University of Groningen
Epstein-Barr virus-associated malignancies
Tan, Geok Wee
DOI:
10.33612/diss.173425402
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Tan, G. W. (2021). Epstein-Barr virus-associated malignancies: Susceptibility factors and molecular detection in liquid biopsies. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.173425402
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Authors’ affiliations
Dutch summary
APPENDICES
178 | Appendices
Authors
F.I. Abdul Rahman1 A. van den Berg2 E. Bremer3 A. Diepstra2 E. Drenth4 A.W.J.M. Glaudemans5 S.L. Goh6 E.J. Gore7 H.H. Hasbullah8, 9 F.I. Hassan10 B. Hepkema11 R.N. Jarrett12 P. Jiang2 A.S.B. Khoo1 W.R. Kim1 C.E. Koay13, 14 K. Kok4 K. Kushekhar2 T.C. Kwee15 C.S. Lim6, 16 N.S. Mohd Dali17 T.B. Mohd Mohidin6 F. Montes de Jesus5 R. Mous18 P.G.N.J. Mutsaers19 X.J. Ng1 C.C. Ng6 M. Nijland2 I.M. Nolte20 W. Noordzij5 C.S.H. Ong1 W.J. Plattel2 K.C. Pua21 H. Sawali22 V.M. Sivanesan1, 6 W.B.C. Stevens23 L.P. Tan1, 24 G.W. Tan1, 2 M.M. Terpstra4 R.N. Veenstra2 E.A.M. Verschuuren25 L. Visser2 C.Y. Wong26 Y.Y. Yap27,28
Ap
p
en
d
ic
es
Authors’ affiliations
1Molecular Pathology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research, Kuala Lumpur, Malaysia.
2
Department of Pathology and Medical Biology, University of Groningen, University Medical Center, Groningen, The Netherlands.
3
Department of Hematology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, the Netherlands.
4
Department of Genetics, University of Groningen, University Medical Center Groningen, The Netherlands.
5
Department of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands.
6
Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia. 7
Department of Medical Microbiology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, The Netherlands.
8
Department of Oncology and Radiotherapy, Kuala Lumpur Hospital, Kuala Lumpur, Malaysia. 9
Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, UiTM Selangor, Shah Alam, Selangor, Malaysia. 10
Department of Otorhinolaryngology, Selayang Hospital, Batu Caves, Selangor, Malaysia. 11
Department of Laboratory Medicine, University of Groningen, University Medical Centre Groningen, Groningen, The Netherlands.
12
University of Glasgow Centre for Virus Research, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, United Kingdom. 13
Gleneagles Kuala Lumpur Hospital, Kuala Lumpur, Malaysia. 14
Sunway Medical Centre, Bandar Sunway, Selangor, Malaysia. 15
Department of Radiology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands.
16
Department of Biochemistry, School of Biomedical Sciences, University of Otago, Dunedin, New Zealand.
17
Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research, Kuala Lumpur, Malaysia. 18
Department of Hematology, University Medical Center Utrecht, Utrecht, The Netherlands. 19
Department of Hematology, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands. 20
Department of Epidemiology, University of Groningen, University Medical Centre Groningen, Groningen, The Netherlands.
21
Department of Otorhinolaryngology, Pulau Pinang Hospital, Georgetown, Pulau Pinang, Malaysia. 22
Department of Otorhinolaryngology, Queen Elizabeth Hospital, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia. 23
Department of Hematology, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands. 24
Department of Medical Sciences, School of Healthcare and Medical Sciences, Sunway University, Subang Jaya, Selangor, Malaysia.
25
Department of Pulmonology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands.
26
Department of Otorhinolaryngology, Sarawak General Hospital, Kuching, Sarawak, Malaysia. 27
Department of Otorhinolaryngology, Kuala Lumpur Hospital, Kuala Lumpur, Malaysia. 28
Department of Surgery, Clinical Campus Faculty of Medicine and Health Sciences, University Putra Malaysia. at Kuala Lumpur Hospital, Kuala Lumpur, Malaysia.
