University of Groningen
Novel preclinical models, therapies and biomarkers for testicular cancer
Rosas Plaza, Fernanda
DOI:
10.33612/diss.119056452
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Rosas Plaza, F. (2020). Novel preclinical models, therapies and biomarkers for testicular cancer. Rijksuniversiteit Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.119056452
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Chapter 7
130 Chapter 7
Testis (zaadbal) kanker is het klassieke voorbeeld van chemotherapiegevoelige solide kankersoorten. Ondanks het feit dat testiskanker een zeer heterogene ziekte is, reageren testiskanker patiënten met uitgezaaide ziekte over het algemeen goed op cisplatine-gebaseerde chemotherapie, ongeacht het tumorsubtype en de histologie. De overgrote meerderheid van patiënten met gemetastaseerde (uitgezaaide) testis kanker kan worden genezen met cisplatine-gebaseerde chemotherapie. Er is echter een groep testiskanker patiënten die ongevoelig zijn voor chemotherapie en uiteindelijk zullen overlijden aan deze ziekte. Helaas zijn klinische onderzoeken moeilijk uit te voeren vanwege de zeldzaamheid van testiskanker en de over het algemeen hoge overlevingskansen van testiskanker patiënten. Daarom worden nauwelijks nieuwe therapeutische opties onderzocht voor patiënten die niet op standaardchemotherapie reageren.
Door de introductie van vinblastine/etoposide combinatietherapie in 1975 verbeterde het genezingspercentage voor gemetastaseerde patiënten van 10% naar 33%. De echte doorbraak deed zich voor met de introductie van cisplatine wat kort daarna werd geëvalueerd in fase 1- en 2-onderzoeken. De fase 2 studie die de combinatie van cisplatine met vinblastine en bleomycine evalueerde, resulteerde in 74% volledige remissies en een 5-jaars overleving van 64%. Sinds de eerste studie van Einhorn en collega's wordt cisplatine beschouwd als de hoeksteen van de standaard combinatiebehandeling van testiskanker. De toevoeging van etoposide en verfijning van de doseringsschema's leidde tot de buitengewone respons van gemetastaseerde testiskanker op chemotherapie. Een fase 3 onderzoek vergeleek later de werkzaamheid van het BEP regime (bleomycine, etoposide, cisplatine) versus PVB chemotherapie (cisplatine, vinblastine en bleomycine) met een superieure werkzaamheid en minder toxiciteit van het BEP regime. De combinatie van cisplatine, etoposide en bleomycine geneest ongeveer 80% van de testiskanker patiënten met gemetastaseerde ziekte, wat impliceert dat 20% van de testiskanker patiënten met gemetastaseerde ziekte voor een tweede maal moeten worden behandeld. Aanwezigheid van een recidief (teruggekeerde ziekte) na eerstelijnschemotherapie resulteert in een 2-jaars overleving van 60% met tweedelijns behandelingen. Bij refractaire ziekte, gedefinieerd als het niet normaliseren van tumormarkers tijdens chemotherapiebehandeling of progressieve ziekte binnen 4 weken na voltooiing van chemotherapie, is het overlevingspercentage na 2 jaar nog lager (33%).
Het is van cruciaal belang om niet alleen nieuwe therapieën te vinden voor patiënten die niet op chemotherapie reageren, maar ook om die groep van patiënten te identificeren die een grotere kans heeft op een recidief of refractaire ziekte vóór of tijdens het begin van de eerstelijnsbehandeling. Nauwkeurige voorspelling van een negatieve uitkomst zou bij voorkeur moeten gebeuren voorafgaand aan de behandeling of vroeg in de loop van de behandeling om zo de mogelijkheid te hebben het chemotherapie regime te intensiveren of te
veranderen. De ‘International Germ Cell Cancer Consensus’ definieerde een classificatie die patiënten in goede, intermediaire en slechte prognosegroepen onderverdeelt op basis van verschillende klinische kenmerken. Belangrijk gegeven hierbij is dat de slechte prognosegroep een 5-jaarsoverleving heeft van 48%. Verschillende biomarkers worden momenteel onderzocht om de identificatie van patiënten met een groot risico op slechte behandelingsresultaten verder te verbeteren.
Er is weinig bekend over de oorzaak van cisplatine resistentie bij testiskanker. Toch zijn er in resistente tumoren van testiskanker patiënten mutaties gevonden in genen die een rol spelen in de MDM2-p53 signaleringsroute of groeistimulerende signaleringsroutes. TP53, MDM2, KRAS, AKT1, MTOR en PIK3CA zijn voorbeelden van dergelijke gemuteerde genen. Bovendien werd in orthotopische (zelfde plek als waar de tumor in de patiënt groeide) testiskanker modellen gevonden dat hyperactivatie van de PI3K-AKT-mTORC signaleringsroute was geassocieerd met een agressiever fenotype. Dit inzicht heeft een aantal combinatie mogelijkheden met cisplatine opgeleverd, die in testiskanker modellen effectief bleken te zijn. De huidige preklinische kennis van cisplatine-sensitizerende middelen is echter niet vertaald naar de kliniek. Verschillende gerichte medicijnen die de PI3K-AKT-mTORC signaleringsroute remmen, zijn wel in fase II-onderzoeken als monotherapie getest zonder veel resultaat. Echter, geen van deze middelen werd in de kliniek gecombineerd met cisplatine.
