From cardiogenesis to cardiac regeneration : focus on epicardium-derived cells
Winter, E.M.
Citation
Winter, E. M. (2009, October 15). From cardiogenesis to cardiac regeneration : focus on epicardium-derived cells. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/14054
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/14054
Note: To cite this publication please use the final published version (if
applicable).
Samenvatting
211
|
SamenvattingIn dit proefschrift wordt de potentie van volwassen epicard-afkomstige cellen, de zogenoemde “epicardium-derived cells” of EPDCs, met betrekking tot herstel van schade aan het hart onderzocht. Tevens is gekeken naar het mogelijke positieve effect van een combinatie van EPDCs en voorlopercellen van cardiomyocyten (“cardiomyocyte progenitor cells” of CMPCs), en naar de toepassing van mesenchymale stamcellen (MSCs) als therapie voor het geïnfarceerde hart. Daarnaast worden verschillende applicaties van de MRI (magnetic resonance imaging) voor het onderzoek met stamcellen in muizen belicht.
In Hoofdstuk 1 wordt een algemene introductie op het proefschrift gegeven. Achtereenvolgens worden de embryonale ontwikkeling van het hart, cardiale celtherapie en verschillende methoden die nodig zijn om het effect van celtransplantatie in geïnfarceerde muizenharten te beoordelen, besproken.
Tijdens de embryogenese worden twee aparte hartvormende velden onderscheiden die bijdragen aan het zich ontwikkelende hart. Veelbelovende stam- en progenitorcellen die in het volwassen hart gevonden worden zouden wellicht overblijfselen van deze primitieve structuren kunnen zijn.
De begrippen ‘totipotent’, ‘omnipotent’ en ‘multipotent’ worden toegelicht, en verschillende adulte stamcellen worden geïntroduceerd.
Hoofdstuk 2 bevat een overzicht van de huidige kennis omtrent EPDCs. Het epicard vormt zich vanuit het pro-epicard orgaan, een structuur die zich ontwikkelt in het tweede hart-vormende veld. De cellen die zich via epitheel-mesenchym-transformatie (EMT) afsplitsen van het epicard, de EPDCs, groeien de spierwand in en dragen daarmee op een fysieke en regulatoire manier bij aan een juiste hartontwikkeling. EPDCs differentiëren tot interstitiële fibroblasten, adventitiele fibroblasten en gladde spiercellen van de coronair arteriën. Daarbij reguleren ze het compact worden van het myocard, de aanleg van de Purkinje vezels, de kussens (toekomstige kleppen) en de vaten. Het is onbekend of EPDCs ook in het volwassen hart gegenereerd worden, en of ze in dat geval hun embryonale programma kunnen reactiveren.
In Hoofdstuk 3 wordt de mogelijke therapeutische toepassing van humane volwassen EPDCs voor herstel van het hart na een infarct onderzocht. Injectie van deze humane volwassen EPDCs in het immuun-incompetente muizenhart, waarin door middel van een operatie een kunstmatig infarct gecreëerd was, resulteerde in een verbetering van de hartfunctie. Ejectie fractie was toegenomen 2 weken na operatie en transplantatie, en deze verbetering bleef behouden tot het laatste tijdspunt waarop gemeten werd, te weten 6 weken na infarct (het litteken is dan definitief gevormd). In de groep waarin de EPDCs waren getransplanteerd bleef nadelige vergroting van de eind-diastolische en eind-systolische volumes beperkt, en de overleving in deze groep was significant beter. De EPDCs konden in grote aantallen worden teruggevonden in het infarctgebied van de linker ventrikel, waar ze, met een fibroblast fenotype, parallel aan de omgevende cellen lagen. De functionele verbetering leek verklaard te moeten worden door een paracrien effect van de EPDCs op het omgevende gastheerweefsel, omdat i) er al binnen 2 dagen na transplantatie een effect op de linker ventrikel volumes zichtbaar was, terwijl er binnen dat tijdsbestek nog geen nieuw weefsel gevormd kon zijn, ii) de EPDCs zelf geen nieuwe cardiomyocyten of endotheelcellen vormden, terwijl er iii) een grotere wanddikte was en de vaatdichtheid bestaande uit structuren van muizen origine was toegenomen.
Daarnaast bleek het DNA-schade herstel in de gastheercellen sterk te zijn toegenomen in de harten waar EPDCs waren ingespoten.
212
|
SamenvattingHoofdstuk 4 gaat dieper in op het paracriene effect van de volwassen EPDCs op het geïnfarceerde muizenmyocard, met een functionele en histologische analyse op dag 2, 4 en 7 na transplantatie.
Injectie van humane volwassen EPDCs resulteerde in een behoud van functie, en niet in een herstel na een initieel verlies, waarschijnlijk als gevolg van een paracrien effect dat in de eerste dagen na transplantatie reeds plaatsvond. Littekenontwikkeling in de EPDC groep werd gekarakteriseerd door een vroegere expressie van Wilms’ Tumor 1 (WT1), een eiwit dat normaal aanwezig is in ongedifferentieerde embryonale EPDCs, maar dat ook in het infarctgebied tot expressie blijkt te komen. In de EPDC groep was WT1 al op dag 2 zichtbaar in de kubische muizen-epicardcellen en in cellen verspreid door het infarctgebied, terwijl het in de controle groep pas op dag 4 gedetecteerd kon worden. Deze bevinding suggereerde dat getransplanteerde exogene adulte EPDCs mogelijk ook het proces van nieuwe endogene EPDC vorming vanuit het muizenepicard konden versnellen. Omdat niet bekend is of volwassen epicard in staat is om EPDCs te vormen in geval van een myocardinfarct, werden aanvullende experimenten uitgevoerd. In deze proeven werd het epicard van muizen, met en zonder infarct, gelabeld met een fluorescent virus. De resultaten toonden aan dat er inderdaad na een hartinfarct opnieuw cellen vanuit het natieve epicard de spierwand in migreren.
