University of Groningen Celiac disease Zorro Manrique, Maria Magdalena

Celiac disease

Zorro Manrique, Maria Magdalena

DOI:

10.33612/diss.122712049

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from

it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date:

2020

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Zorro Manrique, M. M. (2020). Celiac disease: From genetic variation to molecular culprits. University of

Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.122712049

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

APPENDICES

Summary.

Samenvatting.

Resumen.

Acknowledgments.

Curriculum Vitae.

List of publications.

Summary

Celiac disease (CeD) is an autoimmune disease triggered by a grain protein called gluten that is frequently present in the Western diet. The disease primarily occurs in the small intestine, where it causes a severe inflammatory response. A lifelong gluten-free diet has emerged as the only available therapy for CeD. Unfortunately, particularly for young patients, this therapy is difficult to adhere to due to social ‘stigma’ and because the diet may lead to nutritional defi-ciencies. Another problem associated with ingesting gluten-free food items is that these may actually contain ‘hidden’ sources of gluten. To design effective treatments and preventative measures, a deeper understanding of the mechanisms underlying the disease is required. As CeD is an intestinal autoimmune disease, disease etiology comprises deregulation in sev-eral cell types that leads to inflammation and degradation of the small intestinal lining. These cell types include cells from the adaptive immune system such as CD4+ _{T cells, which produce} interferon gamma (IFNg), a key cytokine that recruits and activates immune cells; intraepithe-lial cytotoxic lymphocytes (IE-CTLs), the effector cells responsible for killing epitheintraepithe-lial cells; B cells, which secrete autoantibodies and present gluten peptides to the CD4+ _{T cells; and cells} from the innate immune system, such as macrophages and dendritic cells, which contribute to the activation and migration of innate and adaptive immune cells, primarily through the cyto-kines they produce. Lastly, intestinal epithelial cells may also play a role, directly or indirectly, by allowing the passage of ions and nutrients into the body and by expressing molecules/ cytokines that influence the differentiation and function of immune cells.

After several decades of study, researchers have found that the genetic variants associated with CeD risk through genome-wide association studies (GWAS) change expression of cer-tain genes called candidate genes. Candidate genes may alter the function of immune cells and intestinal epithelial cells that reside in gut, thus contributing to the risk of developing CeD. The goal of this thesis research was to gain more insights into the function of some of these candidate genes and the biological processes in which they are involved. To do so, we have integrated in silico methods with experiments performed in the lab using cells and environ-mental conditions thought to be relevant for CeD.

Chapter 1 presents an overview of CeD and the major cell types, cytokines, immune mole-cules and genetic and environmental factors that are thought to contribute to the disease. It also discusses the current limitations on accurately pinpointing candidate genes and some approaches to overcome this issue. Finally, an outline of the chapters is provided.

Although most CeD candidate genes exhibit immune functions, it is known that non-immune genes such as LPP may contribute to the disease. Previous in silico studies have suggested that this poorly characterized gene may be involved in intestinal barrier function, which is

Summary

known to be disturbed in CeD patients. In Chapter 2 we studied the role of LPP in intestinal epithelial cells. We generated intestinal epithelial cell lines with reduced expression of LPP (called LPP knockdown). These cells presented alteration of essential functions such as pro-liferation, permeability of the cellular barrier and the capacity to form organized structures when compared to cells with normal levels of LPP (called controls). Surprisingly, the LPP knockdown cells presented an enhanced inflammatory response to IFNg, a cytokine known to fuel the inflammation in CeD. Thus, these results suggest that LPP may contribute to disease by affecting the non-immune and immune functions performed by epithelial cells.

In Chapter 3, we identified 118 CeD candidate genes by performing expression quantitative

trait loci (eQTL) analysis and subsequently applying different statistical approaches to link these eQTL genes to genetic risk for CeD. Subsequent analysis suggested that these genes affect general and immune-specific processes in the different cell types present in the gut. Interestingly, one of these candidate genes, TRAFD1, was found to be a central regulator of 40 genes implicated in the IFNg signaling and the Major Histocompatibility Class I (MHC-I) antigen processing/presentation pathways. Of note, these biological pathways are known to participate in the abnormal activation of immune cells, specifically the IE-CTLs that are re-sponsible for killing healthy epithelial cells, resulting in intestinal tissue damage in CeD. Al-though further experimental validation for many of the candidates may be needed, the results in this chapter provide a starting point that can lead towards a better understanding of the role of genetic variants associated with CeD in the immune response in CeD pathogenesis. CeD arises when the immune system breaks its tolerance to the otherwise innocuous gluten peptides, thus leading to the subsequent inflammatory response of the adaptive and innate immune system. One of the factors that may contribute to this break in tolerance is deregu-lation of cytokine production. In Chapter 4, we studied how cytokines that are known to be upregulated in autoimmune disease-affected tissues (IFNb, Il-15 and IL-21) alter the gene expression of IE-CTLs, the cells responsible for intestinal destruction in CeD. We found that although each cytokine induced specific patterns of gene expression in IE-CTLs, all the stimuli promoted the expression of genes associated with IFN and IFNg signaling, both of which are processes essential for immune cell activation and perpetuation of inflammation. Due to the fact that the cytokines we used for the experiments are also present in the environment of autoimmune disease–affected tissues, this result indicates that IFN signaling may be a com-mon mechanism that could lead to aberrant activation of IE-CTLs when they are exposed to abnormal inflammatory conditions. This assumption was further confirmed by performing an enrichment analysis of genes differentially expressed in IE-CTLs upon cytokine stimulation in genomic loci associated with several autoimmune diseases. Here we observed that the genes affected by cytokine stimulation in IE-CTLs are enriched in genes found in loci associated with ten common autoimmune diseases. Interestingly, for most of the autoimmune diseas-es tdiseas-ested, the disease-associated gendiseas-es were found to be enriched in IFN signaling gendiseas-es. This indicates the relevance of IE-CTLs and IFN signaling not only in CeD, but also in other