In dit proefschrift willen we inzicht krijgen in de op cisplatine gebaseerde chemotherapie-respons bij testiskanker. We gebruikten een cohort van patiënten met gemetastaseerde testiskanker om het gedrag van de potentiele biomarkers miR-371a-3p, miR-372-3p en miR-367-3p in reactie op chemotherapie te onderzoeken. Daarnaast hebben we onderzocht hoe humane testiskanker cellijnen en op humane testiskanker-gebaseerde diermodellen gevoelig kunnen worden gemaakt voor cisplatine. Het doel van beide projecten was om de detectie van patiënten die niet volledig reageren op eerstelijnsbehandeling te verbeteren en potentiële nieuwe behandelingen te ontdekken en te valideren in relevante preklinische modellen. Daartoe hebben we testiskanker patiëntafgeleide xenotransplantaten (PDX) ontwikkeld en gekarakteriseerd. Deze modellen zijn vervolgens gebruikt om een combinatietherapie met cisplatine te testen die in het onderzoek met cellijnen was gevonden.
In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van klinische en biologische kenmerken van testiskanker. We hebben algemene aspecten van testiskanker op het gebied van diagnostiek en therapeutische behandelingen besproken. Daarnaast hebben we inzicht gegeven in de mutaties in genen die gevonden worden in testiskanker. In dit hoofdstuk hebben we ook de huidige kennis
132 Chapter 7
over cisplatine gevoeligheid en resistentie in testiskanker bediscussieerd en de resultaten van klinische onderzoeken, waarbij gerichte geneesmiddelen werden gebruikt om chemotherapie-resistente testiskanker patiënten te behandelen, besproken.
In hoofdstuk 2 hebben we drie microRNA's (miRs) onderzocht: 371a-3p, miR-373-3p en miR-367-3p als mogelijke tumorbiomarkers tijdens en na behandeling met cisplatine-combinatiechemotherapie bij patiënten met gemetastaseerd testiskanker. LDH (lactaatdehydrogenase), AFP (alfa-fetoproteïne) en ß-HCG (humaan choriongonadotrofine) zijn biomarkers in het bloed, die klinisch gebruikt worden voor de diagnose en follow-up van patiënten met testiskanker. Ons doel was te onderzoeken of er een relatie is tussen de hoeveelheden van miR-371a-3p, miR-373-3p en miR-367-3p in sera en de klinische kenmerken van deze gemetastaseerde testiskanker patiënten. Een prospectief cohort en een retrospectief geselecteerde cohort werden onderzocht met in totaal 109 patiënten. Bloedmonsters werden genomen bij het begin van chemotherapie en tijdens de follow-up. Serum miR hoeveelheden werden bepaald met behulp van de ampTStest. Bij aanvang van chemotherapie waren de hoeveelheden miR-371a-3p, miR-373-3p en miR-367-3p positief gecorreleerd met LDH in sera. Het mediane niveau van deze miR’s was hoger bij patiënten met een recidief (n = 34) dan bij patiënten met volledige en duurzame remissie (n = 60). In sera afgenomen voor start van de behandeling werd een verhoogde hoeveelheid miR-367-3p gevonden bij patiënten met refractaire ziekte (n = 15) in vergelijking met degenen die een volledige en duurzame remissie hadden. Een ander opvallend aspect was dat bij patiënten met volledige en duurzame remissie de miR-waarden daalden na de eerste week van chemotherapie en onder de drempelwaarden, gebaseerd op miR-waarden bij controle personen, bleven een jaar na start van de behandeling. Samenvattend kan geconcludeerd worden dat hoge waarden van miR-371a-3p, miR-373-3p en miR-367-3p - bij aanvang van chemotherapie geassocieerd zijn met slechtere klinische resultaten bij testiskanker patiënten. Daarnaast kan het meten van miR-waarden tijdens de behandeling helpen bij een vroege diagnose van refractaire testiskanker patiënten of patiënten met een recidief.
