Celdetectie, labeling en tracking van cellen

IJzeroxide partikels kunnen aangewend worden om specifieke cellen te labelen om vervolgens de migratie van deze cellen in vivo te kunnen volgen (16, 19, 28, 30, 38, 86). Dit is mogelijk dankzij de goede oplosbaarheid van de deeltjes, hun afmetingen, reactieve oppervlakken, goede biodegradatie en de mogelijkheid om deeltjes van uniforme grootte te synthetiseren in grote hoeveelheden. Ook de verdere modificatie van de coatings met speciale liganden draagt hiertoe bij. Zo kunnen niet enkel antilichamen, polysachariden en nucleotiden aan de partikels gehecht worden, maar ook fluorochromen, radio-isotopen en therapeutische agentia (13, 19, 87).

Bij het labelen van cellen kunnen twee belangrijke technieken onderscheiden worden. De eerste techniek houdt in dat de biocompatibele ijzeroxide partikels opgenomen worden door de cellen via pinocytose, receptor-gemedieerde endocytose of fagocytose (13, 15, 16, 19, 30, 36, 64, 88-92). Dit kan onder andere door de magneetdeeltjes te voorzien van liganden die op een efficiënte wijze opgenomen worden via receptor-gemedieerde endocytose, monoklonale antilichamen bijvoorbeeld (13, 90). Als cellen echter te veel ijzeroxide deeltjes opnemen, bestaat het risico

31

dat ze in apoptose zullen gaan door het teveel aan ijzer in de cellen (13, 39, 64, 93). Om dit te vermijden, kan gebruik gemaakt worden van de tweede techniek waarbij de magneetdeeltjes aan de buitenzijde van de cellen zitten (13). Hierbij worden partikels gebruikt waaraan liganden gekoppeld zijn voor receptoren die frequent voorkomen op de celmembraan van dierlijke cellen. Voorbeelden van dergelijke receptoren zijn de receptoren voor transferrine, lactoferrine, ceruloplasmine, albumine, insuline en circulerende groeifactoren (13, 61, 94). Deze receptoren binden hun liganden zo sterk dat de fagocytose geïnhibeerd wordt. Via deze techniek zijn de cellen dus zichtbaar en bovendien ook beschermd tegen de potentiële nadelige gevolgen van endocytose (13, 93).

Labelen van cellen kan, ongeacht de gebruikte techniek, ex vivo of in vivo gebeuren. Bij ex vivo labelen worden de gewenste cellen in cultuur gebracht in aanwezigheid van ijzeroxide partikels.

Zodra de cellen voldoende deeltjes opgenomen hebben of aan hun oppervlak gebonden hebben, worden ze geïnjecteerd of geïmplanteerd in het levend organisme (16, 19, 20, 53). Bij ex vivo typeren van cellen is er een grotere kans op succesvolle opname van de magneetdeeltjes door de cellen aangezien er geen competitie is van andere celtypes, wat wel zo is bij in vivo labelen.

Bij het in vivo labelen wordt in het organisme contraststof geïnjecteerd in plaats van geladen cellen. Dit is minder tijdrovend dan het op voorhand laden van cellen met partikels. Op deze manier wordt er bovendien minder vreemd materiaal in het lichaam gebracht aangezien het de gastheer-eigen cellen zijn die de partikels zullen opnemen (20, 30).

Figuur 14 Als aan ijzeroxide partikels liganden zoals lactoferrine of ceruloplasmine gekoppeld worden, zullen deze liganden een binding aangaan met hun respectievelijke receptoren op de celmembraan. De binding zal echter geen aanleiding geven tot internalisatie van het partikel in de cel. (Gupta A.K. 2005) (13)

32

Cellen die frequent van labels voorzien worden om hun distributie, overleving en migratie in het lichaam in vivo te visualiseren, zijn macrofagen, stamcellen, lymfocyten en progenitorcellen of voorlopercellen (15-17, 19, 20, 22, 28, 86).

