Week 3: Chromosomale afwijkingen en kanker
Hoorcollege 1: Translocatie t(9;22) bij patiënten met chronische myeloïde leukemie
Patiënten met chronische myeloïde leukemie hebben vaak geen klachten. Ze hebben verhoogde leukocyten in het bloed en vaak een vergrote milt. Ook de trombocyten zijn verhoogd en in het bloed zijn microscopische veel onrijpe cellen te zien (meer dan 1%
onrijpe cellen duidt op leukemie).
Leukemie is een klonale afwijking: één afwijking en een cel kan het systeem al
overnemen. Als er DNA schade is kan dat hesteld worden, of de cel gaat in apoptose. In een uitzonderingsgeval deelt de cel zich toch en ontstaat er een mutatie en kanker.
Chromosomale DNA-schade is waarneembaar onder de microscoop.
Philadelphia chromosoom
Bij CML speelt bij de meeste mensen (95%) het philadelpia chromosoom (chromosoom 22) een grote rol. Deze ontstaat door een translocatie tussen chromosoom 9 en 22.
Chromosoom 9 bevat het gen ABL en chromosoom 22 bevat het gen BCR. Bij de translocatie zijn deze twee genen gebroken tussen twee exons. Op het philadelphia chromosoom worden de genen gefuseerd tot BCR-ABL, waardoor het fusie eiwit p210 BCR-ABL ontstaat. Het BCR-ABL fusie-eiwit zorgt voor fosforylering van een bepaald substraat dat de proliferatie van de cel op gang brengt, waarbij ATP in de ‘pocket’
terechtkomt en daar zijn fosfaatgroepen levert. Door moleculair onderzoek bleek imatinib in dezelfde ‘pocket’ te kunnen, waardoor de werking van BCR-ABL versperd wordt.
BCR-ABL blijkt echter nog verder te kunnen muteren, zodat imatinib zijn werking verliest.
AML
De behandeling van CML bestaat uit a-interferon, beenmergtransplantaties en imatinib.
De behandeling kan echter niet altijd voorkomen dat de ziekte overgaat in een acceleratie fase en een blastenfase (acute fase): AML. AML is bij elke patiënt anders (variatie in ziektebeeld). Dat komt door verschillen in de achterliggende cytogenetica.
Afwijkingen met een goede prognose:
- inv(16): CBP-MYH fusie-eiwit
- t(15;17): PML-RAR fusie-eiwit, RAR blijkt vitamine A receptor. Toediening van vitamine A bracht de sterftekans van 100% terug naar 10-20%.
- t(8;21): AML-1-ETO fusie-eiwit (ETO is actief bij de embryogenese)
Een tweede groep afwijkingen is ‘standaard’: deze zijn onbekende afwijkingen in de cytogenetica en vormen de grootste groep. De derde groep heeft een zeer slechte prognose, zoals veel monosomieën (monosomie(17)).
Www.JoHo.nl
1
Hoorcollege 2: Het ontstaan van chromosomale afwijkingen
Een chromosoom bestaat uit DNA, histonen en andere eiwitten. Het DNA bestaat voor 5% uit genen: andere belangrijke onderdelen zijn het centromeer en de telomeren.
Celcyclus
De celcyclus bestaat uit de volgende fasen:
- G1: celgroei
- S: verdubbeling van het DNA - G2: klaarmaken voor mitose
- M: uitverdeling van de chromosomen over de dochtercellen
De mitose is weer onderverdeeld in 6 fasen:
- Profase: oprollen van DNA tot chromosomen (condensatie).
- Prometafase: kern kapot, de chromosomen worden aan de spoeldraden gekoppeld.
- Metafase: chromosomen gaan naar het midden van de cel.
- Anafase: het uit elkaar trekken van de chromosomen. De centromeren zijn door spoeldraden (tubulinedraden) gekoppeld aan de centrosomen (organellen die de spoeldraden produceren). De bindingsplaats van een tubulinedraad aan een centromeer heet de kinetochoor. Deze centrosomen worden verdubbeld in de S- fase.
- Telofase: decondensatie van de chromosomen.
- Cytokinese: fysieke splitsing van de dochtercellen.
Chromosomen zijn alleen te zien tijdens de mitose:
- Alle chromosomen aankleuren (bv R bandering) - Fluoriscente in situ hybridisatie (FISH)
- Chromosoom speciefieke probes (FISH) - Spectrale karyotypering (SKY)
In het karyogram zijn verschillende afwijkingen op te merken:
- Structurele afwijkingen: deleties, translocaties, dicentrische chromosomen (met twee centromeren, waardoor 50% van de delingen fout gaat, doordat de tubuline draden het chromosoom uit elkaar proberen te trekken). Deze afwijkingen komen meestal door een breuk in het chromosoom. Als deze plaatsvindt in de G1-fase, wordt de breuk ook verdubbeld. Wanneer de breuk plaatsvindt in de G2-fase, is deze slechts in één chromatide te vinden. In de S-fase is het de vraag of de breuk gekopiëerd wordt of niet.
- Numerieke afwijkingen: Chromosoomverlies of chromosoom duplicatie. Dit kan komen door een fout in de metafase: wanneer één der verbindingen niet goed is:
non-disjunctie. Zo krijgt de ene dochtercel 1 chromosoom en de andere 3.
- Amplificatie (FISH met c-myc probe): het kan zijn dat er vele kopieën zijn van een gen. Daaruit ontstaan minichromosomen. Dit gebeurt als er meerdere keren wordt begonnen met de replicatie van een bepaald gen.
- Polyploïdie: geen mitose à tetraploïde cellen, geen cytokinese à meerkernige cellen.
Cellen kunnen maar een beperkt aantal keren delen door de verkorting van de
telomeren bij elke deling. Telomerase is een enzym dat in sommige cellen de telomeren weer aanbouwt. De telomeer kan worden herkend als breuk. Om dat te voorkomen kan de overhanging strand een loop maken en ergens eerder in de telomeer weer gaan
paren: T-loop. Hierdoor s er geen uiteinde meer die kan worden gezien als breuk.