autoimmune conditions, which points to possible therapeutic approaches to ameliorate the abnormal inflammation.

With the advent of next generation sequencing technologies, several types of non-coding RNA molecules, which are encoded in our genetic background, have been uncovered. Among them, long non-coding RNAs (lncRNA) and microRNAs have garnered a lot of attention due to their role in regulating biological processes such as gene expression and immune cell differ-entiation and activation (reviewed in Chapter 5). Furthermore, several reports have indicated that alterations in the expression of these RNA molecules may be associated with multiple cancers and autoimmune diseases. Despite the biological relevance of these transcripts, their precise functions remain poorly understood.

To better understand the role of lncRNAs in the innate immune system, we characterized one lncRNA, RP11-291B21.2, in IE-CTLs (Chapter 6). We studied the expression pattern of

RP11-291B21.2 in different immune cell populations derived from blood and found that this

lncRNA is uniquely expressed in CTLs. We also found that the level of RP11-291B21.2 was higher when the CTLs are less activated, suggesting that this lncRNA could participate in T cell activation. This observation was further confirmed by combining co-expression network analysis (an in silico method to predict gene function) with experiments in cells with a reduced expression of RP11-291B21.2 (knockdown). Here we observed impaired production of some cytokines relevant for CeD (IFNg and TNF) and reduced expression of several genes associ-ated with cell activation and inflammation in the RP11-291B21.2 knockdown when compared with the controls. Although we do not fully understand how RP11-291B21.2 influences the ac-tivation of IE-CTLs, our results constitute an interesting basis for further study of this lncRNA in the biology of CTLs and in autoimmune-mediated diseases where abnormal CTL activation is associated with tissue destruction.

Finally, in Chapter 7, we summarize and integrate the major findings of this thesis. Further-more, we discuss some of the gaps regarding the study of candidate genes and biological pathways associated with CeD and how novel technologies could be used to fill these gaps and confirm hypotheses derived from in silico analysis or in vitro models to move us further towards the design of novel therapeutic interventions for CeD.

Samenvatting

Sammenvatting

Coeliakie (CeD) is een auto-immuunziekte die veroorzaakt wordt door het eten van graanpro-ducten die het eiwit gluten bevatten. Gluten komen veel voor in een Westers dieet. Bij iemand met coeliakie ontstaan door het eten van gluten ernstige ontstekingsreacties in de dunne darm. De enige effectieve behandeling voor coeliakie bestaat uit het levenslang volgen van een strikt glutenvrij dieet. Met name voor jonge patiënten is het moeilijk om zich aan een glu-tenvrij dieet te houden. Het volgen van een gluglu-tenvrij dieet is complex en de kans op een te-kort aan voedingsstoffen is groot. Ook kan het een belemmering vormen in het sociale leven. Een bijkomend probleem is dat veel voedingsbronnen verborgen sporen van gluten bevatten. Om verdere behandeling en preventieve maatregelen te ontwikkelen, is er een beter begrip nodig van de precieze onderliggende mechanismes die deze ziekte veroorzaken.

CeD is een auto-immuunziekte die veroorzaakt wordt door deregulatie van een groot sca-la aan verschillende celtypes wat vervolgens leidt tot infsca-lammatie en beschadiging van het darmslijmvlies in de dunne darm. Eén van de celtypes die hierbij betrokken zijn, zijn CD4+ _T cellen, afkomstig uit het adaptieve immuunsysteem. Deze cellen produceren interferon gam-ma (IFNg), een cytokine dat een belangrijke rol speelt in het rekruteren en activeren van andere immuun cellen. Intra-epitheliale cytotoxische lymfocyten (IEL-CTLs) zijn daarnaast ook betrokken bij het inflammatieproces. Deze effector cellen zijn verantwoordelijk voor de beschadiging van de epitheelcellen die de darmwand vormen. Ook B-cellen spelen een rol in de pathobiologie van CeD. Deze cellen produceren auto-antilichamen en presenteren gluten peptiden aan de CD4+ _{T cellen. Daarnaast zijn cellen uit het aangeboren immuunsysteem} betrokken, zoals macrofagen en dendritische cellen. Deze dragen bij aan de activatie en mi-gratie van cellen uit zowel het adaptieve als het aangeboren immuunsysteem, hoofdzakelijk door de cytokines die ze produceren. Tenslotte is het mogelijk dat epitheelcellen, direct of indirect, bijdragen aan de ziekte. Bijvoorbeeld door het reguleren van het transport van ionen en nutriënten naar het lichaam en door de expressie van moleculen/cytokines die de differen-tiatie en functie van de immuun cellen beïnvloeden.