Voor het opsporen van macrofagen en monocyten kan gebruik gemaakt worden van ijzeroxide partikels zonder coating aangezien deze gemakkelijk via endocytose opgenomen worden door de macrofagen en monocyten (4, 9, 13, 15, 22, 28, 40, 48, 51-53). Hierbij worden de grotere deeltjes sneller opgenomen dan de kleine (4, 16, 22, 28). De macrofagen en monocyten blijven levensvatbaar na opname van ijzeroxide partikels, waardoor ze in vivo gevolgd kunnen worden (4, 92). Het in beeld brengen van macrofagen is vooral interessant om inflammatoire processen op te sporen. Macrofagen migreren immers naar inflammatoire zones waar ze helpen met antigenpresentatie en het opruimen van afgestorven cellen (16, 19, 20, 28, 95, 96). Nu bestaan er drie mogelijke verklaringen over hoe de ijzeroxide deeltjes bijdragen tot het visualiseren van inflammatoire processen via MRI. Een eerste verklaring is de hierboven vermelde opname van magneetdeeltjes door de macrofagen die vervolgens naar de ontstekingsgebieden migreren. Een tweede theorie stelt dat de contrastdeeltjes door de verhoogde vasculaire permeabiliteit uit de bloedbaan kunnen treden op plaatsen van infectie en dan opgenomen worden door macrofagen ter plaatse. Het is ook mogelijk dat de ijzeroxide partikels na het verlaten van de bloedbaan niet geëndocyteerd worden, maar gewoon ter plaatse blijven en zo beeldcontrast induceren (16, 20).

Het eerst besproken mechanisme blijkt het dominante te zijn (20).

Het gebruik van gelabelde macrofagen laat toe om diverse inflammatoire processen in beeld te brengen zoals atherosclerose, orgaanrejectie, inflammatoir darmlijden en neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer (4, 14-16, 19, 28). Bij inflammatie circuleren er immers meer macrofagen in de buurt van het letsel en zullen er bijgevolg meer contrastpartikels opgenomen worden. Bij orgaanrejectie infiltreren er bijvoorbeeld meer gelabelde macrofagen

Figuur 15 (a) SPIOs kunnen via fenestraties de bloedbaan verlaten en zo in het interstitium terecht komen waar ze worden opgenomen door macrofagen. Deze gaan vervolgens via de lymfebanen naar de lymfeknopen. (b) Op de figuur is te zien dat SPIOs als vrije partikels terecht kunnen komen op plaatsen van inflammatie, maar ook na opname in macrofagen. (Elias A. 2009) (16)

33

in het transplantorgaan, wat door het negatief contrasteffect van de ijzeroxide partikels op MRI zichtbaar wordt (4, 16, 19, 53, 92, 97). Dit is in diermodellen reeds aangetoond voor de rejectie van een harttransplant (97) en voor getransplanteerde nieren (19).

Ook labelen van andere immuun-competente cellen en stamcellen laat toe om rejectie in beeld te brengen of celtherapie op te volgen (16, 19). Stamcellen zijn cellen die in staat zijn tot zelf-vernieuwing en die kunnen differentiëren tot gespecialiseerde cellen. Bovendien helpen ze om op de plaats van een letsel cellen te rekruteren die zullen instaan voor het herstel van dat letsel (26, 30, 35). Deze stamcellen worden gebruikt voor celtherapie bij ischemische, genetische, auto-immune en degeneratieve aandoeningen, maar ook voor regeneratie van hartspierweefsel, kraakbeen en bot. Om het succes van de behandeling op te volgen en te kijken of de stamcellen hun doel bereiken, is het echter belangrijk dat de biologische functies van de stamcellen niet aangetast worden door het labelen van de cellen (16, 20, 30, 35). Het merken met ijzeroxide partikels zou immers de levensvatbaarheid, de chromosomale stabiliteit en het vermogen tot differentiatie van de stamcellen kunnen aantasten; risico’s die ook bestaan bij het labelen van andere celtypes (5, 19). Hoewel hoge concentraties van partikels met dextraan coating kunnen leiden tot hemolyse, plaatjesaggregatie en toegenomen activiteit van het immuunsysteem, blijft het tot op vandaag de frequentst gebruikte coating voor ijzeroxide partikels aangezien deze negatieve effecten niet optreden bij de lage concentraties die gebruikt worden (20, 98). Ook partikels met een coating van citraat, aminosilanen of niet-gefractioneerd heparine worden gebruikt voor het merken van stamcellen (20).