Speciale eiwitten (zoals TRF1 en 2) houden die loop bij elkaar. Als de telomeer dan echter tekort wordt, wordt deze loop weer losgemaakt en weer herkend als breuk. Op gegeven moment moet er dan gestopt worden met delen (p-53 eiwit: de Hayflick limit). In een tumor kan het toch doorgaan, zodat er chromosomale instabiliteit ontstaat. In 85- 90% van de gevallen ontstaat een tumor ook door telomerase activering. De overige tumoren gebruiken een nog onbekend mechanisme om de telomeren op lengte te
houden. Telomeraseremmers kunnen dus effectief zijn, maar niet altijd. Bovendien speelt bij kanker resistentie een grote rol.
Hoorcollege 3: Beenmerginsufficientie door stamceluitputting (aplastische anemie)
Casus
- Man, 20 jaar
- 3 maanden vermoeid bij inspanning
- sinds 1 week twee bloedingen in het bovenbeen
Bij lichamelijk onderzoek blijkt hij een bleke huid en slijmvliezen te hebben en meerdere subcutane bloedingen/petechiën: in het lab blijken Hb, leuko’s en thrombo’s verlaagd.
DD:
- Deficiëntie: foliumzuur om vitamine B12, vitaminetekort bepalen door te kijken naar grootte rode bloedcellen, deze zullen groot zijn door verstoorde deling.
- Leukemie: acute lymfatische of myeloide leukemie ( verhoging witte bloedcellen) of pre-leukemie (myelo-dysplastisch syndroom)
- Aplastische anemie Verder labonderzoek:
- MCV normaal (verhoogd bij deficiëntie van foliumzuur of vitamine B12) - Blasten normaal (0%) (verhoging duidt op leukemie)
- Bepaling vitamine B12 en foliumzuur (voor als er tegelijk ook ijzergebrek is) - Beenmergbioptie toont meer vetcellen en minder bloedproducerende cellen
(normaal is ongeveer 75% vetcel)
- Bloedingneiging als bloedplaatjes < 10 zijn Aplastische anemie
Aplastische anemie is een stamcelziekte (alle onrijpe cellen zijn aangedaan) die zeer zeldzaam is (1/100.000) en gepaard gaat met toenemende pancytopenie (anemie, thrombocytopenie, leukopenie). Deze ziekte kan tenslotte ook leiden tot myelodysplasie of AML.
De ziekte kan zowel aangeboren als verworven zijn: de verworven variant kan komen door stamcelbeschadigende stoffen (straling, medicatie, chemische stoffen); infectie (virus hepatitis); of als auto-immuunziekte tegen hematopoietische stamcellen (50%).
De erfelijke variant kan komen door twee syndromen: het fanconi syndroom of dyskeratosis congenita. Het fanconi syndroom is autosomaal recessief en geeft vaak huid- of skeletafwijkingen. Dyskeratosis congenita kan op drie manieren overgeërfd worden: X-gebonden recessief, autosomaal dominant en autosomaal recessief. Het is eigenlijk een mutatie in het RNA compartiment van telomerase. Dyskeratosis congenita geeft vaak huidpigmentatie en nageldystrofie.
Www.JoHo.nl
3
Telomerase: aan het uiteinde van chromosomen bevinden zich telomeren. Bij elke celdeling neemt de lengte van die telomeren af, zodat het tenslotte te gevaarlijk wordt om te delen, omdat er dan ook een stuk bruikbaar DNA kan worden afgebroken: de telomeer is dan te kort en de cel is aan het eind van zijn latijn. Telomerase is een enzym dat dit proces kan tegenhouden. De telomeren van chromosomen hebben een repetitief uiteinde (TAAGGG) met een single-strand overhang aan het 3’-uiteinde. Door de
herkenbare code aan het einde kan telomerase daar binden en groepen van zes
basenparen aan het 3’-uiteinde binden. Het 5’-uiteinde wordt op de gebruikelijke manier aangevuld (met behulp van een primer). Er blijft altijd een stuk van het 3’-uiteinde over, zodat telomerase kan blijven werken.
Als telomerase dus niet meer werkt krijgen de nieuwe cellen steeds kortere telomeren en tenslotte kunnen ze niet meer delen. Dat gebeurt het eerst in het beenmerg (hoge delingsfrequentie), maar is ook te merken aan de huid (een verharde hoornlaag) en aan het sperma. Dit heeft ook tot gevolg dat het steeds op jongere leeftijd optreedt: de telomeren worden per generatie steeds korter, zodat tenslotte de klachten al op zeer jonge leeftijd beginnen. De behandeling hiervoor is een beenmergtransplantatie.
Hoorcollege 4: Chromosomale afwijkingen in leukemie en hun belang voor therapie
Een karyogram wordt gemaakt van een delende cel. Men kweekt cellen met behulp van groeifactoren en stopt het proces net voor de mitose.
Bij chronische leukemie is de deling van cellen toegenomen of apoptose afgenomen en er vindt normale uitrijping plaats. Door extra oncogenen kan dat overgaan in acute leukemie, waarbij de uitrijping ontbreekt.
Klinische verschijnselen
- Ten gevolge van de verdringing van de normale bloedaanmaak in het beenmerg:
anemie (bleek, tachycardie); leukocytopenie (verminderde afweer); trombocytopenie (bloedingen).
- Ten gevolge van de toename van leukocyten in het bloed: leukostase (bij meer dan 100x106, ook wel: hyperleukocystose). Hierdoor raken capilairen verstopt met tot gevolg: hoofdpijn; concentratiestoornissen; dyspnoe; desoriëntatie; tachypnoe;
bloedingen in de retina; interstitiële tekening op de X-thorax. Dit kan binnen 24 uur fataal zijn.
