Cover Page
The handle http://hdl.handle.net/1887/43807 holds various files of this Leiden University dissertation
Author: Hoyng, Stefan
Title: Gene therapy and nerve repair Issue Date: 2016-11-01
Nederlandse samenvatting Curriculum Vitae
Publications
Acknowledgements
150 NEDERLANDSE SAMENVATTING
NEDERLANDSE SAMENVATTING GENTHERAPIE EN ZENUWCHIRURGIE
Introductie: De beperkingen van het chirurgisch herstel van zenuwletsel Het “fly-by-wire”, een begrip uit de moderne luchtvaart, maakt het mogelijk om stuur- commando’s vanuit de cockpit door te geven via elektrische bekabeling naar verschil- lende actuatoren verspreid over het vliegtuig. Vergelijkbaar bestaat er in het menselijk lichaam een uitgebreid netwerk van verbindingen genaamd het perifere zenuwstelsel die elektrische signalen vanuit de hersenen naar onze perifere organen en spieren sturen.
Wanneer bijvoorbeeld een violist het spelen in zijn hersenen in gang wil brengen dan wordt dit door middel van het perifere zenuwstelsel overgedragen naar de spieren in zijn vingers. Er is bovendien ook sprake van een continue sensorische terugkoppeling vanuit de vingers naar zijn hersenen die essentieel is om het spelen mogelijk te maken (positie in de ruimte, kracht op de snaren). Het perifere zenuwstelsel zorgt dus voor communicatie via zenuwbanen die verspreid lopen door al onze ledematen. Hoewel deze banen evolu- tionair beschermd zijn (ligging en isolatie) kunnen zij ten gevolge van een trauma aan een ledemaat beschadigd worden. Een onderbreking van een zenuw leidt tot een onder- breking van de communicatie en dus tot verlamming van het distale ledemaat.
In de vorige eeuw heeft de ontwikkeling van de operatiemicroscoop en de microchirur- gie ertoe geleid dat onderbroken zenuwen chirurgisch weer verbonden konden worden.
In Nederland ondergaan momenteel per jaar ongeveer 600 patiënten reconstructieve zenuwchirurgie. Na een scherpe verwonding kunnen de twee stompen van een door- gesneden zenuw door microchirurgie direct weer verbonden worden door middel van hechtingen of fibrine-lijm. Na een ernstig rekletsel, bijvoorbeeld na een stomp trauma, is een spanningsvrije verbinding van de zenuwuiteinden echter vaak niet mogelijk. Om deze afstand te overbruggen is het inbrengen van een zenuwtransplantaat vereist. Deze transplantaten worden bij de patiënten zelf geoogst (autoloog) op een locatie waar func- tieverlies minimaal is om gedurende dezelfde operatie tussen de twee zenuwstompen getransplanteerd te worden.
Helaas treedt er na chirurgisch herstel van de verbinding, in tegenstelling tot het weer verbinden van een gebroken elektrische draad, geen direct herstel van de communicatie op. Voordat dit hersteld is, is het noodzakelijk dat de “koperdraad” ook wel het axon genoemd weer teruggroeid vanuit de proximale stomp naar de distale stomp en zijn weg hierna voortzet richting zijn perifere doel: spier of orgaan. Dit traject kan in een vol- wassen mens gemakkelijk een meter lang zijn (bijvoorbeeld tussen de schouder en de
spieren in de onderarm). De groei van het axon wordt geïnitieerd en in stand gehouden door steuncellen (Schwann-cellen) die de axonen omringen. Na een zenuwbeschadiging, veranderen Schwann cellen in de distale zenuw en beginnen zij eiwitten te produceren (neurotrofines) die hergroei van axonen actief ondersteunt. Het eerste en meest belang- rijke probleem is echter dat de capaciteit van Schwann cellen om dit te ondersteunen van gelimiteerde duur is. Gezien de lange afstand en de trage groei van een regenerend axon (1-3 mm per dag) verliezen axonen te snel de noodzakelijke steun en halen daardoor hun eindoorgaan niet. Dit verklaart waarom het klinische beeld, na chirurgisch herstel van een proximaal letsel, vaak een resterende verlamming van de meest ver gelegen ledema- ten laat zien.