Naast het passief volgen van het traject van stamcellen, is het ook mogelijk om hun verloop in het lichaam te sturen door magneten aan te brengen boven de doelwitlocatie. Voorbeelden van dergelijke doelwitlocaties zijn kraakbeenletsels, leverletsels en locaties in het zenuwstelsel die demyelinisatie vertonen. Op deze manier wordt getracht om meer stamcellen op de gewenst plaats terecht te laten komen. Dit proces, dat gebaseerd is op magnetoforese, werd reeds met succes getest op muizen (7, 13, 20, 27, 38, 64, 99).

Om na te gaan of de celtherapie al dan niet succesvol is, is het echter ook noodzakelijk om op gezette tijden te controleren of de cellen die gevolgd worden nog steeds de stamcellen zijn. Net als andere cellen kunnen stamcellen immers afsterven waarbij de opgenomen ijzeroxide deeltjes opnieuw vrijgesteld worden. Als de partikels vervolgens opgenomen worden door macrofagen, bestaat de mogelijkheid dat niet het traject van de stamcellen, maar dat van de macrofagen in vivo opgevolgd wordt. Dit kan vermeden worden door herhaaldelijk via histologisch onderzoek te bevestigen dat de gemerkte cellen inderdaad stamcellen zijn (20, 85, 100).

34

Hoewel vele celtypes ijzeroxide partikels kunnen opnemen, al dan niet gefaciliteerd door een modificatie van de partikels, is het soms toch wenselijk om op moleculair niveau onderzoek te doen in plaats van op cellulair niveau. Dit kan door ijzeroxide partikels te maken die gericht zijn tegen moleculen die een verschillend expressiepatroon hebben bij inflammatie of tumorale processen in vergelijking met de situatie in rust (4, 19, 36). Hiervoor kan gebruik gemaakt worden van partikels waaraan antilichamen tegen de desgewenste moleculen gekoppeld zijn.

Dankzij deze antilichamen verhoogt niet alleen de specificiteit, maar ook de bindingsaffiniteit van de deeltjes voor hun doelwitmolecule (4, 38). Aan de partikels kunnen niet alleen volledige antilichamen geconjugeerd worden, maar ook monovalente fragmenten, single chain antilichamen en andere afgeleide structuren (4, 19, 101). Hoewel er al vele antilichamen voor verschillende moleculaire doelwitten beschikbaar zijn, zijn er ook nadelen verbonden aan deze techniek. Zo zijn de kosten voor het ontwikkelen en produceren van antilichamen niet gering en is er een risico op het ontwikkelen van acute en chronische immuunreacties op antilichamen (4, 102).

Een alternatief bestaat uit het gebruik van natuurlijke liganden van deze doelwitmoleculen of van recombinante liganden. Een voorbeeld van een dergelijk ligand is het RGD-motief. Dit is een tripeptide bestaande uit de aminozuren arginine, glycine en asparaginezuur dat via binding aan integrines contact met het vasculair endotheel mogelijk maakt. Aangezien deze integrines meer tot uiting komen bij angiogenese en tumorigenese, kunnen partikels met deze liganden gebruikt worden om op niet-invasieve wijze kankers zoals longkanker op te sporen via MRI.

Bovendien worden dergelijke eiwitten sneller verwijderd van hun target dan de antilichamen, zodat seriële beeldvorming makkelijker is (4, 20, 36, 61, 64, 85, 103, 104).