- Ten gevolge van extramedullaire lokalisatie van leukemie: tandsvleeshyperplasie;
hepatomegalie; soms klierzwelling ( bij ALL); neurologische verschijnselen.
Bij een beenmergpunctie zijn bij leukemie altijd de blasten verhoogd. Met een
peroxidasekleuring kan onderscheid gemaakt worden tussen lymfatische of myeloïde leukemie door zwartkleuring van de granulae. Granulocyten gebruiken peroxidase om bacteriën te doden.
De definitie van AML:
- Meer dan 20% blasten in het beenmerg.
- Peroxidasekleuring is positief (heel soms is immunofenotypering noodzakelijk als de cel nog niet ontwikkeld is, zodat er nog geen granulae aankleuren: 1-2%).
Classificatie van de ziekte gebeurt volgens morfologie, immunofenotypering,
chromosoom onderzoek (metafase arrest), moleculair onderzoek (PCR analyse naar fusie-gen van specifieke translocatie en mutatie analyse) en voorgeschiedenis.
AML kan veroorzaakt worden door vele chromosomale afwijkingen: translocaties, dysplasie, chemotherapie-gerelateerd en andere (bv erytroïd, basofiel, etc). De groep
‘andere’ type is het grootst.
Zoals in eerdere colleges zijn er verschillende genetische risicogroepen voor een slechte prognose. De goedrisicogroep, de intermediair (standaard: behandeling niet duidelijk, wel veruit de grootste groep) en slechtrisico. De laatste kan komen door genetische afwijkingen als monosomie (verlies geheel chromosoom, geldt niet voor
geslachtschromosomen), terminale deleties, meerdere chromosomale afwijkingen, translocatie met Evi-1 gen.
Leukemie neemt toe met de leeftijd maar bepaalde vormen (bv. T(8;22)) komen op elke leeftijd even veel voor.
De behandeling bestaat uit twee maal een week chemotherapie (bv. 7+3, cytarabine + anthracycline) en beenmergtransplantatie (niet bij goedrisicogroep, dan een derde week chemotherapie). Bij chemo wordt voor enkele weken de bloedcelproductie gestopt.
Hierdoor kan ernstige mucositis ontstaan en men is zeer vatbaar voor infecties (dus krijgt antibiotica), 4-6 weken opname in beschermende isolatiekamer. Vaak is er ook tijdelijk voeding via infuus door ontsteking rond de mond.
Hoorcollege 5: De Celcyclus en gevolgen van foutieve celcyclusregulatie in kanker
De celcyclus bestaat in principe uit vier fasen:
- G1: Fysieke groei
- S: Duplicatie der chromosomen - G2: Voorbereiding op de celdeling - M: Celdeling
Verschillende genen zijn van belang voor de celcyclusregulatie:
- Cyclines zijn stoffen die kunnen binden aan cycline afhankelijke kinases (CDK’s).
Cycline D is nodig voor deling: het zet aan tot goei. Cycline E is nodig voor de overgang van de G1 fase naar de S fase. Cycline A vormt een doorgang binnen de S fase. Deze stoffen zijn er dus alleen in specifieke fases van de celcyclus.
- Cycline afhankelijke kinases (CDK’s) zijn de stoffen waaraan de cyclines binden als deze in aantal toenemen. Pas dan kunnen de CDK’s actief worden. Cycline D bindt aan CDK 4, cycline E en A binden aan CDK 2.
- Cycline afhankelijke kinase remmers (CKI’s) hebben een tegengestelde werking.
p16ink4a remt het CDK4/cycline D complex en p21 remt het CDK2/cycline E complex.
Checkpoints
- Restrictiepunt: Voordat een cel deelt, ontvangt het daarvoor eerst een signaal, een groeifactor. Deze bindt aan een receptor op het membraan, dat in verscheidene stappen een signaal kan doorgeven aan de kern: cycline D neemt nu toe, zodat er een CDK4/cycline D complex wordt gevormd, waardoor CDK4 actief is. Dit
fosforyleert RB, dat normaliter E2F bindt, een transcriptiefactor die nodig is voor genen tijdens de S fase. E2F verhoogt ook cycline E en p16. P16 is weer een
Www.JoHo.nl
5
remmer van het CDK4/cycline D complex. RB is aangedaan bij retinoblastoom, waardoor E2F hoe dan ook aanzet tot deling.
- G1/S checkpoint: TP53 is een stof die in de cel snel wordt afgebroken. Bij DNA schade gaat dit echter minder snel, zodat er door TP53 meer expressie komt van p21: dit remt het CDK2/cycline E complex, zodat de cel stopt. Bij een TP53-mutatie zou dit dus niet gebeuren en ontstaat er genetische instabiliteit.
- IntraS checkpoint: DNA schade in de cel zorgt voor activatie van ATM, dat CHK2 activeert, dat op zijn beurt CDK2/cycline A inactiveert, zodat de cel stopt. Ataxia telangiectasia is een ziekte die gepaard gaat met progressiee ataxia,
kankerpredispositie en overgevoeligheid voor röntgen. Bij deze patiënten is ATM gemuteerd, waardoor er genetische instabiliteit komt.
Radio resistente DNA synthese (RDS) is een test om de gevoeligheid van röntgen te bepalen. Aan de cel wordt 3H-thymidine toegevoegd en vervolgens bestraald met röntgen. Normaliter vindt er na de bestraling weinig inbouw plaats van 3H-thymidine, vanwege de beschermingsmechanismen (intraS checkpoint), maar bij AT patiënten wordt er wel gewoon 3H-thymidine ingebouwd. Bij het Nijmegen breuksyndroom is het eiwit dat gebroken DNA-strengen bindt niet werkzaam en wordt het ATM niet geactiveerd, NBS zorgt zo voor hetzelfde fenotype als AT.
- G2/M checkpoint: Dit checkpoint controleert of er sprake is van DNA schade en of de replicatie volledigverlopen is.