Een tweede probleem is de verkeerde uitgroei van axonen; genaamd misdirectie of mis- routing. In een intacte zenuw bezetten motorische en sensorische axonen afzonderlijke buizen genaamd endoneurale buizen. Deze buizen liggen naast elkaar en helpen bij de elektrische isolatie en creëren een pad voor axonen om terug te groeien bij een lichte beschadiging. Wanneer er een ernstige zenuwbeschadiging optreedt, waarbij de con- tinuïteit van de zenuw chirurgisch hersteld moet worden, zullen de endoneurale bui- zen nooit verbonden kunnen worden op exact dezelfde wijze als voor de beschadiging.
Dit zorgt ervoor dat talloze motoraxonen sensorische buizen ingroeien en hierdoor naar de huid groeien en vice versa.
De doelstelling van het onderzoek
Het algemene doel van het hier gepresenteerde werk is om de regeneratie van perifere zenuwen verder te verbeteren door de groei van axonen te stimuleren en misdirectie te verminderen. Om dit te bereiken hebben wij gebruik gemaakt van gentherapie.
Gentherapie is het therapeutisch inbrengen van gekozen genetisch materiaal (DNA) bij doelwitcellen om een ziekte te behandelen. Het gekozen DNA wordt aangeduid als een transgen en dit codeert voor een promoter en een potentieel therapeutisch gen. Er zijn verschillende manieren om een transgen in cellen te introduceren, maar virale vectoren worden beschouwd als de meest efficiënte strategie. Virale vectoren maken de aflevering en expressie van een transgen in een gekozen weefsel mogelijk.
Gentherapie en zenuwchirurgie
In hoofdstuk 1, hebben wij de mogelijkheden van gentherapie in de context van peri- feer zenuwletsel en reconstructieve zenuwchirurgie besproken. Wij hebben hierbij een overzicht gemaakt van: 1) de wetenschappelijke uitdagingen op het gebied van peri- fere zenuwletsel, 2) het vermogen van gentherapie om zenuwregeneratie te verbeteren, en 3) de resultaten van de eerste dierproeven waarbij gentherapie en reconstructieve zenuwchirurgie gecombineerd werden geëvalueerd. Tot slot hebben wij de toekomstige uitdagingen, die het vertalen van deze resultaten naar de kliniek zullen meebrengen,
152 NEDERLANDSE SAMENVATTING
besproken en hebben wij vier mogelijke toekomstige klinische scenario’s van de toepas- sing van gentherapie bij reconstructieve zenuwchirurgie gepresenteerd.
In hoofdstuk 2 hebben wij gekeken of wij de uitkomst van de huidige standaard in zenuwchirurgie te weten de zenuwtransplantatie door middel van gentherapie konden verbeteren. Wij hebben hiervoor een grote in-vivo studie opgezet waarbij er door middel van zes virale vectoren zes verschillende neurotrofe factoren in een zenuwtransplantaat tot overexpressie gebracht werden. We beoordeelden de resultaten op vroege (2 weken) en late (20 weken) tijdspunten door middel van histologische, elektrofysiologische en functionele analyse. Drie van de zes onderzochte neurotrofe factoren (BDNF, GDNF en NGF) toonden veelbelovende vroege stimulerende effecten op axon uitgroei. Persistente expressie bleek echter ongecontroleerde celproliferatie en overmatige sensorische (NGF) dan wel motorische (BDNF, GDNF) uitgroei te induceren. Dit resulteerde ondanks de verbeterde initiële uitgroei tot het “blijven hangen” van regenererende axonen en het uitblijven van herstel op de lange termijn. Deze resultaten benadrukken de potentie van gentherapie maar ook de noodzaak van een gereguleerde genexpressie om herstel te verbeteren.
In hoofdstuk 3 was ons doel om misrouting van regenererende axonen na zenuwchirur- gie te verminderen. Door middel van gentherapie werd de neurotrofe factor GDNF selec- tief in een enkele zenuwtak geïnjecteerd; hierdoor zouden GDNF gevoelige motoraxonen preferentieel de geïnjecteerde tak moeten ingroeien. In het eerste deel van onze studie hebben wij gekeken of dit technisch mogelijk was. Wij zagen een succesvolle en selec- tieve overexpressie van GDNF in de geïnjecteerde tak. Vervolgens werd er in een grotere studie 4 weken na chirurgie gekeken naar de routing van motoraxonen. Door middel van retrograde tracing (hierbij kan het het aantal motoraxonen die selectief de ene of de andere tak ingegroeid zijn geteld worden) zagen wij een toename van motoraxonen in de geïnjecteerde tak. Door de grote variatie kon echter geen significant verschil worden aangetoond. Additionele histologische analyse toonde eveneens een verhoogde hoeveel- heid motoraxonen in de geïnjecteerde tak.