In Hoofdstuk 5 wordt bestudeerd of co-transplantatie van humane volwassen ‘instructieve’ EPDCs en ‘constructieve’ CMPCs de hartfunctie van een geïnfarceerd hart extra kan verbeteren als gevolg van een synergistisch effect van deze twee celpopulaties. In vitro experimenten toonden aan dat EPDCs en CMPCs een wederzijdse invloed op elkaar hadden met betrekking tot proliferatie, migratie en productie van verscheidene groeifactoren. Injectie van EPDCs en CMPCs samen in het immuun-incompetente muizenhart resulteerde inderdaad in een verdere verbetering van de linker ventrikel functie 6 weken na het infarct, vergeleken met groepen waarin één van beide celtypes was getransplanteerd. Deze laatste groepen, waarin EPDCs óf CMPCs waren ingespoten, toonden zelf ook al een significant betere hartfunctie dan de controle groepen waar slechts het kweekmedium was ingespoten. In tegenstelling tot de hypothese kon het getoonde synergistische effect van de EPDCs en CMPCs niet verklaard worden door een combinatie van ondersteuning van het gastheerweefsel en vorming van nieuwe humane cardiomyocyten, maar enkel door een paracrien effect van de getransplanteerde cellen op het omgevende weefsel. De ingespoten humane cellen die waren geïntegreerd in het gastheerweefsel differentieerden niet tot cardiomyocyten of endotheelcellen, terwijl wanddikte en vaatdichtheid (muizen origine) significant waren toegenomen in de co- transplantatie groep. Gezien het feit dat het totaal aantal getransplanteerde cellen evenals het volume van het aantal geïntegreerde cellen gelijk was tussen de groepen, kon verondersteld worden dat de EPDCs en CMPCs via verschillende complementaire paracriene mechanismes werkten.
Hoofdstuk 6 beschrijft onderzoek naar de therapeutische toepassing van MSCs geïsoleerd uit het beenmerg van patiënten met ischemisch hartlijden. Transplantatie van deze MSCs in het immuun- incompetente muizenhart onmiddellijk nadat daarin een infarct was gecreëerd resulteerde, in vergelijking met de controle groep, in een significant grotere ejectie fractie 14 dagen na operatie.
Naast deze functionele verbetering was er een toegenomen vaatdichtheid (muizen oorsprong) zichtbaar in het geïnfarceerde gebied en een verminderde verdunning van de ischemische linker ventrikel wand. De geïntegreerde MSCs brachten geen strikte gladde spiercel of cardiomyocyt markers tot expressie, wat impliceert dat het positieve effect van de MSCs niet verklaard kon worden uit vorming van nieuwe humane cardiomyocyten.
Hoofdstuk 7 vergelijkt twee verschillende methodes die toegepast kunnen worden om de functie van het muizenhart in geval van een hartinfarct te meten, te weten de MRI en druk-volume katheter.
Met beide technieken konden functionele verschillen tussen harten met en zonder infarct duidelijk worden waargenomen, maar linker ventrikel volumes en ejectie fractie waren systematisch kleiner
213
|
Samenvattingin geval van de druk-volume katether metingen. Sensitiviteit en specificiteit waren hoog voor beide methodes, met superieure uitkomsten voor de MRI. Zowel de MRI als de druk-volume katheter bleken geschikt voor functionele metingen in het falende muizenhart. De MRI wordt aangeraden in geval van longitudinale studies en wanneer gedetailleerde anatomische informatie nodig is, de druk-volume katheter zal gekozen moeten worden wanneer uitgebreide analyse van de linker ventrikel functie vereist is.
In Hoofdstuk 8 wordt onderzocht of het labelen van te transplanteren cellen met ijzer een
mogelijkheid biedt deze cellen in vivo te volgen met behulp van MRI. Dode en levende ijzer-gelabelde EPDCs werden geïnjecteerd in het geïnfarceerde hart van immuun-deficiënte muizen waarna de muizenharten gescand werden met een 9.4T MRI tot 6 weken na operatie. In ieder hart konden ijzerhoudende cellen worden waargenomen als zwarte uitsparingen in de linker ventrikel wand. De donkere plekken veranderden in beiden groepen niet over de tijd qua grootte, lokalisatie of aantal.
Histologisch onderzoek toonde aan dat er in de overeenkomstige gebieden intacte cellen lagen waarin ijzerpartikels aanwezig waren. In de groep waar dode EPDCs waren ingespoten bestond de populatie van ijzer-positieve cellen uitsluitend uit macrofagen, terwijl er in de groep die levende EPDCs had ontvangen naast macrofagen ook EPDCs geladen met ijzer in de hartwand te vinden waren. Dientengevolge kon geconcludeerd worden dat de MRI geen onderscheid kon maken tussen gezonde, geïntegreerde ijzerhoudende cellen en macrofagen die dode ijzer-bevattende cellen hadden gefagocyteerd. De methode is daarom niet geschikt voor het in vivo volgen van levende cellen in de tijd, maar kan worden toegepast om vast te stellen of de transplantatie succesvol is geweest, om de plaats van injectie te bepalen, en om deze te volgen in de tijd.
Hoofdstuk 9 bediscussieert de data die in dit proefschrift gepresenteerd worden. Met de ontwikkeling van het hart als uitgangspunt wordt de applicatie van verscheidene mesoderm-afkomstige volwassen cellen besproken in het licht van hartreparatie na een infarct. Ook wordt de toepasbaarheid van verschillende methodes voor functionele analyse van het geïnfarceerde muizenhart behandeld.