- Anafase checkpoint: Tijdens de anafase is het DNA gecondenseerd tot
chromosomen. Aan de kinetochore van het centromeer binden de microtubuli. Soms kan er echter een spoeldraad losschieten: mitotische ‘spindle’. Het anafase
checkpoint (met behulp van BUB-1) controleert de spanning op de microtubuli om dat te voorkomen. Als dit mechanisme niet werkt, ontstaat er aneuploïdie: een onjuist aantal chromosomen in de cel.
Hoorcollege 6: DNA schade reparatie en anti-kanker therapie Anti-kanker therapie: BEP (bleomycin, etoposide en cisplatin)
B: DNA dubbelstrengs breukenà ijzer ionen dicht bij DNA, zuurstof bij ijzerà zuurstofardicalenà oxidatieve schadeà dubbestrengsbreuk
E: DNA dubbelstrengs breukenà( nettere manier), remmer van enzym van
topoisomerase (essentiele enzymen voor celgroei), zijn belangrijke targets voor anti- kanker middelen. Topoisomerase zorgt ervoor dat teveel opgewonden DNA uit elkaar kan worden gehaald door de winding door te knippen en weer vast te maken zodat windingen verdwijnen en je een recht DNA krijgt.
P: interstrand crosslinks
Waarom B en E beide? à deze zorgen toch beide voor dubbelstrengs breuken?
- Niet elke breuk is hetzelfde
- Resistentie tegen ene agents wil niet zeggen resistentie tegen andere agents.
VIP (etoposide, ifosfamide en cisplatine) V: DNA dubbelstrengs breuken
I: Alkylerende adducten P: interstand crosslinks
1. Base excisie reparatie (BER) (deel 1) = herstel van oxidatieve DNA schade en enkelstrengsbreuken.
- BER begint met een DNA glycosylase (bv. OGG1 catalyseert de hydrolyse van de N-glycosyl verbinding tussen deoxyribose en 8-oxoguanine).
BER voelt of base goed zijn, het draait de foute verbinding naar buiten waardoor een a-basische plaats ontstaat, een AP endonuclease kan op die plek een breuk maken. Er kunnen nu twee dingen gebeuren:
• Long patch: stukje DNA opnieuw gesynthetiseerd
• Short patch: dRP lyase zorgt ervoor dat hele nucleotide ontbreekt.
Keuze hangt af van differentiatie staat, in G1 kan bijvoorbeeld geen long patch plaatsvinden want dan zijn er niet veel polymerases actief.
2. Base excisie reparatie (deel 2)
Zodra er een enkelstrengsbreuk is gaat er een enzym zitten (PARP1), dit enzym bindt aan enkelstrengsbreuken en zorgt vervolgens voor postranslationele modificatie eiwitten met poly ADP ribose de functie hiervan is niet goed bekend.
PARP1 maakt reparatie van enkelstrengs breuken meer efficiënt. Efficiëntie is belangrijk omdat wanneer een replicatievork naar een enkelstrengsbreuk gaat er een dubbelstrengsbreuk ontstaat. Deze kan worden opgelost met niet homologe DNA verbinding of homologe recombinatie. De eerste kan niet omdat er maar één uiteinde is, er is niks om er tegenover te zetten. Homologe recombinatie kan dat wel door identieke strengen uit te wisselen.
Homologe recombinatie is essentieel voor reparatie van DNA replicatie geassocieerde dubbelstrengs breuken.
3. Tumoren in BRCA mutatie dragers (defect HR)à borstkanker
Erfelijke vorm van borstkanker: 5-10% van de geconstateerde gevallen geassocieerd met BRCA mutatie.
Mutatie dragers in BRCA1 of BRCA2 hebben een verhoogde kans op het ontwikkelen van kanker (borst ovarium en prostaatkanker)
Inactivatie van het gezonde allel in tumorcellen komt voornamelijk door LOH.
Het fenoytype van BRCA1 en BRCA2 mutatiedragers erft autosomaal dominant over.
Synthetische letalititeit: het kan zijn dat een mutatie in Gen A levensvatbaar is evenals een mutatie in Gen B levensvatbaar is, maar dat de combinatie van mutaties in Gen A en B niet levensvatbaar is. Synthetische lethaliteit treedt op wanneer een combinatie van mutaties in twee genen leidt tot cel dood, terwijl en mutatie in alleen een van die genen gewoon levensvatbaar is.
- A en B zijn redundant binnen een bepaald essentieel proces.
- A en B zijn essentieel in twee redundante processen.
Organismen hebben een buffer om te zorgen voor fenotypische stabiliteit ondanks genetisch varieteit, veranderingen in omgeving en mutaties.
Als BRCA1 en BRCA2 niet meer helpen bij het repareren van dubbelstrengsbreuken door homologe recombinatie, bijvoorbeeld bij een mutatie die leidt tot borstkanker, zorgt het remmen van PARP1 voor de dood van de cel. Door het remmen van PARP1 ontstaan meer dubbelstrengsbreuken als gevolg van enkelstrengsbreuken. Op deze manier kunnen specifiek tumorcellen gedood worden. In andere kankercellen zijn BRCA1 en 2 niet deficiënt, maar kunnen ze wel deficiënt gemaakt worden met hyperthermietherapie. Het BRCA2 eiwit valt namelijk uit elkaar boven een bepaalde temperatuur. Zo kunnen PARP1-remmers worden toegediend en kan kanker op dezelfde manier worden bestreden.
Www.JoHo.nl
7
Hoorcollege 7: Samenhang tussen RB en p53 in moleculaire circuits
Een retinoblastoom (tumor in het oog) komt alleen voor bij jonge kinderen en ontstaat uit retinoblasten (deze zijn rond het vijfde levensjaar uitgedifferentiëerd en kunnen daarna dus geen kanker meer veroorzaken). Retinoblasten zijn voorlopercellen van het netvlies.
Van de kinderen met retinoblastoom heeft 40% een erfelijke oorzaak: de rest (60%) heeft een sporadische oorzaak.