In hoofdstuk 4 beschrijven wij de ontwikkeling van een virale vector die gereguleerde expressie van de neurotrofe factor GDNF in het perifere zenuwstelsel mogelijk maakt.
Wij hebben hiervoor onze vector op het klassieke “Tet-on” systeem gebaseerd. In dit sys- teem is activatie van genexpressie afhankelijk van de aanwezigheid van het anti bioticum tetracycline. Doxycycline, een analoog van tetracycline, kan eenvoudig via het eten toe- gevoegd dan wel verwijderd worden. Helaas is een van de essentiële componenten van het Tet-on systeem te weten de transactivator (rtTA) gebaseerd op bacteriële en virale eiwitten. Dit maakt langdurige regulatie gevaarlijk en dus niet mogelijk. In dit hoofd- stuk presenteren we een reguleerbare virale vector gebaseerd op een nieuwe transacti- vator (GArrtTA) die potentieel in staat is zich te onttrekken aan het immuunsysteem.
In een grote in-vivo proef tonen wij over een periode van 20 weken dat wij succesvol
GDNF-expressie middels onze transactivator GArrtTA aan en uit kunnen zetten in de perifere zenuw.
In hoofdstuk 5 hebben wij gekeken of adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) een geschikt alternatief konden zijn voor het toepassen van gentherapie in het perifere zenuw- stelsel. De huidig gebruikte lentivirale vector (LV), hoewel zeer efficiënt zijn klinisch onveilig en niet toepasbaar. Dit komt doordat LV’s hun genetisch materiaal willekeurig in het gastheercel genoom integreren. Bij deze integratie kunnen belangrijke genen geac- tiveerd dan wel gedesactiveerd worden wat tot ongecontroleerde proliferatie van cellen kan leiden. AAV’s worden als klinisch veilig beschouwd aangezien zij dit niet doen. Wij hebben in deze studie naar 9 verschillende AAV-vectoren (serotypen) gekeken en hun capaciteit om humane en ratten Schwann cellen en zenuwsegmenten te transduceren geanalyseerd. De resulaten tonen aan dat ratten en humane Schwann cellen en zenuw segmenten efficiënt worden getransduceerd maar dat dit door uiteenlopende serotypen gebeurt. AAV2 was hierbij de meest efficiënte vector om menselijke zenuw segmenten te transduceren. Dit is zeer interessant want AAV2 is al in gebruik in verschillende klini- sche trials en heeft tot nu een onberispelijk veiligheidsprofiel.
In hoofdstuk 6 eindigen wij met een discussie over toekomstig onderzoek en hebben we de verder te maken stappen om gentherapie dichterbij de kliniek te brengen besproken.
De te kiezen factor, de route en wijze van levering van de ideale virale vector, de werk- zaamheid en veiligheidseisen van deze vector en de keuze van de patiëntenpopulatie om een eerste proof-of-concept klinische studie te verrichten komen hierbij aan de orde.
Conclusie
Dit proefschrift beschrijft nieuwe ontwikkelingen die hopelijk de toepassing van gen- therapie als toevoeging aan de zenuwchirurgie een stap dichterbij de kliniek moet bren- gen. Wij hebben in eerste instantie bekeken en beschreven wat de meest belemmerende factoren zijn voor succesvolle regeneratie. We hebben beschreven hoe gentherapie hierbij zou kunnen helpen. In onze eerste studies hebben wij verschillende factoren ontdekt die regeneratie zouden kunnen bevorderen mits hun afgifte gereguleerd is. Om dit te doen hebben wij de eerste stap gezet naar een klinische toepasbare reguleerbare virale vector en hebben wij gekeken of wij humane zenuwen konden modificeren met een klinisch veilige virale vector. Een toekomstige studie moet uitwijzen of de gereguleerde expressie van een neurotrofe factor tot een verbetering van de regeneratie zal leiden. Indien dit het geval is dan zou gentherapie een waardevolle toevoeging kunnen worden voor de behan- deling van perifeer zenuwletsel.
154 CURRICULUM VITAE
CURRICULUM VITAE
Stefan Adriaan Hoyng was born on 19 December 1984 in The Hague (NL). He started school at the Prins Willem Alexander School in Woking (UK) and obtained his French baccalauréat from the Lycée International in Saint-Germain-en-Laye (FR) in 2002.