Met behulp van genoom brede associatiestudies (GWAS) zijn in het laatste decennium vele genetische varianten geïdentificeerd die een verhoogd risico op CeD geven. Onderzoek heeft uitgewezen dat deze varianten de expressie van bepaalde genen veranderen (ook wel kandi-daat genen genoemd). Deze kandikandi-daat genen zouden de functie van immuun- en darmepit-heelcellen kunnen veranderen en op die manier kunnen bijdragen aan een verhoogd risico op CeD. Het doel van dit proefschrift wasom meer inzicht te krijgen in de functie van enkele kandidaat genen én de biologische mechanismen waar deze genen bij betrokken zijn. Om dit te onderzoeken heb we in silico methodes geïntegreerd met experimenten in het laboratorium en gebruik gemaakt van cellen en omgevingsfactoren die waarschijnlijk relevant zijn voor CeD.

Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de voornaamste celtypes, cytokines, immuun molecu-len en genetische- en omgevingsfactoren die zouden kunnen bijdragen aan CeD. Daarnaast brengen we de tekortkomingen in beeld in het nauwkeurig aanwijzen van kandidaat genen en beschrijven we enkele manieren om dit te ondervangen. Tenslotte is hier een overzicht van de verschillende hoofdstukken te vinden.

Hoewel de meeste kandidaat genen die geassocieerd zijn met CeD een rol spelen in het im-muunsysteem, is het bekend dat niet immuun-gerelateerde genen, zoals LPP, ook bij kunnen dragen aan de ziekte. Eerdere in silico studies suggereren dat dit slecht gekarakteriseerde gen mogelijk betrokken is bij de barrièrefunctie van de darm, waarvan bekend is dat deze ont-regeld is bij CeD patiënten. In hoofdstuk 2 bestuderen we de rol die LPP speelt in darmepit-heelcellen. We hebben darmepitheelcellen ontwikkeld met een verminderde LPP-expressie (dit wordt LPP knockdown genoemd). Deze cellen vertoonden veranderingen in essentiële functies ten opzichte van darmepitheelcellen met een normaal LPP-expressieniveau (con-troles genaamd). Deze veranderingen hadden betrekking op celgroei, doorlaatbaarheid van de cellulaire barrière en het vermogen om georganiseerde structuren te vormen. Verrassend genoeg lieten de LPP knockdown cellen een verhoogde ontstekingsreactie zien na blootstel-ling aan IFNg, een cytokine waarvan we weten dat het de ontstekingsreactie in CeD versterkt. Deze resultaten suggereren dat LPP bijdraagt aan de ziekte via zowel non-immuun als im-muun functies van darmepitheelcellen.

In hoofdstuk 3 hebben we 118 CeD-geassocieerde kandidaat genen geïdentificeerd door

middel van expression quantitative trait loci (eQTL) analyse en vervolgens verschillende sta-tistische benaderingen toegepast om eQTL genen aan een genetisch risico op CeD te kop-pelen. Vervolganalyses suggereren dat deze genen algemene en immuun-specifieke proces-sen beïnvloeden in de verschillende celtypes die in de darm aanwezig zijn. Een interessante bevinding was dat een van de kandidaat genen, TRAFD1, een centrale regulator blijkt te zijn van 40 genen die nauw betrokken zijn bij IFNg signalering en het verwerken en presenteren van antigenen via Major Histocompatibility Class I (MHC I) moleculen. Van deze biologische mechanismen isbekend dat ze bijdragen aan abnormale activatie van immuun cellen, in het bijzonder de IE-CTLs. Deze cellen zijn verantwoordelijk voor het vernietigen van gezonde darmepitheelcellen, wat resulteert in beschadigingen aan het darmweefsel in CeD. Hoewel verdere experimentele validatie voor veel van de kandidaat genen nodig is, bieden de resul-taten in dit proefschrift een startpunt dat verder kan leiden naar een verbeterd inzicht in de rol van genetische varianten in de immuunreactie die karakteristiek is voor CeD.

CeD ontstaat wanneer het immuun system haar tolerantie verliest voor de, normaal gespro-ken, onschadelijke gluten peptiden. Dit heeft een ontstekingsreactie gemedieerd door het adaptieve en aangeboren immuunsysteem tot gevolg. Eén van de factoren die bijdraagt aan het verliezen van deze tolerantie is een ontregeling in cytokineproductie. In hoofdstuk 4 heb-ben we onderzocht hoe cytokines, die verhoogd zijn in weefsels die door auto-immuunziektes