De ziekte wordt veroorzaakt door twee hits (twee-hit-hypothese): de uitschakeling van beide allelen van het tumorsuppressor-gen RB. Het verlies van één der beide allelen heeft geen effect. Bij de erfelijke vorm is één van beide dus al uitgeschakeld en vindt het retinoblastoom dus gemiddeld eerder plaats. Twee mutaties zijn voldoende voor het het ontwikkelen van een retinoblastoom. Erfelijke vorm: een mutatie in de kiembaan, een andere verkregen tijdens het leven. Sporadische vormen: beide nieuwe mutaties ontstaan in de retinoblast. De kans op een retinoblastoom is zonder erfelijke predispositie dus veel kleiner.
Mutaties in het RB gen zijn grote deleties (deel gen of chromosoom weg), verkort RB- eiwit (nonsense, frameshift, splice site mutaties) of inactivatie van de promotor
(methylering). Allen hebben tot gevolg dat er geen functioneel RB-eiwit wordt gevormd.
Het restrictiepunt wordt door RB gereguleerd: het bindt en inactiveert transcriptiefactor E2F (die S fase genen kan laten repliceren). Hierdoor vindt die replicatie dus niet plaats.
Mitogene signalen activeren RAS, dat CDK4/cycline D activeert. CDK4,6/cycline D (of CDK2/cycline E) kunnen RB fosforyleren, zodat het niet meer aan E2F bindt à inactivering (replicatie kan doorgaan). E2F activeert productie van cycline A/E
(proliferatie) , DNA synthese genen, pARF en p16 (is cycline afhankelijke kinase remmer en remt CDK4/cycline D).
Oncogenen:
- Normale functie: stimuleren celproliferatie/celgroei - Mutaties leiden tot constitutieve activering
- Gewoonlijk dominant: mutatie in 1 allel Tumorsuppressorgenen:
- Normale functie: remmen van celproliferatie - Mutaties leiden tot inactief of afwezig eiwit
- Voor de cel zijn mutaties recessief: meestal mutaties in beide allelen nodig
Mensen met een erfelijke predispositie op retinoblastoom krijgen in 90% van de gevallen daadwerkelijk een retinoblastoom à oog. Andere aandoeningen (osteosarcomen
(10%)à bot en soft tissue carcinomen (5%)à weke delen) hebben meerdere hits nodig en worden dus pas later gevormd (met name in de pubertijd). Ook hebben deze
patiënten een verhoogde kans op longkanker.
Erfelijke vormen van kanker worden voornamelijk veroorzaakt door tumorsuppressorgenen (waarbij de ene allel dus al is aangedaan).
Voorbeelden zijn:
- Retinoblastoom (RB)
- Li-Fraumeni syndroom (TP53)
- Melanoom (p16)
- Neurofibromatose I en II (NF1, NF2) - Borst- en ovariumkanker (BRCA1, BRCA2) - Multipele endocriene neoplasie (MEN1, RET) - Basaal cel carcinoom (PTCH)
- Familiaire adenomateuze poliposis (APC) - HNPCC (MSH)
Hoorcollege 8: Ontregeling apoptose in kankercellen
Apoptose is een belangrijk fenomeen in de ontwikkeling van Caenorhabditis elegans, maar ook bij de afbraak van de vliezen tussen vingers en tenen bij zoogdieren.
Apoptose is zelfgeprogammeerde celdood met voordelen boven necrose. Het laatste leidt namelijk tot een ontstekingsreactie doordat de cel openbarst. Bij apoptose krimpt de cel; wordt het cytoplasma eosinofiel; wordt de stabiliteit van het celmembraan minder en wordt het celcontact minder; het chromatine condenseert; er ontstaan apoptotische lichamen; de cel wordt gefagocyteerd (zodat er geen immuunrespons ontstaat). Dit speelt een belangrijke in de embryogenese; fysiologische involutie
(baarmoederslijmvlies); afstoten van epitheelcellen (darm, huid); verwijdering van auto- reactieve T-cellen; celdood in tumoren; celdood na DNA-schade of cellulaire stress.
Apoptose wordt aangezet door een signaal: intrinsiek (door stress of differentiatie) en extrensiek (TNF, FASL). Vervolgens vindt er controle en integratie plaats via de receptor (TNK, FASL) en via de mitochondriale permeabiliteit (Bcl2 familie). Dan vinden er caspases plaats (afbraak van cellulaire eiwitten) die elkaar aanzetten en DNA afbraak (enconucleases knippen DNA tussen de nucleosomen). Daarna worden dode
cellen/celfragmenten afgevoerd door fagocytose.
Bcl2
Bcl2 remt de apoptose (Bcl2 komt veelvuldig voor bij het folliculair syndroom). Bax induceert apoptose juist. De relatieve concetraties van deze beide stoffen bepalen of de cel doodgaat. Ze doen hun werk aan het mitochondriale membraan, waarbij Bax de vrijgifte van cytochroom c kan bevorderen door poriën in het mitochondrium, zodat er inductie van caspases plaatsvindt. Bcl2 remt Bax en kan ook de caspase remmen.
P53
TP53 is een tumorsuppressoreiwit en is gemuteerd bij 50% van de tumoren (waarbij 75% is veroorzaakt door een missensemutatie). TP53 is een transcriptiefactor die als tetrameer aan het DNA bindt en daar productie van verschillende stoffen stimuleert:
- p21: remming van de celcyclus - Bax: apoptose
- MDM2: feedbackregulator van p53 - GADD45: DNA herstel
TP53 bestaat uit 3 domeinen: het N-terminale domein is transcriptieactiverend. Verder is er het DNA-bindend domein en het oligomerisatie domein (om een tetrameer te vormen volgen) aan de C-terminus. MDM2 bindt aan het N-terminale domein, waardoor de transcriptie weer geremd wordt. Verder activeert MDM2 ubiquitines aan het
oligomerisatiedomein, waardoor het eiwit wordt vernietigd.