That same year he started his medical degree at Leiden University (NL). While attending medical school, he worked as an organ donor allocation officer at the Euro- transplant International Foundation and was an active member of the Leiden Student Rugby Society.
After an internship at the Massachusetts General Hospital in Boston (USA) under the supervision of Kenneth D. Bloch and Paul. B. Yu. he returned to the Netherlands to start his clinical rotations. Under the supervision of Radboud W. Koot he performed a research project on the neurosurgical management of syringomyelia. In 2009 he received his Medical Degree from Leiden University and was offered a PhD position at the Nether- lands Institute for Neurosciences under the supervision of prof. M.J.A. Malessy and prof dr. J. Verhaagen. This has resulted in the present work. During his PhD he worked as a member of the brain autopsy team of the Netherlands Brain Bank.
In 2014 Stefan started as a resident in the neurosurgery department of the Leiden Uni- versity Medical Center. After two interesting and pleasant years he decided to change his career and to look for a new challenge.
LIST OF PUBLICATIONS
Gene therapy and peripheral nerve repair: a perspective.
Hoyng SA, de Winter F, Tannemaat MR, Blits B, Malessy MJ, Verhaagen J.
Front Mol Neurosci. 2015 Jul 15;8:32. doi: 10.3389/fnmol.2015.00032. eCollection 2015.
PMID:26236188
Decompressive surgery in a patient with hyperostosis corticalis generalisata for relief of cognitive disability and dysaesthesia.
Datema M, Appelman-Dijkstra NM, Hoyng SA, Verstegen MJ, Koot RW.
Acta Neurochir (Wien). 2015 Jul;157(7):1215-8; discussion 1219. doi: 10.1007/s00701-015- 2445-1. Epub 2015 May 15.
PMID:25976340
Gene delivery to rat and human Schwann cells and nerve segments: a comparison of AAV 1-9 and lentiviral vectors.
Hoyng SA, De Winter F, Gnavi S, van Egmond L, Attwell CL, Tannemaat MR, Ver- haagen J, Malessy MJ.
Gene Ther. 2015 Oct;22(10):767-80. doi: 10.1038/gt.2015.47. Epub 2015 May 4.
PMID:25938190
Characterization of glial cell models and in vitro manipulation of the neuregulin1/
ErbB system.
Pascal D, Giovannelli A, Gnavi S, Hoyng SA, de Winter F, Morano M, Fregnan F, Dell’Albani P, Zaccheo D, Perroteau I, Pellitteri R, Gambarotta G.
Biomed Res Int. 2014;2014:310215. doi: 10.1155/2014/310215. Epub 2014 Aug 7.
PMID:25177687
A comparative morphological, electrophysiological and functional analysis of axon regeneration through peripheral nerve autografts genetically modified to overexpress BDNF, CNTF, GDNF, NGF, NT3 or VEGF.
Hoyng SA, De Winter F, Gnavi S, de Boer R, Boon LI, Korvers LM, Tannemaat MR, Malessy MJ, Verhaagen J.
Exp Neurol. 2014 Nov;261:578-93. doi: 10.1016/j.expneurol.2014.08.002. Epub 2014 Aug 12.
PMID:25128265
Schwann cells transduced with a lentiviral vector encoding Fgf-2 promote motor neuron regeneration following sciatic nerve injury.
Allodi I, Mecollari V, González-Pérez F, Eggers R, Hoyng S, Verhaagen J, Navarro X, Udina E.
Glia. 2014 Oct;62(10):1736-46. doi: 10.1002/glia.22712. Epub 2014 Jul 2.
PMID:24989458
156 LIST OF PUBLICATIONS
Developing a potentially immunologically inert tetracycline-regulatable viral vector for gene therapy in the peripheral nerve.
Hoyng SA, Gnavi S, de Winter F, Eggers R, Ozawa T, Zaldumbide A, Hoeben RC, Malessy MJ, Verhaagen J.
Gene Ther. 2014 Jun;21(6):549-57. doi: 10.1038/gt.2014.22. Epub 2014 Apr 3.
PMID:24694534
Specific tools for targeting and expression in Müller glial cells.
Pellissier LP, Hoek RM, Vos RM, Aartsen WM, Klimczak RR, Hoyng SA, Flannery JG, Wijnholds J.
Mol Ther Methods Clin Dev. 2014 Mar 19;1:14009. doi: 10.1038/mtm.2014.9. eCollection 2014.
PMID:26015954
Lentiviral vector-mediated gradients of GDNF in the injured peripheral nerve: effects on nerve coil formation, Schwann cell maturation and myelination.