Samenvatting

zijn aangedaan (IFNb, Il-15 en IL-21), de genexpressie profiel van IE-CTLs veranderen. Dit celtype is verantwoordelijk voor de darm beschadiging in CeD. Ondanks dat ieder individueel cytokine de expressie van specifieke genen induceert in IE-CTLs, ontdekten wij dat al deze cytokines genen induceren die geassocieerd zijn met IFN en IFNg signalering. Beiden zijn essentieel voor immuun cel activatie en het voortzetten van inflammatie. Aangezien de cytoki-nes, die we hebben gebruikt voor de experimenten ook aanwezig zijn in weefsels aangedaan door auto-immuunziekte, duidt dit resultaat erop dat IFN-signalering een algemeen mecha-nisme is dat leidt tot een afwijkende activatie van IE-CTLs, wanneer ze blootgesteld zijn aan abnormale inflammatoire omstandigheden. Deze aanname werd verder bevestigd door het bestuderen van genen, gelegen in regio’s van het DNA die geassocieerd zijn met meerdere auto-immuun ziektes, waarvan de expressie verhoogd of verlaagd is in IE-CTLs na bloot-stelling aan verschillende cytokines.Hier ontdekten wij dat de genen die aangedaan zijn na het stimuleren van IE-CTLs met verschillende cytokines, verrijkt zijn voor genen die gelegen zijn in regio’s die geassocieerd zijn met tien veel voorkomende auto-immuun ziektes. Het is interessant dat, voor de meeste van de onderzochte auto-immuun ziektes, de ziekte-geas-socieerde genen die gevonden werden verrijkt zijn voor genen die betrokken zijn bij IFN-sig-nalering. Zodoende toont dit resultaat het belang van IE-CTLs en IFN signalering niet alleen voor CeD aan, maar ook voor andere auto-immuun ziektes. Deze informatie zou van belang kunnen zijn voor het ontwikkelen van therapieën die kunnen helpen bij het verminderen van een abnormale ontstekingsreactie.

Door de komst van next generation sequencing technologieën zijn er verschillende niet-co-derende RNA-moleculen ontdekt in ons DNA.Onder andere long non-coding RNAs (lncRNA) en microRNAs hebben veel aandacht gekregen dankzij hun rol in de regulatie van biologische mechanismen zoals genexpressie, immuun cel differentiatie en activatie (besproken in hoofd-stuk 5). Ook heeft onderzoek uitgewezen dat er een mogelijke associatie bestaat tussen een verandering in de expressie van deze RNA-moleculen en verschillende vormen van kanker en auto-immuun ziektes. Ondanks de belangrijke rol van deze moleculen, blijft de precieze functie slecht begrepen.

In een poging om de rol van lncRNAs in het aangeboren immuunsysteem beter te begrij-pen, hebben we lncRNAs (RP11-291B21.2) gekarakteriseerd in IEL-CTLs (hoofdstuk 6). We hebben het expressie patroon van RP11-291B21.2 bestudeerd in verschillende immuun cel populaties afkomstig uit bloed en ontdekten dat deze lncRNA uitsluitend tot expressie komt in CTLs. Ook zien we dat het expressie niveau van RP11-291B21.2 hoger is wanneer de CTLs minder actief zijn, wat suggereert dat deze lncRNA een rol zou kunnen spelen in T-cel activa-tie. Deze bevinding is verder bevestigd door het combineren van een co-expressie netwerk analyse (een in silico analyse om de functie van een gen te voorspellen) met experimenten in cellen met een verminderde expressie van RP11-291B21.2 (knockdown). We observeren een vermindering in de productie van cytokines die relevant zijn voor CeD (IFNg en TNF) en een verminderde expressie van verschillende genen die geassocieerd zijn met cel activatie

en inflammatie wanneer we de RP11-291B21.2 knockdown vergelijken met de controles. Al-hoewel we niet volledig begrijpen hoe RP11-291B21.2 de activatie van IE-CTLs beïnvloedt vormen onze resultaten een interessante basis voor verder onderzoek naar RP11-291B21.2 in CTL biologie en in auto-immuun-gemedieerde ziektes waarin een abnormale CTL activatie geassocieerd is met weefsel afbraak.

Tenslotte heb we in hoofdstuk 7 de belangrijkste bevindingen van dit proefschrift samen-gevat. Verder bespreek we enkele tekortkomingen in het vaststellen van kandidaat genen en biologische mechanismen geassocieerd met CeD. Daarnaast bespreek we hoe nieuwe technologieën kunnen worden gebruikt om deze tekortkomingen te overkomen en om hypo-theses, die voortkomen uit in silico analyses of in vitro modellen, te ondersteunen, zodat deze bij kunnen dragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies voor CeD.

Resumen

Resumen

La enfermedad celíaca (CeD), es una enfermedad autoinmune que se desencadena por una proteína de los granos llamada gluten, la cual es frecuente en la dieta occidental. La enferme-dad ocurre principalmente en el intestino delgado donde causa una respuesta inflamatoria se-vera. Una dieta libre de gluten de por vida se ha convertido en la única terapia disponible para CeD. Desafortunadamente, especialmente para pacientes jóvenes, esta terapia es difícil de cumplir debido al “estigma” social y porque la dieta puede conducir a deficiencias nutriciona-les. Otro problema asociado con la ingestión de alimentos sin gluten es que todavía pueden contener fuentes de gluten “ocultas”. Para poder diseñar tratamientos efectivos y medidas preventivas, se requiere una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes a la enfermedad.