TP53 wordt geactiveerd door fosforylering veroorzaakt door stress-situaties, zoals oncogenen, straling, telomeerverlies, hypoxie, etc. Na fosforylatie vindt er geen afbraak
Www.JoHo.nl
9
meer plaats door MDM2, doordat de fosfaatgroep de plek van MDM2 aan het N- terminale domein overneemt.
P300 bindt de N-terminus en bevordert daarmee oligomerisatie. Verder zorgt het voor acetylering van de histonen, waardoor de DNA structuur opener wordt. Hierdoor kan transcriptie plaatsvinden.
Mutaties van TP53 vinden vooral plaats in het DNA-bindend domein. Vormen van dergelijke inactivatie van TP53 zijn:
- Dominant negatief: als één allel is gemuteerd benadeelt dat ook de werking van het nadere allel, doordat er tetrameren worden gevormd: als slechts in één van de vier TP53 eiwitten is aangedaan, verliest de hele tetrameer zijn werking. Van dit
gemuteerde TP53 ontstaat ook veel meer, omdat de feedback door MDM2 wegvalt:
missense mutaties zorgen dus voor een langere levensduur van TP53.
- MDM2-amplificatie: overproductie van MDM2, waardoor TP53 steeds geïnactiveerd wordt. MDM2 is dus een oncogen.
- HPV infectie (HPV-E6) heeft hetzelfde effect als MDM2.
APC, RB, NF1 en TP53 hebben alles met elkaar te maken. pARF, dat wordt gemaakt onder invloed van E2F remt de werking van MDM2. Een mutant RAS-gen zorgt dus voor toename van pARF, waardoor er meer TP53 actief is.
P16 en pARF genen overlappen in het DNA: twee van de drie exonen zijn gelijk: deleties op die plekken zijn dus extra gevaarlijk. Ze remmen namelijk enerzijds de apoptose via weggevallen remming van MDM2 en dus remming van TP53. Anderzijds zorgen ze voor meer proliferatie door de weggevallen remming van Cycline D/CDK4 door het inactieve p16.
Responsiecollege
Chronische myeloide leukemie: alle myeloide voorloper cellen vind je in het bloed.
Normaal mogen alleen rijpe, functionele cellen in het bloed aanwezig zijn. Het kenmerk van chronische myeloide leukemie is het Philadephia chromosoom, dit is een
translocatie van chromsoom 9 naar 22 en andersom. Op chromsoom 22 (philadephia chromsoom) ontstaat het BCR-ABL fusiegen. Het fusie-eiwit is een eiwit dat codeert voor een enzym wat fosforyleert zodat het een substraat (tyrosine) kan worden gefosforyleerd doordat BCR-ABL ATP kan binden. Het remmen van BCR-ABL kan door de plaats waar ATP kan binden in te laten nemen door een medicijn. Er kunnen echter weer mutaties optreden zodat het middel niet kan binden, maar ATP wel en zo moet je weer opnieuw gaan zoeken naar een medicijn.
Chronische mmyeloide leukemie kan overgaan in een acute fase waardoor je een vergelijking krijgt met acute myeloide leukemie warbij alleen blasten in het bloed te vinden zijn. In de acute fase zijn er meerdere afwijkingen zichtbaar in het karyogram, naast de translocatie (9;22). Voorbeelden van veranderingen in de acute fase zijn
inversie (16), t(15;17), t(8;21) deze hebben een gunstige prognose. Een monosomie van chromosoom 7 heeft een slechte prognose.
Hoe ontstaan veranderingen in het karyogram: door breuken in het DNA (Door de hele celcyclus): translocaties deleties, dicentrische chromsomen etc. Het opsporen van translocaties kan met behulp van karyogramanalyse, FISH, SKY en PCR.
Translocaties ontstaan over het algemeen doordat een chromosoom gebroken is. Bij nummerieke afwijkingen is er iets mis gegaan tijdens de mitose. Dit gebeurt omdat tijdens de mitose de tubuline draden vastgemaakt worden waarbij de tubuline draden het ene chromsoom naar de ene kant trekken en de andere naar de andere kant als de
draden niet goed vast zitten wordt er niet eerlijk gedeeld. Controle punt hierop is het anafase-checkpoint.
Karyogramanalyse is hetzelfde als hoe chromosomen eruit zien in de metafase. Echter is het niet zo dat je alle tumoren kan doorkweken in de mitose fase. Als dit niet lukt en je kan dus geen karyogramanalyse doen kan je CGH doen hierbij kun je kijken hoeveel keer een stukje DNA voorkomt dit kan met behulp van microarrays. Analyse van
polymorfe markers kan met behulp van PCR deze markers amplificeren en kijken of je in de tumor zowel de kopie van je moeder als van je vader hebt.
Gevolgen van de afwijkingen in het DNA:
- Bcr-ABLà CML
- IgH-Bcl2 à folliculair lymfoom (heel veen Bcl2) - IgH-Mycà Burkitt lymfoom (heel veel Myc) - En heel veel meer
Kennis van afwijkingen is dus van belang voor diagnose, prognose en behandeling.
Een afwijking is nog niet om echt tot een volledige tumor uit te groeien. Cellen hebben een beperkte delingscapaciteit, dit wordt veroorzaakt door verkorting van telomeren bij deling. Tumoren kunnen tumoren worden doordat het telomerase weer aangezet worden. Telemoren worden zo niet meer korter en delingscapaciteit is oneindig. Je zou dus denken dat het probleem van een tumor zeer makkelijk op te lossen is door
telomerase weer uit te zetten maar dat is toch niet het geval want 85-90% van alle tumoren brengt telomerase tot expressie. De rest maakt gebruik van alternatieve telomeerverlenging; ook al staat telomerase niet aan kunnen telomeren wel verlengt worden, die mechanisme wordt ALT genoemd en het is niet precies duidelijk hoe dit werkt. Vanwege het feit dat niet 100% telomerase tot expressie brengt is een telomeraseremmer niet de magic bullet om kanker te bestrijden.