180 | Appendices
Nederlandse samenvatting
Het Epstein-Barr virus (EBV) speelt op twee verschillende manieren een belangrijke rol bij EBV-geassocieerde maligniteiten. Ten eerste kunnen EBV-eiwitten transformatie van normale cellen naar kankercellen induceren. Ten tweede kunnen EBV-eiwitten en RNA-moleculen worden gebruikt als biomarkers voor diagnose, het meten van ziekteactiviteit en prognose. In dit proefschrift werden de pathogenetische mechanismen van meerdere EBV-geassocieerde maligniteiten, d.w.z. Hodgkin-lymfoom (HL), post-transplantatie lymfoproliferatieve aandoeningen (PTLD), nasofaryngeaal carcinoom (NPC) en maagcarcinoom (GC) bestudeerd door te focussen op de interactie tussen tumorcellen en reactieve cellen in de micro-omgeving van de tumorcellen. Verder werd ook de klinische waarde getest van verschillende EBV-eiwitten en RNA-moleculen als biomarkers.
In Hoofdstuk 2 bespreken we de huidige kennis over de micro-omgeving van tumorcellen (TME) in drie EBV-geassocieerde maligniteiten, namelijk HL, NPC en GC. HL en GC zijn slechts in een deel van de gevallen geassocieerd met EBV, terwijl NPC bijna in alle gevallen geassocieerd is met EBV. Ondanks de betrokkenheid van EBV als een gemeenschappelijk pathogenetisch kenmerk, vertonen deze drie maligniteiten allemaal een eigen karakteristieke samenstelling van immuuncellen, vaak met veel T-cellen. In de TME van EBV+ HL is de verhouding tussen niet-tumorcellen en tumorcellen vaak groter dan 100:1. Een ander onderscheidend kenmerk van de HL TME is de aanwezigheid van rozetterende T-cellen die voornamelijk bestaan uit T-helper 2 (Th2) en regulatoire T-cellen rond de tumorcellen. CD8+ T-cellen worden vaker aangetroffen in de TME van NPC en EBV+ GC, maar niet alle CD8+ T-cellen in de TME hebben cytotoxische eigenschappen. Het is duidelijk dat T-cellen een belangrijk onderdeel zijn van de TME bij alle drie EBV geassocieerde maligniteiten.
Ondanks de aanwezigheid van T-cellen in de TME, is er geen effectieve antitumor immuunreactie tegen de tumorcellen. Dit suggereert dat tumorcellen een effectief immuun-ontsnappingsmechanisme hebben ontwikkeld. Daarnaast is er bewijs dat componenten in de TME, waaronder T-cellen, fibroblasten en endotheelcellen, ondersteuning bieden aan de overleving van tumorcellen. Momenteel bekende immuun-ontsnappingsmechanismen omvatten onder andere die op het niveau van antigeenpresentatie door humaan leukocyten antigeen (HLA) en modulatie van antigeenafhankelijke activering van T-cellen. Verlies van HLA-expressie is een van de mechanismen waarmee tumorcellen herkenning door T-cellen kunnen vermijden. Er is bekend dat meerdere HLA-allelen geassocieerd zijn met gevoeligheid voor EBV-geassocieerde HL en NPC.