La CeD es una enfermedad autoinmune intestinal, la etiología de esta enfermedad incluye la desregulación en varios tipos de células, lo que provoca inflamación y degradación del reves-timiento del intestino delgado. Las células involucradas pertenecen al sistema inmunitario adaptativo tales como las células T CD4+ _{que producen interferón gamma (IFNg), una} citoqui-na clave que recluta y activa las células inmunes; los linfocitos citotóxicos intraepiteliales (IE-CTL), las células efectoras responsables de matar el epitelio células y células B que secretan autoanticuerpos y presentan péptidos de gluten a las células T CD4+_{; las células del sistema} inmune innato, tales como los macrófagos y las células dendríticas, los cuales contribuyen a la activación y migración de las células inmunes innatas y adaptativas, debido principalmente a las citoquinas que producen. Por último, las células epiteliales intestinales también pueden desempeñar un papel, directo o indirecto, al permitir el paso de iones y nutrientes al cuerpo y también al expresar moléculas/citoquinas que influyen en la diferenciación y la función de las células inmunes.

Después de varias décadas de estudio, los investigadores han encontrado que las variantes genéticas asociadas con el riesgo de CeD descubiertas mediante estudios de asociación de genoma completo (GWAS) cambian la expresión de ciertos genes (denominados genes can-didatos). Los genes candidatos pueden alterar la función de las células epiteliales inmunes y epiteliales que residen en el intestino, lo que contribuye al riesgo de desarrollar CeD. El objetivo de esta tesis fue obtener más información sobre la función de algunos de los genes candidatos y los procesos biológicos en los que participan estos genes. Para hacerlo, hemos integrado métodos in silico con experimentos realizados en el laboratorio utilizando células y condiciones ambientales que se consideran relevantes para la enfermedad.

El Capítulo 1 presenta una descripción general de la CeD, los principales tipos de células,

citoquinas, moléculas inmunes y factores genéticos y ambientales que se cree que contribuy-en a la contribuy-enfermedad. Además, se describcontribuy-en las limitaciones para idcontribuy-entificar con precisión los

genes candidatos y algunos enfoques para superar este problema. Finalmente, se proporcio-na un resumen de los capítulos.

Aunque la mayoría de los genes candidatos a CeD exhiben funciones inmunes, se sabe que los genes no inmunes, como LPP, pueden contribuir a la enfermedad. Estudios previos realizados in silico han sugerido que este gen mal caracterizado puede estar involucrado en la función de barrera intestinal, que se sabe que está alterada en pacientes con CeD. En el Capítulo 2 estudiamos el papel de LPP en las células epiteliales intestinales. Generamos líneas celulares epiteliales intestinales con una expresión reducida de LPP (llamado LPP knockdown). Estas células presentaron alteración de funciones esenciales como la prolif-eración, la permeabilidad de la barrera celular y la capacidad de formar estructuras orga-nizadas en comparación con las células con un nivel normal de LPP (llamados controles). Sorprendentemente, las células LPP knockdown presentaron una respuesta inflamatoria exagerada a IFNg, una citoquina que es conocida por promover la inflamación en CeD. Por lo tanto, estos resultados sugieren que LPP puede contribuir a la enfermedad al afectar las funciones inmunes y no inmunes que realizan las células epiteliales.

En el capítulo 3, identificamos 118 genes candidatos de CeD realizando un análisis llama-do “expression quantitative trait loci (eQTL)” y posteriormente aplicanllama-do diferentes enfoques estadísticos para vincular los genes eQTL con el riesgo genético de CeD. Un análisis subse-cuente sugirió que estos genes afectan no solo procesos biológicos generales sino también procesos inmunes muy específicos en los diferentes tipos de células que están presentes en el intestino. Interesantemente, nosotros descubrimos que TRAFD1, uno de estos genes candidatos, es un regulador central de 40 genes que participan en las vías de señalización de IFN/IFNg y también en la vía de señalización de procesamiento/presentación de antígenos dependiente del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I). Es de destacar el hecho que estas vías biológicas participan en la activación anormal de las células inmunes, específicamente los IE-CTLs, que son responsables de matar las células epiteliales sanas, lo que resulta en daño del tejido intestinal en la CeD. Aunque puede ser necesaria una vali-dación experimental adicional para muchos de los candidatos, los resultados en este capítulo representan un punto de partida para una mejor comprensión del papel de las variantes genéticas asociadas con CeD y la respuesta inmune en la patogénesis de CeD.

CeD surge cuando el sistema inmune rompe su tolerancia a los péptidos de gluten inocuos, desencadenando una respuesta inflamatoria en la que participan el sistema inmune adapta-tivo e innato. Uno de los factores que pueden contribuir a esta ruptura en la tolerancia es la desregulación en la producción de citoquinas. En el Capítulo 4, estudiamos cómo las citoqui-nas que se sabe que están reguladas positivamente en los tejidos afectados por enferme-dades autoinmunes (IFNb, lL-15 e IL-21) alteran la expresión génica de IE-CTLs, las células responsables de la destrucción intestinal en CeD. Descubrimos que, aunque cada citoquina inducía patrones específicos de expresión génica en IE-CTLs, todos los estímulos promovían

