragen. HSF1 is ook van belang bij de meiose van de oöcyt waardoor mastitis ook geassocieerd wordt met een verminderde embryonale ontwikkeling. Aangezien het gen POU5F1 de vernieuwing van embryonale stamcellen regelt kan verondersteld worden dat wijzigingen aan dit gen zorgen voor een gedaald ontwikkelingsvermogen van eicellen (Asaf et al., 2014). GDF-9 is een van de groeifactoren die de vroege folliculaire groei controleren. Het bevordert de groei van de oöcyt, de proliferatie van de granulosa cellen en de differentiatie van de thecacellen (Leitão et al., 2014). Koeien die een erge vorm van mastitis doormaakten kenden door de gedaalde expressie van GDF-9 een minder effectieve ontwikkeling van de follikels (Rahman et al., 2012). Dit effect op GDF-9 zou voornamelijk aanwezig zijn bij subklinische mastitis en in mindere mate bij acute mastitis (Asaf et al., 2014).
1.3.3. Activatie van het immuunstelsel: vrijstelling van cytokines
Wanneer het afweermechanisme op gang komt, komen onder andere cytokines vrij die mee de inflammatoire reactie sturen. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is daar één van (Jackson et al., 2012).
TNF-α verhindert het stimulerend effect dat FSH uitoefent op de granulosa cellen zodanig dat deze cellen niet meer reageren op LH tijdens de maturatie in het ovarium (Darbon et al., 1989). Suppressie van LH tast het rijpingsproces van de eicel aan en verhindert de expansie van de cumulus cellen (Schrick et al., 2001). In de studie van Jackson et al. (2012) heeft men gekeken naar het effect van de blootstelling aan TNF-α op de ontwikkeling van in vitro bevruchte runderembryo’s. Het resultaat van deze studie was dat het aantal oöcyten die ontwikkelen tot blastocyst gedaald was indien de oöcyten blootgesteld waren aan TNF-α. Echter de studie van Soto et al. (2003b) beweert dat als de blootstelling aan TNF-α plaatsvindt wanneer de oöcyt reeds bevrucht werd en een embryo werd gevormd dan zouden deze embryo’s wel tot het blastocyst stadium kunnen ontwikkelen. Het cytokine heeft dan weer wel een schadelijk effect vanaf dat het embryo het 9-cellig stadium heeft bereikt, men ziet dan een gestegen apoptose van de blastomeren (Soto et al., 2003b).
Bacteriën zorgen voor een gestegen secretie van prostaglandine-F2α (PGF2α). Dit is ook een mediator van de inflammatie en kan aanleiding geven tot premature luteolyse (Hockett et al., 2004;
Huszenicza et al., 2004; Santos et al., 2004). Daarnaast heeft PGF2α ook een schadelijk effect op de
9 eicellen. Bij blootstelling tijdens de maturatie was het aantal eicellen dat het blastocyststadium bereikten op dag 8 gedaald. Anderzijds, als de blootstelling aan PGF2α plaatsvindt na de bevruchting ziet men
geen effect op het delingsritme of de proportie eicellen die ontwikkelen tot blastocyst op dag 8 (Soto et al., 2003a). Ook koorts kan een gestegen productie van PGF2α veroorzaken (Santos et al., 2004).
Naast het ontwikkelingsvermogen schaadt mastitis ook de nucleaire en cytoplasmatische maturatie van de oöcyten. Bovendien zouden de wijzigingen in transcriptielevels in de oöcyt overgedragen worden naar het viercellig embryostadium (Asaf et al. 2014). In een studie van Soto et al. (2003a) heeft men gezien dat blootstelling aan hoge concentraties van lipopolysaccharide (LPS) schadelijk is voor de eicellen. Er was een reductie in oöcyten die het blastocyst-stadium op dag 8 na bevruchting bereiken.
Men zag ook een gedaald delingsritme van de eicellen. Naast het schadelijk effect dat LPS rechtstreeks heeft op de oöcyten zorgt het daarnaast ook voor een gestegen synthese van stikstofoxide (NO). LPS is een transcriptionele activator van stiktstofoxide synthase-2 (NOS2) dat macrofagen stimuleert om grote hoeveelheden NO vrij te stellen (Bogdan, 2015). Ook TNF-α en PGF2α kunnen verantwoordelijk zijn voor een stijging van NO (Soto et al., 2003a). Stikstofoxide heeft geen effect op het delingsritme of het percentage van eicellen die het blastocyst-stadium bereiken indien de blootstelling plaatsvindt tijdens de maturatie van de eicellen. Echter wanneer de eicellen in contact komen met hoge concentraties van NO na de bevruchting kunnen de oöcyten zich niet meer ontwikkelen tot blastocyst (Soto et al, 2003a). Hieruit zouden we kunnen concluderen dat vooral de afweerreactie van de gastheer Figuur 2. Mogelijke processen die in gang worden gezet na intramammaire infectie die een effect hebben op de eicel en het embryo. Centraal staat de vrijstelling van cytokines, dit kan zowel rechtstreeks in de uier en drainerende lymfeknopen als in andere weefsels als antwoord op uit de melkklier gestuurde signalen. (Uit Hansen et al., 2004)
op de infectie aanleiding geeft tot een daling in fertiliteit en dat het type van infectie waarschijnlijk ook de omvang van de afweerreactie van de gastheer bepaalt.
1.3.4. Klinische mastitis gaat gepaard met een stijging van de lichaamstemperatuur
Een gestegen temperatuur kan zowel de deling als maturatie van de eicellen verstoren, hierdoor is het aantal embryo’s dat het blastocyst stadium bereiken gedaald. De mate van temperatuurstijging bepaalt de schade die wordt toegebracht. Hoe hoger de temperatuur, hoe groter de schade. Ook het stadium waarin de oocyt zich bevindt gedurende de stijging speelt een rol. De eicel is vooral tijdens de eerste 12 uur van de rijping gevoelig voor hitte. Dit zou te wijten zijn aan wijzigingen in de eiwitsynthese en het onvermogen om heat shock proteïnen te induceren (Edwards en Hansen,1996) want deze eiwitten bieden bescherming tegen te hoge temperaturen (Asaf et al., 2014).