In hoofdstuk 3 hebben we verschillende remmers van tyrosine kinasen (eiwitten) onderzocht op hun vermogen testiskankercellen te sensitizeren voor cisplatine. De mate van activatie van tyrosine kinasen, zoals membraanreceptor tyrosine kinasen en intracellulaire tyrosine kinasen, werden bestudeerd in vijf cisplatine-gevoelige of resistente testiskanker cellijnen met behulp van fosfo-kinase-arrays en western-blotting. De fosfo-kinase array toonde aan dat AKT en S6, die beide deel uitmaken van de PI3K/AKT/mTORC route, tot de meest gefosforyleerde eiwitten (dus meest geactiveerd) in testiskanker cellijnen behoren. Remmers van de meest actieve tyrosine kinasen in de PI3K/AKT/mTORC route werden getest
met behulp van apoptose-testen en overlevingstesten. Twee mTORC1/2 remmers, AZD8055 en MLN0128, verhoogden de door cisplatine geïnduceerde apoptose in alle geteste testiskanker cellijnen. Remming van mTORC1/2 blokkeerde de fosforylering van de eiwitten S6 en 4E-BP1, die door mTORC worden geactiveerd. Gecombineerde behandeling met AZD8055 en cisplatine leidde tot verminderde clonogene overleving van testiskanker cellen. Twee testiskanker patiënt-afgeleide xenotransplantaten (PDX-en), één van een chemogevoelige en één van een chemoresistente patiënt, werden behandeld met cisplatine in af- of aanwezigheid van mTORC1/2 remmer. Gecombineerde behandeling met AZD8055 en cisplatine resulteerde in effectieve mTORC1/2 remming, verhoogde caspase-3-activiteit en verhoogde remming van tumorgroei van beide PDX-en. Concluderend hebben we mTORC1/2-remming geïdentificeerd als een effectieve strategie om testiskanker cellijnen en PDX modellen te sensitizeren voor behandeling met cisplatine. Onze resultaten rechtvaardigen verder onderzoek naar deze combinatietherapie bij de behandeling van testiskanker patiënten.
In hoofdstuk 4 hebben we het maken en karakterisering van testiskanker PDX modellen beschreven. Preklinische modellen die een getrouw beeld geven van de patiënttumor zijn nodig bij het vinden van nieuwe doelen van therapie en voor geavanceerde geneesmiddelenontwikkeling. PDX modellen van testiskanker werden gemaakt door subcutane implantatie van solide tumorstukjes in immunodeficiëntie NOD scid-gamma (NSG) muizen. Van de 8 testistumoren die werden geïmplanteerd, konden uiteindelijk 3 PDX modellen worden gemaakt. PDX modellen en gematchte patiëntentumoren werden gekarakteriseerd met behulp van immunohistochemie. Daaruit bleek dat de histologische subtypen aanwezig bleven over de verschillende passages. Kopie nummer variatie analyse en RNA-sequencing werd tevens uitgevoerd op de verschillende passages van de PDX tumoren en toonden een hoge concordantie tussen passages aan. Cisplatine-sensitiviteit van PDX modellen kwam overeen met de respons van patiënten op chemotherapie. Concluderend hebben we 3 testiskanker PDX modellen opgezet en gekarakteriseerd. Deze modellen weerspiegelden getrouw chemosensitiviteit en kunnen nu worden gebruikt voor mechanistische studies, therapeutische ontwikkeling en pre-klinische validatie van nieuwe therapeutische strategieën bij testiskanker. LDH, AFP en ß-HCG serum spiegels worden gebruikt bij de diagnose en follow-up van testiskanker patiënten. Echter niet alle tumoren van testiskanker patiënten scheiden deze eiwitten uit in het bloed. Bovendien kunnen verhoogde LDH- en AFP-serumwaarden ook gevonden worden bij andere aandoeningen. In hoofdstuk 5, wilden we PDX modellen valideren als modellen om testiskanker biomarkers te bestuderen. We hebben alle 3 PDX-modellen gebruikt, wat gebaseerd was op de positieve AFP- en ß-HCG-bepalingen bij de gematchte patiënten. Twee modellen waren afgeleid van cisplatine-gevoelige testiskanker patiënten (TC1 en TC5) en één van een cisplatine-resistente patiënt
134 Chapter 7
(TC4). AFP- en ß-HCG-serumwaarden werden gemeten met behulp van ELISA. TC1, TC4 en TC5 produceerden allemaal AFP. Het PDX-model afgeleid van een patiënt, die zich met hoge ß-HCG-serumwaarden presenteerde, scheidde geen detecteerbare ß-HCG uit in sera van muizen. Om het effect van de behandeling op de AFP-waarden in PDX muizen te bestuderen, hebben we serummonsters geanalyseerd aan het begin en einde van een behandelingscyclus met of zonder cisplatine in twee modellen (TC1 en TC4). Opvallend was het omgekeerde verband tussen AFP-serumwaarden en tumorvolume in beide PDX modellen. Onze resultaten suggereren dat AFP en ß-HCG niet betrouwbaar kunnen worden gebruikt als surrogaat markers van tumorvolume in testiskanker PDX modellen. Samenvattend, dit proefschrift biedt nieuwe inzichten in de waarde van nieuwe biomarkers, met name miRNA’s, om testiskanker patiënten te identificeren met een hoog risico op een ongunstige uitkomst. Bovendien werden nieuwe in vivo testiskanker modellen diepgaand gekarakteriseerd en gebruikt om een op cisplatine gebaseerde combinatiebehandeling te testen, zoals mTORC1/2 remmers. Op basis van deze resultaten zou het toevoegen van mTORC1/2 remmers aan BEP-chemotherapie bij patiënten met een recidief of refractaire ziekte de klinische uitkomst van testiskanker kunnen verbeteren. Vroege detectie van dergelijke patiënten door miRNA's in het bloed als biomarker te gebruiken, kan oncologen dan helpen bij het nemen van extra maatregelen om de ontwikkeling van testiskanker naar een agressievere vorm te voorkomen.