Resumen

la expresión de genes asociados con la señalización de IFN e IFNg, lo cual es esencial para la activación de las células inmunes y la perpetuación de la inflamación. Debido a que las citoquinas que usamos para los experimentos también están presentes en el entorno de los tejidos afectados por enfermedades autoinmunes, este resultado indica que la señalización de IFN puede ser un mecanismo común que podría conducir a la activación aberrante de IE-CTLs cuando están expuesto a condiciones inflamatorias anormales. Esta suposición se confirmó aún más haciendo un análisis de enriquecimiento de genes expresados diferen-cialmente en IE-CTLs tras la estimulación con citoquinas, en loci genómicos asociados con varias enfermedades autoinmunes. Observamos que los genes que se ven afectados por la estimulación de citoquinas en IE-CTLs están enriquecidos en genes que se encuentran en loci asociados con diez enfermedades autoinmunes comunes. Curiosamente, para la may-oría de las enfermedades autoinmunes probadas, se encontró que los genes asociados a dichas enfermedades están enriquecidos en el grupo de genes que participan en la vía de señalización de IFN. Por lo tanto, esto indica la relevancia de los IE-CTLs y la señalización de IFN no solo en CeD sino también en otras afecciones autoinmunes, lo que apunta a posibles enfoques terapéuticos para reducir la inflamación anormal.

Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación (“next genetion”, se han descubier-to varios tipos de moléculas de ARN no codificantes, que están codificadas en nuestro fondo genético. Entre ellos, los ARN largos no codificantes (lncRNA) y los microRNA han ganado mucha atención debido a su papel en la regulación de procesos biológicos como la expresión génica y la diferenciación y activación de las células inmunes (revisado en el Capítulo 5). Además, varios informes han indicado que las alteraciones en la expresión de estas molécu-las de ARN pueden estar asociadas con múltiples cánceres y enfermedades autoinmunes. A pesar de la relevancia biológica de estos transcritos, sus funciones precisas siguen siendo poco conocidas.

Como un intento de comprender el papel de los lncRNAs en el sistema inmune, caracter-izamos el lncRNA (RP11-291B21.2) en los IE-CTLs (Capítulo 6). Estudiamos el patrón de expresión de RP11-291B21.2 en diferentes poblaciones de células inmunes derivadas de la sangre y descubrimos que este lncRNA se expresa de manera especifica en CTLs. También descubrimos que el nivel de RP11-291B21.2 era mayor cuando los CTLs están menos ac-tivados, lo que sugiere que este lncRNA podría participar en la activación de las células T. Esta observación se confirmó aún más combinando el análisis de coexpresión (un análisis

in silico para predecir la función del gen) con experimentos en células con una expresión

reducida de RP11-291B21.2 (knockdown). Observamos una reducción en la producción de algunas citoquinas relevantes para CeD (IFNg y TNF) y una expresión reducida de vari-os genes asociadvari-os con la activación celular y la inflamación en células RP11-291B21.2 knockdown en comparación con los controles. Aunque no entendemos completamente cómo

RP11-291B21.2 influye en la activación de IE-CTLs, nuestros resultados constituyen una

enfermedades autoinmunes donde una activación anormal de CTLs está asociado con la destrucción del tejido

Finalmente, en el Capítulo 7, resumimos e integremos los principales hallazgos de esta tesis. Además, discutmos algunos de los vacíos con respecto al estudio de genes candidatos y vías biológicas asociadas con CeD y cómo las nuevas tecnologías podrían usarse para llenar estos vacíos y confirmar hipótesis derivadas de análisis in silico o modelos in vitro para poder avanzar hacia el diseño de nuevas intervenciones terapéuticas para CeD.

Acknowledgements

Acknowledgments

At last I have managed to finish this long ride. I could have not made it without the help and support of the many friends and colleagues I encountered during this adventure. Coming abroad to do a PhD was a life-changing experience, and I do not have enough words to ex-press my gratitude for how you were all there for me.

Dear Cisca, thank you for giving me the chance to be your student. I am really lucky to have you as my promotor. You are one of the most brilliant and successful people I have ever met, but you are also a very kind person who I truly admire. You have gathered such a nice group and, in consequence, I had the opportunity to be part of a great team and have excellent col-laborators by my side.

I feel so grateful for having Sebo and Iris as my daily supervisors. Both of you were fundamen-tal for completing my thesis and for my learning process. You provided me with the guidance and tools to face challenges big and small (as well as troubles). Thanks for your patience, your commitment, your support and for believing and encouraging me. I could not be more grateful. I would like to extend my gratitude to the members of the reading committee, for critically reading and approving my thesis.

I also want to thank to Vinod and Bana, who were also my daily supervisors at some point of my PhD. Thank you so much for your kindness and for bringing new perspectives to my work. Thanks to Yang and Serena. Although you were not my supervisors you provided me with great guidance for compiling my work. Thanks for your support and patience (and for the many p-values you provided to this thesis.

This PhD did not escape paperwork, English editing and technical stuff, for which I would like to thank: Hélène, Mentje, Bote, Janneke, Jackie, Kate, Rutger (thanks for the overzicht, and many more stuffs especially in the lab), Mathieu, Astrid, Michiel F, Jody, Ludolf, Kim, Baram and Desiree. Thanks so much as well to our collaborators on the barrier (Michael Schumann, Sven C.D. van lJzendoorn) and IELs stories (Toufic, Cezz, Jagoda, Jill and Vu). All of you guys gave me a hand in critical moments of this ride.