Eggers R, de Winter F, Hoyng SA, Roet KC, Ehlert EM, Malessy MJ, Verhaagen J, Tanne- maat MR.
PLoS One. 2013 Aug 12;8(8):e71076. doi: 10.1371/journal.pone.0071076. eCollection 2013.
PMID:23951085
Gene therapy approaches to enhance regeneration of the injured peripheral nerve.
de Winter F, Hoyng S, Tannemaat M, Eggers R, Mason M, Malessy M, Verhaagen J.
Eur J Pharmacol. 2013 Nov 5;719(1-3):145-52. doi: 10.1016/j.ejphar.2013.04.057. Epub 2013 Jul 18. Review.
PMID:23872403
Early regenerative effects of NGF-transduced Schwann cells in peripheral nerve repair.
Shakhbazau A, Kawasoe J, Hoyng SA, Kumar R, van Minnen J, Verhaagen J, Midha R.
Mol Cell Neurosci. 2012 May;50(1):103-12. doi: 10.1016/j.mcn.2012.04.004. Epub 2012 Apr 20.
PMID:22735691
Nerve surgery and gene therapy: a neurobiological and clinical perspective.
Hoyng SA, Tannemaat MR, De Winter F, Verhaagen J, Malessy MJ.
J Hand Surg Eur Vol. 2011 Nov;36(9):735-46. doi: 10.1177/1753193411420348. Epub 2011 Sep 13. Review.
PMID:21914696
Bone morphogenetic protein (BMP) type II receptor is required for BMP-mediated growth arrest and differentiation in pulmonary artery smooth muscle cells.
Yu PB, Deng DY, Beppu H, Hong CC, Lai C, Hoyng SA, Kawai N, Bloch KD.
J Biol Chem. 2008 Feb 15;283(7):3877-88. Epub 2007 Nov 27.
PMID:18042551
Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron meta- bolism.
Yu PB, Hong CC, Sachidanandan C, Babitt JL, Deng DY, Hoyng SA, Lin HY, Bloch KD, Peterson RT.
Nat Chem Biol. 2008 Jan;4(1):33-41. Epub 2007 Nov 18.
PMID:18026094
158 ACKNOWLEDGEMENTS
ACKNOWLEDGEMENTS
I would like to thank all the people that contributed to this project. So many of you have helped me in countless ways.
Dear Martijn en Joost. Thank you for your confidence and guidance during this trip.
Through your mentorship I was able to develop myself as an independent researcher.
Dear Fred, my mentor. Your patience, extensive knowledge and excellent capacity to explain even the most complex things in a simple way gave me the opportunity to become a molecular biologist. Thank you also for our weekly squash session as these were yet another area where I could learn so much from you.
Cher Arnaud. Merci de m’avoir permis de retrouver ce petit village d’irréductibles Gaulois! Ton soutien moral et scientifique a été essentiel pour terminer cette thèse.
Je n’oublierai jamais le marathon d’Amsterdam et je suis heureux que cette thèse m’ait permis de trouver un si bon ami.
Dear Sara, what a wonderful addition you were to our team. Your passion and dedication but above all your Italian spirit, kindness and never ending motivation was an example.
It was a great pleasure to visit you in Torino and I am happy to see you are doing so well.
Dear Nitish. Thank you for listening, providing feedback and helping thinking in solu- tions rather than problems. I greatly appreciated our discussions about so many topics.
I am happy to have found yet another great friend through this thesis.
To my very talented students: Sicco, Callan, Laura, Lennard, Loes and Jesse. Without your dedication and hard work nothing presented here would have been possible. It was a pleasure working with you.
Dear colleagues from the Neuroregeneration group. A kind and diverse group with a common goal. It was great to be a part of this team.
Dear collegues from the NBB and NIN. Thank you for your kindness and support. It was a pleasure to work at the Brainbank and the Institute. Research would not be possible without all the great people behind the scenes.
Dear colleagues from the neurosurgery department in Leiden and the Hague. Many thanks for our pleasant collaboration. It was great to be surrounded by so many passion- ate and skilled people.
Dear Boston friends. Thank you for introducing me to the world of molecular biology and American hospitality. Your kindness and passion will always remain a part of me.
It was with great sadness that I learned of Ken’s death. He was a brilliant researcher and great person and it was an honor to have worked with him.
To my parents, sister Anne-Claire and brother Alexander. Thank you for supporting my past and future choices. You have been my compass during so many trips and have always guided me in the right direction.