Checkpoints in de celcyclus: voordat cellen van G1 naar S of van G2 naar M gaan moet eerst schade gerepareerd zijn. In de S-fase kan DNA replicatie geremd worden als er schade is. Checkpoint defecten kunnen tot kankerpredispositie leiden (A-T, NBS, coloncarcinoom, Rb).
Moleculaire circuits: Rb is belangrijk om te voorkomen dat de celcyclus ‘aangezet’ wordt.
P53 zorgt voor controle van celcyclus en apoptose. Vandaar dat vaak beide gemuteerd zijn. Apoptose is een ‘moleculaire cascade’ Bcl2 remt apoptose (folliculair B cel
lymfoom).
4 belangrijke signalen die kunnen verklaren wat er in tumor gaat:
- Er zijn genen om deling te stimuleren - Er zijn genen om deling te remmen
- Er zijn genen om differentiatie te beïnvloeden - Er zijn genen om apoptose te reguleren
Www.JoHo.nl
11
Vaardigheidsonderwijs
VO 1: Moleculaire analyse van tumoren
Tumorvorming verloopt in stadia, waarbij stapsgewijs steeds nieuwe afwijkingen ontstaan onder andere in celgroeiregulerende genen. De afwijkingen vinden hun grondslag in veranderingen in het DNA, waardoor genen niet meer of afwijkend functioneren. Modificaties van groeiregulerende genen in tumoren lopen zeer uiteen.
Onderzoek met behulp van moleculair genetische laboratoriumtechnieken levert niet alleen een beeld van het mechanisme van de ontremde groei, maar draagt ook bij aan meer gedetailleerde diagnostiek en inmiddels ook tot nieuwe therapeutische
mogelijkheden.
Het oncogen Ras
Het Ras oncogen is geactiveerd in veel solide tumoren en leukemieën.
Gen - modificaties die je in tumoren kunt tegenkomen en op welke blot ze te zien zijn:
• Puntmutatie, missense: RNA en eiwit kunnen hetzelfde blijven op blot
• Puntmutatie, nonsense: eerder een stopcodon, dus korter eiwit. Deze mutatie kun je met een RNA blot niet uitsluiten, maar met een immunoblot wel. Er is namelijk geen verschil in RNA maar pas het eiwit is verschillend.
• Kleine deletie of insertie met leesraamverschuiving: Kun je niet uitsluiten met een RNA blot, maar wel met een immunoblot. Er is namelijk een ander eiwit, korter of juist langer.
• Kleine deletie of insertie zonder leesraamverschuiving: Deze kun je niet uitsluiten met een blot want er is 1 aminozuur meer of minder, wat in een immunoblot of RNA- blot niet waar te nemen is.
• Mutatie in splice sequentie (abnormale splicing): totaal ander RNA en eiwit
• Grote deletie (verlies van exonen): totaal ander RNA en eiwit
• Chromosoomverlies (LOH): er wordt minder eiwit aangemaakt dus een minder dik streepje te zien op de blot.
• Gen amplificatie: meer van het gen en meer van het eiwit, dus op beide blots een dikker streepje.
• Chromosoom translocatie: omwisseling van verschillende chromosoomsegmenten.
Dit kan hetzelfde RNA en eiwit geven, het RNA is er namelijk wel maar dan op andere plek.
• Verhoogde transcriptieactiviteit: hogere intensiteit van RNA band
• Vorming van fusie-gen: totaal ander eiwit, bandje is dus verplaatst.
Indien je op het RNA - blot en op het immunoblot geen verschil tussen normaal en de tumor ziet, dan betekent dit dus dat het RNA en het eiwit hetzelfde zijn gebleven in lengte. De mogelijke mutaties zijn dan een missense mutatie en een kleine deletie of insertie zonder leesraamverschuiving.
Het type gen-modificatie kan worden bevestigd door middel van analyse van de nucleotidenvolgorde in het DNA van het geactiveerde Ras-gen. Als je twee afwijkende nucleotidebanden ziet (met halve intensiteit) op een DNA sequentie analyse dan duidt dat op een heterozygote puntmutatie.
Het Ras eiwit (p21ras) speelt een belangrijke rol in signaaltransductie, want het functioneert als biochemische schakelaar. Als er een GTP molecuul aan gebonden is,
dan stimuleert het een serie kinasen die de groei stimuleren. Door deze activiteit wordt GTP omgezet in GDP (inactief Ras). Het mutante Ras eiwit verschilt van het normale Ras eiwit omdat de hydrolysestap van GTP naar GDP niet meer kan plaatsvinden, hierdoor blijft Ras actief en Ras blijft dus de groei stimuleren.
Chronische myeloïde leukemie (CML)
In getransformeerde cellen ziet men bijna altijd chromosomale veranderingen door middel van cytogenetische analyse. Veel maligniteiten worden gekarakteriseerd door een karyotype met zeer specifieke chromosomale afwijkingen. Leukemische cellen van CML patiënten hebben bijna altijd een abnormaal klein chromosoom: een Philadelphia chromosoom (Ph). Dit is het restant van chromosoom 22 na translocatie. De ziekte CML verloopt gewoonlijk in twee fasen: de chronische fase en de blastcrisis.
Er is bij CML dan sprake van een translocatie: t(9;22). Het moleculaire onderzoek van het Ph-chromosoom heeft model gestaan voor de rol die chromosoom-translocaties kunnen spelen bij het ontstaan van kanker. In het begin van de jaren tachtig zijn hier in Rotterdam voor het eerst de genen geïdentificeerd, die een rol spelen bij de Ph-
translocatie: ze heten ABL (omdat het verwant is aan het oncogen uit Abelson leukemievirus) en BCR (breakpoint cluster region).
9q+ staat voor chromosoom 9 met een deel van chromosoom 22. Omdat het chromosoom in totaal langer is geworden, staat er een + achter.
22q- staat voor chromosoom 22 met een (klein) deel van chromosoom 9. Omdat het chromosoom in totaal kleiner is geworden, staat er een - achter.