Because of the open space of our offices and due to the many meetings we had, I had the chance to meet new people very often. The first meeting I had was to celebrate the last days of summer, and it was organized by “the party animals”: Isis, Rodri, Javier, Juha, Mamen, Ana, Barbara, Annia, Urmo and Cleo. Thank you guys for embracing me in your group on the very first day. All of you are so talented and friendly. Unfortunately, you left very soon, and I have missed having you around. Special thanks to “la chiquilla” y “mi panita” for being such good friends and for helping me in both science and real life, los quiero chiquillos.

In another meeting, Sebo asked me to work with LPP and, although this protein gave me some trouble, it also gave me the best team ever: Luz and Joram, the LPP team. Luz fuiste mi mejor compi y una gran amiga dentro y fuera del lab, te quiero mucho. Joram, mijn eerste student, thanks for bringing new enthusiasm and nice ideas to the team.

More meetings came and in some of them I got cool ideas, nice suggestions or advice for which I want to thank Dineke, Sasha, Chan and Jelle.

You may know that spent a lot of time in the lab. At the beginning it was just me and the pi-pettes, but then other students joined: Ferronika, Kai, Zuzza, Roeland and Renée. Thanks guys for sharing funny and nerdy moments and also a few microliters of plasmids, antibodies or cytokines.

When I was finally done with the lab, I could gather a bit more with other students. Thanks to Werna and Aaron for sharing your single cell secrets and for the nice chats and some beers we grabbed. Bibi, Ineke, Annique, Dylan, Olivier, Xiaojing, Sipko, Monique, Niek, Pieter, Alex Harm, Sana, Trishla, Ruggero, Laura, Michiel V, Patrick, Marc J, Edie, Lennart, Jiacong, Joost, Johanne, Valerie, Pim and many more... thanks for the nice talks and for the help you gave me with tricky tasks.

I also had the great chance to cross paths with five fabulous researchers: Vicky, Kieu, Arnau, Adriaan and Raul. Thanks guys for being the best company during this nerdy ride. Thanks for your friendship and for helping me with many academic issues (with the cluster, with R, in the lab, with the taxes, giving me info about communism, Catalan life style, Dutch life, etc.). I am grateful for the moments we shared, and for the gossip and jokes. I really admire you guys and wish you the best in your personal and professional life. Raul and Adriaan, I really appreciate the many analyses you performed and the time you invested in explaining stuff to me, they gave a boost to my work.

Estar lejos de casa no fue tan difícil porque tenía grandes amigos: Silvia, Alfred, Ailinecita, David, Alejo, Gaby, Javier, Lili, Marty, Mayra, Julito, Mitch, Vivi, Nils, Jorgito, Cris, Diego, Vladsy, Jensy, la monita, Laura, Genaro, Bibi, morra, Ciriaco, Sophy, los amigos EU y NBFF. Los quiero un montón y no veo la hora de que nos encontremos de nuevo así sea un ratico, con ustedes soy muy feliz.

I want to thank my paranymphs Kiue and Joram (and Alfred, “the backup paranymph”) for being my friends, for taking care of this intricate task and for making my big, but scary, day smoother.

Acknowledgements

Gracias a mis papas, por el gran esfuerzo que hicieron para que mis hermanos y yo alca-nzáramos nuestras metas. Les agradezco a ellos y mis hermanos por cuidar de mi, incluso en la distancia pude sentir su amor genuino, su apoyo y sus oraciones.

Gracias a mi negrito, porque apostaste por mi y ganamos. No sabes lo afortunada, feliz y agradecida que me siento de tener a mi mejor amigo y al amor de la vida como mi compañero de aventuras y de los sueños por cumplir. Contigo no me da miedo empacar maletas y em-pezar de cero. Te amo y te adoro mi negrito de chocolate.

Curriculum vitae

Maria Magdalena Zorro Manrique was born in Puerto Wilches, Colombia in 1979. She gradu-ated from Comfenalco high school in Bucaramanga, where she first got fascingradu-ated by Biology and Chemistry. In 1999 she enrolled in the Bacteriology program at the Universidad Industrial de Santander. As she was just about to finish her bachelor’s degree, Maria joined CINTROP, a group that studies tropical diseases under the leadership of Patricia Escobar. To fulfill gov-ernment regulations, Maria then worked for six months in a hospital located in a small village. After completing this task, she went back to CINTROP, where she had a lot freedom to do her first experiments and got more curious about science.

In 2006 Maria received a scholarship from the Universidad de Antioquia to pursue her mas-ter’s degree. She carried out her masmas-ter’s thesis research in the immunomodulation group, where she learnt a lot of immunology under the supervision of Robinson Ramirez, a bright researcher. After finishing her studies, Maria continued working as research assistant in the same group, exploring the world of dendritic cells, parasites, mice and vaccination. During these years she laid the foundation for becoming a critical thinker and independent researcher while making new friends and forming bonds for life in Antioquia.

Maria wanted to do a PhD. But this could only happen after a one year stop in Neiva in 2012. In Neiva, Maria worked in a kidney transplant group and as a lecturer. During this period she became really interested in genetics, especially when combined with immunology. When she heard about a great immunogenetics group in the Netherlands, she immediately contacted them and, to her surprise, got a call back.

