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The handle http://hdl.handle.net/1887/20020 holds various files of this Leiden University dissertation.

Author: Andreoni, Alessio

Title: Shedding light on biological redox processes - Single molecule studies of Cu- containing oxidoreductases

Issue Date: 2012-10-24

Chapter 8. Summary

Riassunto

Lo studio di processi di trasferimento elettronico e reazioni di ossidoriduzione

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e importante al fine di comprendere una vasta gamma di processi biochimici.

Ad oggi le tecniche di ricerca in grado di studiare singolarmente, una per una, le molecole (single-molecule techniques) costituiscono uno strumento prezioso ed elegante per indagare reazioni chimiche di rilevanza biologica, e ci` o ` e reso possibile dalla loro vasta diffusione e dai progressi tecnologici che le hanno rese fruibili ad un ampio pubblico di ricercatori nel campo sci- entifico. In questa tesi viene presentata una ricerca effettuata su reazioni di trasferimento di elettroni e di ossidoriduzione per mezzo di tecniche a singola molecola. I principali protagonisti sono due proteine: l’azzurrina, estratta da Pseudomonas aeruginosa, e la blu nitrito reduttasi, estratta da Alcaligenes xylosoxidans. Entrambe contengono uno ione rame che, nella forma ossidata, conferisce loro un caratteristico ed intenso colore blu, mentre nella forma ridotta ` e incolore. Questa peculiarit` a fa s`ı che sia pos- sibile utilizzare un metodo basato sulla fluorescenza per testare lo stato di ossidazione del centro rame. Una sonda fluorescente il cui spettro di emissione si sovrappone allo spettro di assorbimento del centro rame nello stato ossidato viene attaccata covalentemente alla struttura polipeptidica.

Se il cofattore ` e nello stato ossidato, avviene un fenomeno di trasferimento di energia per risonanza dalla sonda fluorescente verso il centro metallico (FRET). All’opposto, se il cofattore ` e nello stato ridotto non vi ` e alcuna risonanza: in questo caso si osserva un’elevata fluorescenza, mentre nel primo caso, per via del trasferimento di energia, la fluorescenza osservata ` e ridotta. Fluttuazioni nella fluorescenza della sonda sono perci` o interpretate come fluttuazioni dello stato di ossidazione della proteina.

Nei Capitoli 2 e 3 ` e presentato uno studio dei prodotti ottenuti dalla reazione di etichettatura dell’azzurrina con una sonda fluorescente. Legando covalentemente il label fluorescente ATTO 655 all’azzurrina si ottengono una serie di prodotti che possono essere separati per mezzo di cromatografia a scambio ionico. I diversi prodotti infatti differiscono l’uno dall’altro per la posizione della sonda sulla superficie della proteina: questo conferisce loro un diverso comportamento su colonna cromatografica, permettendone cos`ı la separazione. Il processo di separazione e caratterizzazione dei prodotti di reazione ` e descritto nel Capitolo 2. Le tre maggiori specie di addotto azzurrina-ATTO 655 individuate sono: una recante la sonda sulla Lisina 122, molto vicina al centro rame, una recante la sonda sulla Alanina 1, N- terminale della proteina, ed infine una mistura contenente due specie, di cui una etichettata sulla Lisina 128 e l’altra sulla Lisina 24 o 27. Nel Capitolo 3 ` e presentato lo studio della reazione di legame di ATTO 655 all’azzurrina in funzione del pH e viene mostrato come regolando sapientemente tale vari- abile, sia possibile modificare le quantit` a relative dei prodotti di reazione.

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Sulle specie isolate per mezzo di cromatografia son stati effettuati ulteriori studi utilizzando la Spettroscopia di Correlazione di Fluorescenza (Fluores- cence Correlation Spectroscopy, FCS). Queste ricerche hanno evidenziato che ` e possibile osservare una reazione di trasferimento elettronico tra ATTO 655 e ione rame qualora il primo sia legato alla Lisina 122. La velocit` a di tale reazione ` e stata misurata e confrontata con i risultati di calcoli teorici.

E stato cos`ı possibile evidenziare due potenziali meccanismi tramite cui ` un elettrone pu` o essere scambiato tra ATTO 655 e ione rame: il primo ` e il passaggio diretto attraverso Lisina 122 e Metionina 121, mentre il sec- ondo prevede il ripiegamento della sonda sulla superficie della proteina in maniera tale che si metta in contatto diretto con l’Istidina 117, uno dei leganti del rame.

Gli esperimenti presentati nel Capitolo 4 sono volti a studiare una forma dimerica di azzurrina. Due monomeri di questa proteina sono stati legati covalentemente in una conformazione che rende possibile lo scambio di elettroni tra loro. Il dimero ` e stato caratterizzato, strutturalmente, in un precedente lavoro. Le informazioni disponibili sulla sua struttura e sulla reazione intramolecolare di trasferimento di elettroni rendono il dimero adatto come sistema-modello per testare dei metodi di investigazione a singola molecola. Negli esperimenti descritti in questo capitolo, la sonda fluorescente ATTO 655 ` e stata legata ad uno dei monomeri costituenti il dimero. Attraverso l’utilizzo dell’approccio FRET sopra descritto, ` e possi- bile monitorare lo stato di ossidazione dello ione rame pi` u vicino al label.