In Hoofdstuk 3 en Hoofdstuk 4 werd het verlies van HLA-expressie door tumorcellen bestudeerd in de context van bekende risico- en beschermende HLA-allelen in cHL en NPC. We wilden onze hypothese testen dat het voor tumorcellen in individuen met een
Ap
p
en
d
ic
es
beschermend HLA-allel belangrijker is om de expressie van HLA te onderdrukken in vergelijking met individuen die deze allelen niet hebben of die dragers zijn van risico HLA-allelen. In hoofdstuk 3, hebben we eerst een meta-analyse uitgevoerd om consistente risico- en beschermende allelen te identificeren in een gecombineerd Nederlands en Schots/ Noord-Engels patiënten cohort om consistente beschermende en risico HLA-allelen te identificeren. Vervolgens hebben we HLA-expressie onderzocht in 338 klassieke HL (classical; cHL) patiënten. Verlies van HLA-klasse I expressie werd waargenomen bij 72% van de cHL-patiënten. Verlies van HLA-expressie werd vaker gevonden bij vrouwen, EBV-negatieve cHL en het nodulaire scleroserende subtype. CHL-patiënten met het beschermende HLA-DRB1*07 allel, hadden vaker verlies van HLA-klasse II expressie dan de HLA-DRB1*07 negatieve patiënten, in overeenstemming met onze hypothese. Evenzo behielden EBV-negatieve DRB1*15/16-risico-alleldragers vaker HLA-klasse I expressie dan niet-dragers. Bij EBV-positieve cHL-patiënten behielden B*37-risico-alleldragers HLA-klasse I expressie vaker dan niet-dragers, in overeenstemming met onze hypothese. Voor de overige HLA-allelen was het verlies van HLA ofwel niet significant verschillend tussen dragers en niet-dragers, ofwel waren de verschillen significant maar in tegengestelde richting. Concluderend, verlies of retentie van HLA-expressie door tumorcellen is geassocieerd met een subset van de beschermende of risicovolle allelen. Deze gegevens suggereren dat HLA-allelen een vroeg effect kunnen hebben op de gevoeligheid om cHL te ontwikkelen en soms later in het proces de mate van selectiedruk bepalen om HLA te verliezen.
In Hoofdstuk 4 werd een vergelijkbare studie uitgevoerd voor NPC. In deze studie hebben we ons specifiek gericht op de unieke Bidayuh-populatie. De Bidayuh-bevolking is een etnische minderheidsgroep in Maleisië met een extreem hoog risico op NPC. Voor zover wij weten, zijn alle grote cohortstudies die de associatie van HLA met NPC rapporteren, uitgevoerd in de Chinese bevolking die in China of andere landen woont. Tot op heden zijn er geen studies over de associatie van HLA in de Bidayuh-populatie. Als eerste hebben we een HLA-typering uitgevoerd om te bepalen of er associaties met HLA in Bidayuhs zijn. Mogelijk vanwege grote verschillen in allelfrequenties in Bidayuh ten opzichte van de Chinese populatie, hebben we geen associatie gevonden van eerder geïdentificeerde risico- of beschermende allelen met NPC in Bidayuh. Integendeel, drie nieuwe HLA-allelen bleken geassocieerd te zijn met NPC in Bidayuh. HLA-A*24:07, een veel voorkomend allel in de Bidayuh-populatie, werd geïdentificeerd als een beschermend allel, terwijl HLA-A*24:02 en HLA-B*15:25 werden geïdentificeerd als risico-allelen. De allelfrequentie van HLA-A*24:02 is lager, terwijl de frequentie van HLA-B*15:25 hoger is in Bidayuh in vergelijking met de Chinese populatie. Deze bevindingen suggereren dat het HLA-type belangrijk is voor de gevoeligheid voor NPC in Bidayuh, maar dat afhankelijke en HLA-onafhankelijke onderliggende mechanismen verschillen van die in andere hoog risico populaties. Als volgende stap hebben we onderzocht of verlies en behoud van HLA-expressie door tumorcellen geassocieerd was met de geïdentificeerde HLA-allelen.
182 | Appendices
Bidayuh NPC-patiënten die het A*24:02-risico-allel droegen, behielden vaker HLA-expressie (100%) in vergelijking met degenen die het risico-allel niet droegen (16,7%). Het aantal beschikbare patiënten voor deze analyses was echter beperkt, dus aanvullende studies zijn nodig om deze bevinding te bevestigen. Er werd geen verschil in de frequentie
van HLA-verlies waargenomen voor de andere twee HLA allelen. EBV-serologie en EBV-DNA testen zijn beide nuttig gebleken als screeningsinstrumenten
voor NPC. Meer recentelijk zijn ook veelbelovende studies over andere biomarkers, zoals plasma-microRNAs, gerapporteerd voor NPC. In Hoofdstuk 5 hebben we de prestaties geëvalueerd van zes gevestigde biomarkers (vier EBV-serologietesten namelijk EA IgA, EA IgG, EBNA-1 IgA, VCA IgA en twee EBV DNA-testen, namelijk BamHI-W 76bp en EBNA1 99bp) en vier nieuw gerapporteerde biomarkers (EBV DNA-test BamHI-W 121bp en plasma EBV-miR-BART7-3p, humane miR-29a-3p en miR-103a-3p). Het doel was om de klinische bruikbaarheid van een enkele of combinaties van meerdere biomarkers te evalueren om NPC te detecteren. Van alle 10 biomarkers had de 76bp BamHI-W test de hoogste gevoeligheid om NPC te detecteren in ons cohort van 232 NPC-gevallen. Zoals verwacht had de 121bp BamHI-W-test een lagere gevoeligheid maar een hogere specificiteit. Geen van de miRNAs presteerde beter dan de op EBV DNA gebaseerde tests. ROC-curves lieten voor alle drie de miRNAs een lagere gevoeligheid zien (AUC van 0,5071 - 0,7737) in vergelijking met de EBV-DNA-testen (AUC van 0,9303 - 0,9832). Combinaties van de gebruikte biomarker testen in verschillende beslissingsboomalgoritmen resulteerde in zeven voorspellende modellen. De BamHI-W 76bp-test bleek als enige een belangrijke component te zijn in alle modellen voor het aantonen van NPC. De EBNA1-DNA-test was de beste prognostische marker voor overleving, en werd opgenomen in alle prognostische beslissingsboommodellen.