Naast het RGD-motief dat zich richt op de integrines van het vasculair endotheel, zijn er echter nog vele andere targeting moleculen om tumorale en inflammatoire processen in het lichaam in beeld te brengen via MRI. Zo kan er gebruik gemaakt worden van oppervlaktemoleculen die sterk tot expressie komen op de cellen en bloedvaten van tumoren. Voorbeelden van dergelijke moleculen zijn VEGF, EGFR, CEA en HER2/neu (19, 20, 91). HER2/neu is bijvoorbeeld een oppervlaktemolecule die bij bepaalde borstkankers tot over-expressie komt. Voor het aantonen van HER2/neu kan gebruik gemaakt worden van SPIOs met een coat van herceptine en dextraan (3, 16, 20, 72, 91, 104). Ook voor prostaatkanker bestaan er specifieke magneetdeeltjes gericht tegen het prostaat specifiek antigen (PSA) dat aanwezig is op de maligne prostaatcellen (13, 20, 105).

35

Bij inflammatie zijn er eveneens moleculaire merkers die meer tot expressie komen dan in rust.

Zo zijn VCAM-1, MAdCAM-1, ICAM-1, selectine E, selectine I en selectine P moleculen die voorkomen op het endotheel en die instaan voor het recruteren van leukocyten. VCAM-1 komt bijvoorbeeld sterk tot expressie bij auto-immune encefalitis, maar ook bij atherosclerose. Het is een molecule die verantwoordelijk is voor de adhesie van leukocyten aan de vaatwand en die predisponeert voor het ontwikkelen van atherosclerose. Bij inflammatie neemt de expressie van deze merker toe onder invloed van inflammatoire moleculen zoals IL-1 en TNF-α (4, 36, 38, 56, 75, 106-108). Naast VCAM-1 kan men zich voor het opsporen van aderverkalking ook richten op selectines, CD81 of geoxideerd LDL om de inflammatoire plaques vroeger op het spoor te komen (14, 19, 20, 107). Een vroege detectie van onstabiele plaques is belangrijk aangezien deze aanleiding kunnen geven tot thrombusvorming of een hartinfarct. Deze processen kunnen eveneens via moleculaire MRI in beeld gebracht worden. Bij een thrombose kunnen bijvoorbeeld partikels gebruikt worden die gericht zijn tegen de IIb/IIIa receptor van geactiveerde thrombocyten of tegen de geactiveerde coagulatiefactor XIII (19, 20, 109). Bij een hartinfarct kunnen deeltjes gericht worden tegen myosine (19).

Met ‘gewijzigd expressiepatroon’ wordt echter niet steeds toegenomen expressie van specifieke oppervlaktemoleculen of cellen bedoeld. Ook afwezigheid van bepaalde merkers of celtypes is mogelijk. Zo werd eerder al aangehaald dat levermetastasen of primaire levertumoren vaak niet beschikken over Kupffercellen. Bij toediening van ijzeroxide partikels zal hun signaalintensiteit op moleculaire MRI dus hyperintens zijn in vergelijking met het omliggend weefselparenchym (zie figuur 11) (3, 14, 19, 28). Op een analoge manier kunnen ook letsels in de milt en pancreas

Figuur 16 Schematische weergave van een ijzeroxide partikel met zijn modificaties. De ijzeroxide kernen zijn hydrofoob en worden omgeven door amfifiele polymeren zodat de hydrofiele delen van de polymeren de partikels meer wateroplosbaar maken. De hydrofiele mantel kan nog gemodificeerd worden met targeting moleculen zoals antilichamen om labelen en tracking van cellen mogelijk te maken. Sommige partikels kunnen ook therapeutische agentia bevatten. (Felton C. 2014) (38)

36

opgespoord worden (16, 19). SPIOs kunnen ook gebruikt worden om metastasen in de lymfeknopen op te sporen. Zo zijn USPIOs klein genoeg om door de fenestraties van capillairen te dringen, waardoor ze in het interstitium terecht komen. Hier kunnen ze vrij of na opname in macrofagen via de lymfebanen getransporteerd worden naar de lymfeknopen (zie figuur 15 en 17). Indien er echter een metastase aanwezig is in de lymfeknoop, kunnen er minder ijzeroxide partikels in opstapelen en zal er een hyperintens signaal zijn op MRI in vergelijking met gewone beelden (16, 36, 110). Met behulp van USPIOs is de sensitiviteit van MRI voor het opsporen van metastasen in lymfeknopen verhoogd van 45,5% naar 100% bij een specificiteit van 95,7%

(16, 110).