Tramite esperimenti di FCS ` e stato possibile mostrare che combinando tale tecnica con il metodo FRET (FCS-FRET) ` e possibile studiare la reazione di trasferimento elettronico all’interno del dimero di azzurrina. La velocit` a di reazione misurata ` e di (k

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e l’ampiezza dell’effetto ` e stata caratterizzata in funzione dello stato di ossidazione del costrutto.

L’enzima blu nitrito reduttasi (bNiR) catalizza la riduzione dello ione nitrito a monossido di azoto. Esso contiene due centri rame: uno ` e detto Tipo 1 (T1) e l’altro Tipo 2 (T2). Il primo ` e il sito di ingresso degli elettroni nella proteina, questi vengono poi trasferiti al secondo centro rame (T2).

Il sito T2 ` e il centro a cui si lega il nitrito e dove avviene il processo catalitico. In letteratura vi ` e un continuo dibattito intorno alla domanda, con che ordine avvengono i due eventi sopra descritti: avviene prima il trasferimento di elettroni da T1 a T2 e solo dopo il nitrito si lega al centro rame o viceversa? Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha proposto un ordine casuale (random sequential mechanism, RSM), e ci` o vuol dire che il nitrito pu` o legarsi al T2 sia prima che dopo il trasferimento di un elettrone da T1 a T2. Il meccanismo pu` o essere parzialmente influenzato variando il pH o la concentrazione di substrato.

Nel Capitolo 5 sono esposti i risultati ottenuti tramite esperimenti a singola molecola sull’enzima bNiR, immobilizzato in gel di agarosio. ` E

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Chapter 8. Summary

stato possibile osservare direttamente lo stato di ossidazione del centro T1 durante l’attivit` a di catalisi, ottenendo cos`ı una visione unica del mec- canismo di funzionamento enzimatico. Ci` o ` e stato possibile seguendo il comportamento di bNiR “una molecola alla volta”. L’enzima ` e stato stu- diato per mezzo di Microscopia Confocale a Scansione (Scanning Confocal Microscopy, SCM), combinata con la formazione di immagini di tempo di decadimento della fluorescenza nel campione. L’enzima bNiR (estratto da Alcaligenes xylosoxidans) immobilizzato ` e stato analizzato utilizzando una scansione a piccoli passi. Ad ogni posizione la fluorescenza emessa da ogni singola molecola ` e stata registrata. Attraverso l’utilizzo del tempo di decadimento della fluorescenza emessa viene ricavato lo stato di ossi- dazione del centro rame T1 della molecola esaminata. Inoltre, osservando l’evoluzione temporale dello stato di ossidazione ` e stato possibile ottenere informazioni cinetiche sul comportamento catalitico, sottolineando cos`ı un nuovo aspetto di bNiR: apparentemente l’enzima, durante la catalisi, ` e suddiviso in due popolazioni. La distribuzione di queste popolazioni ` e influenzata dalla concentrazione del substrato e nel capitolo vengono pre- sentati alcuni dettagli cinetici di ciascuna. Tale comportamento pu` o essere spiegato alla luce del meccanismo casuale, RSM, ma la vera novit` a presen- tata qui ` e che ciascheduna molecola di enzima segue una via di catalisi per diversi cicli, mostrando cos`ı un “effetto memoria”.

Nell’ultimo capitolo, Capitolo 6, son presentati ulteriori esperimenti a singola molecola effettuati su bNiR. In particolare, ` e stato studiato il comportamento enzimatico in funzione del pH. Analogamente a quanto de- scritto nel Capitolo 5, l’enzima ` e stato immobilizzato in una matrice di agarosio e l’acquisizione di dati ` e avvenuta tramite SCM. L’approccio qui utilizzato risulta per` o diverso: al posto che formare un immagine dell’intero campione passo-passo, sono state monitorate solo le posizioni in cui era pre- sente l’enzima raccogliendo cos`ı un flusso ininterrotto di dati da ciascuna molecola. In tal maniera ` e stata ottenuta una maggior risoluzione tempo- rale. I dati presentati nel Capitolo 6, pur essendo uno studio preliminare, permettono di discernere il differente comportamento dell’enzima a pH 6.0 e pH 7.5. L’attivit` a dello stesso in funzione di pH e concentrazione di sub- strato ´ e stata (parzialmente) studiata e i risultati supportano lo schema RSM gi` a citato. I dati raccolti potranno poi essere sottoposti ad ulteriori analisi, capaci di rivelare maggiori dettagli sul ciclo enzimatico di bNiR.

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