In 2013, Maria got on a plane to Netherlands to join Cisca Wijmenga’s group. In this group Ma-ria developed knowledge of genetics, mucosal immunology, molecular biology and a little bit of bioinformatics. She performed some successful (and also some terrible) experiments. As her hard work began to pay off, she received awards including a de Cock grant and a Simons fund grant. A trip to Chicago to do crazy experiments led to the research that became her first first-author paper as well as to a bunch of great collaborators and amazing friends. Chapter by chapter, Maria came to the finish the work that makes up this thesis.

Because Maria and her husband were missing home, they moved back to Colombia, where she is now trying to build a new career in the academic world - just this time far from the lab.

List of publications

List of publications

• Zorro MM, Aguirre-Gamboa R, Mayassi T, Ciszewski C, Barisani D, Hu S, Weersma R, Withoff S, Li Y, Wijmenga C, Jabri B, Jonkers I. Tissue alarmins and adaptive cytokine induce dynamic and distinct transcriptional responses in tissue-resident intraepithelial cy-totoxic T lymphocytes. J Autoimmun. 108 (2020).

• Ricaño-Ponce I, Gutierrez-Achury J, Costa AF, Deelen P, Kurilshikov A, Zorro MM, Platteel M, van der Graaf A, Consortium for the study of genetic associations of celiac disease in Latin-America, Sanna S, Daffra O, Zhernakova A, Fu J, Trynka G, Smecuol E, Niveloni SI, Bai JC, Kumar V, Wijmenga C. Immunochip meta-analysis in European and Argentinian populations identifies two novel genetic loci associated with celiac disease. Eur J Hum Genet. 28, 313-323 (2019).

• Hrdlickova B, Mulder C, Malamut G, Meresse B, Platteel M, Kamatani Y, Ricaño-Ponce I, van Wanrooij RLJ, Zorro MM, Jan Bonder M, Gutierrez-Achury J, Cellier C, Zhernakova A, Nijeboer P, Galan P, Withoff S, Lathrop M, Bouma G, Xavier RJ, Jabri B, Bensussan NC, Wijmenga C. A locus at 7p14.3 predisposes to refractory celiac disease progression from celiac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol. 30, 828–837 (2018).

• Aguirre-Gamboa R, de Klein N, di Tommaso J, Claringbould A, Võsa U, Zorro MM, Chu X, Bakker OB, Borek Z, Ricaño-Ponce I, Deelen P, Xu CJ, Swertz M, Jonkers I, Withoff S, Joosten I, Sanna S, Kumar V, Koenen HJPM, Joosten LAB, Netea MG, Wijmenga C, BIOS Consortium, Franke L, Li Y. Deconvolution of whole blood eQTLs effects into cell subpopulations. Preprint doi:10.1101/548669 (2019).

• Bakker OB, Aguirre-Gamboa R, Sanna S, Oosting M, Smeekens SP, Jaeger M, Zorro MM, Võsa U, Withoff S, Netea-Maier RT, Koenen H, Joosten I, Xavier RJ, Franke L, Joosten L, Kumar V, Wijmenga C, Netea MG, Li Y. Integration of multi-omics datasets and deep phenotyping enables prediction of cytokine production in response to pathogens. Nature Immunol. 19, 776-786 (2018).

• Aguirre-Gamboa R, Joosten I, Urbano, PCM, van der Molen R, van Rijssen E, van Cranen-broek B, Oosting M, Smeekens S, Jaeger M, Zorro MM, Withoff S, van Herwaarden A, Sweep F, Netea R, Swertz MA, Franke L, Xavier RJ, Joosten L, Netea MG, Wijmenga C, Kumar V, Li Y, Koenen H. Differential Effects of Environmental and Genetic Factors on T and B Cell Immune Traits. Cell Rep. 17, 2474–2487 (2016).

• Ricaño-Ponce I, Zhernakova V, Deelen P, Luo O, Li X, Isaacs A, Karjalainen J, Di Tommaso J, Borek ZA, Zorro MM, Gutierrez-Achury J, Uitterlinden AG, Hofman A, van Meurs J; BIOS Consortium; Lifelines Cohort Study, Netea MG, Jonkers IH, Withoff S, van Duijn CM, Li Y, Ruan Y, Franke L, Wijmenga C, Kumar V. Refined mapping of autoimmune disease associated genetic variants with gene expression suggests an important role for non-coding RNAs. J Autoimmun. 68, 62–74 (2016).

• Gutierrez-Achury J, Zorro MM, Ricaño-Ponce I, Zhernakova DV, Diogo D, Raychaudhu-ri S, Franke L, Trynka G, Wijmenga C, and Zhernakova A. Functional implications of disease-specific variants in loci jointly associated with coeliac disease and rheumatoid arthritis. Hum Mol Genet. 25, 180–190 (2016)

• Stachurska A, Zorro MM, van der Sijde MR, Withoff S. Small and Long Regulatory RNAs in the Immune System and Immune Diseases. Front Immunol. 5:513 (2014).

Celiac disease

from genetic variation to molecular culprits

Zorro Manrique

to the public defense of

Maria Magdalena

Zorro Manrique

thesis entitled

Celiac disease:

from genetic variation to

molecular culprits.

On Wednesday 22th April 2020 at 11.00 hours in the Academiegebouw of the University of Groningen Broerstraat 5, Groningen Followed by a reception mariamzm@gmail.com

Paranymphs:

from genetic variation to molecular culprits •