In Hoofdstuk 6 werden de niveaus van 27 miRNAs en EBV-DNA in neusspoelingen (nasal washings, NW) geëvalueerd als biomarkers voor de detectie van NPC. Beide EBV-DNA-testen (BamHI-W 76bp en EBNA1 99bp) en zeven van de 27 geteste miRNAs lieten significante verschillen zien tussen NPC-patiënten (n=46) en niet-NPC-patiënten (n=73). Alle negen biomarkers hadden een AUC van meer dan 0,7. Deze biomarkers werden onderworpen aan logistische regressieanalyse om te bepalen of combinaties van twee of meerdere van de biomarkers NPC betrouwbaar konden voorspellen. Het model met EBNA1 en humane miR-21 vertoonde betere prestaties aangaande het detecteren van NPC dan elk van de negen biomarkers alleen. Follow-up testen over een periode van 16 - 162 maanden bij 14 patiënten, waren negatief bij acht patiënten die in remissie waren en positief bij twee patiënten met terugkerende en persisterende NPC. Bij de overige vier patiënten was er een minder goede associatie met ziekteactiviteit.
In Hoofdstuk 7 werd verlies of winst van genomisch materiaal (copy number variations, CNVs) bestudeerd in celvrij plasma DNA (cell free DNA, cfDNA) van HL-patiënten met behulp van ‘low-coverage whole genome sequencing’ (lcWGS). In hetzelfde materiaal
Ap
p
en
d
ic
es
werd tegelijkertijd ook de aanwezigheid van EBV gedetecteerd door gericht sequensen van BamHI-W en LMP1. CNVs werden gedetecteerd in cfDNA verkregen op het moment van diagnose in 59% (26 van de 44) van de cHL patiënten en in geen van de zes nodulair lymfocytenrijke HL patiënten. In lijn met eerdere onderzoeken op cfDNA en DNA van de tumorcellen geïsoleerd uit weefsels, waren de meest voorkomende terugkerende CNVs 2p winst (34%), 9p winst (32%), 12q11-15 winst (23%) en 6q verlies (20%). Gerichte sequentiebepaling van de EBV BamHI-W en LMP1-genregio's in cfDNA had een sensitiviteit van 100% voor het detecteren van EBV voor alle EBV-positieve cHL-patiënten.
In Hoofdstuk 8 werd een vergelijkbare studie uitgevoerd op 18 patiënten met monomorfe PTLD's. Dertien van de 18 patiënten hadden een PTLD die leek op diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL). CNVs werden gedetecteerd in cfDNA van 61% (11 van de 18) van de patiënten. De meest voorkomende CNVs waren winst van 3q26.2-29, 11q14.1-25, 18q21.1-21.33, en verlies van 6q11-21. Er werden meer genomische afwijkingen waargenomen in EBV-negatieve PTLD in vergelijking met EBV-positieve PTLD. Het CNV-profiel in cfDNA van de PTLD-patiënten kwam overeen met eerder gerapporteerde CNVs in weefsel van PTLD-patiënten.