Het ABL gen zit normaliter terminaal op de q-arm van chromosoom 9, maar bij CML patiënten op chromosoom 22. Het BCR gen zit normaliter op de q-arm vam
chromosoom 22. Bij CML patiënten breekt het BCR gen doormidden: 5’-BCR blijft op chromosoom 22, maar 3’-BCR gaat naar chromosoom 9. Op chromosoom 22 ontstaat nu een fusie gen van ABL met 5’-BCR.
CML metafasen in situ hybridisatie met DNA probes van deze genen levert een goed beeld van de translocatie. Je kunt de translocatie ook zichtbaar maken met FISH op interfase kernen (één chromatide per chromosoom) en dan zie je ineens twee stipjes oplichten vlak bij elkaar (5’-BCR en ABL).
Het RNA blot
Met een RNA - blot kun je uitzoeken of de veranderingen op DNA niveau ook
consequenties hebben voor het mRNA. Op het mRNA blot zien we een veel korter stuk dan normaal. Dit korte stuk representeert het 3’-BCR gen dat nu op chromosoom 9 ligt.
We zien ook een langer stuk dan normaal. Dit is het ABL/5’-BCR fusiegen van chromosoom 22. Ook de normale banden zien we nog, door heterozygositeit. Er is namelijk ook nog een normaal chromosoom 9 en 22 aanwezig.
5’-BCR kleurt bij een normaal persoon op dezelfde hoogte aan als 3’-BCR, omdat deze twee delen met elkaar verbonden zijn. Bij een CML patiënt kleurt 5’-BCR op gelijke hoogte aan als 3’-ABL, omdat dit nu samen een fusie-gen vormt. Het 3’-BCR komt nu alleen voor, en is korter en dus lichter in gewicht.
Het immunoblot
Met het immunoblot kunnen we dan het fusie-eiwit aantonen. Als je met anti-ABL aankleurt zie je op de hoogte van 210 kD een band ontstaan, en als je met anti-BCR aankleurt, zie je op precies dezelfde hoogte een band ontstaan. Dit nieuwe fusie-eiwit
Www.JoHo.nl
13
van 210 kD is karakteristiek voor CML. We zien ook nog normaal eiwit (door heterozygositeit).
Het Philadelfia-chromosoom met de BCR –ABL translocatie is zeer kenmerkend voor CML, en kan daarom dienen als diagnostisch marker. Bij de diagnostiek is de
gevoeligheid van de detectiemethode van cruciaal belang, dat wil zeggen: hoeveel CML- tumorcellen kan men nog detecteren te midden van een overmaat aan normale cellen?
Methoden voor detectie Ph-translocatie:
- Klassieke cytogenetica (chromosoombandering in metafase spreads) - FISH met Bcr/abl probes op metafase chromosomen
- FISH met Bcr/abl probes op interfase-kernen - RNA blotting net Bcr en/of abl probes
- Immunoblotting met anti-Bcr en anti-abl antilichamen - Reverse transcribed PCR
De meest gevoelige methode voor de BCR-ABL translocatie als diagnostische marker is FISH met BCR-ABL probes op interfase kernen. Hierbij zijn twee stipjes vlak bij elkaar zichtbaar. Deze is beter dan de FISH met Bcr/abl probes op metafase chromosomen omdat je bij de interfase variant minder materiaal nodig hebt. Je kunt een Ph-translocatie niet detecteren met een vergelijkende genoomhybridisatie op metafase-chromosomen of op DNA chips (kijk je alleen naar een gen). De hoeveelheid verandert namelijk niet, alleen de plaats.
Wanneer men verschillende CMLs bestudeert op DNA niveau, blijkt dat de translocatie- punten van chr.9 en chr.22 bij alle patiënten verschillend zijn. Toch zie je met de RT-PCR methode vrijwel altijd dezelfde band. Dit komt doordat de breuk meestal in een bepaald intron plaatsvindt. Deze intronen gaan eruit voordat je RNA hebt, dus dan maakt de plaats van de breuk in het intron niet uit. Indien de translocatie punten in een andere intronsequentie ligt, zie je een andere band op gelelectroforese. Ook als de mutatie in een exon zit krijg je een andere band op de gelelectroforese.
VO 2: Celcyclus en kanker
De verdubbeling van een cel verloopt in een celcyclus:
§ G1: rust en opbouw
§ S: de cel repliceert zijn DNA
§ G2: rust
§ Mitose: uitverdelen materiaal over dochtercellen, splitsing in twee dochtercellen G1 + S + G2 vormen samen de interfase.
Duur van de celcyclus van huidfibroblasten:
- G1 – fase: 11 – 14 uur (50%) - S – fase: 8 – 9 uur (30%) - G2 – fase: 3 – 5 uur (15%) - Mitose: ca. 1 uur (5%) Totaal: 20 – 28 uur ( 24 uur)
RNA – synthese: vindt, behalve tijdens de mitose, altijd plaats en in de kern DNA – synthese: alleen tijdens S – fase, in de kern
Door middel van microscoop en flow cytometrie kan men vaststellen in welke fase een cel verkeert. Gebruik je de microscoop, dan moet je bepaalde moleculen radioactief markeren. Afhankelijk van de base die je gebruikt en hoe lang je de kweek behandeld met de radioactieve nucleïnezuur-bouwstenen krijg je een bepaald beeld te zien. Hierbij moet je rekening houden met waar en wanneer DNA en RNA worden aangemaakt, en welke basen daarvoor gebruikt worden. In DNA kun je de nucleotiden C, G, A en T vinden. In RNA zijn dit C, G, A en U. Behandel je een kweek van menselijke fibroblasten korte tijd met radioactief T, dan zal er in de kern van cellen in de S fase radioactiviteit waar te nemen zijn. In kernen van G2, G1 en M fase ontbreekt dit. Ook is het niet in het cytoplasma te zien, want DNA blijft in de kern. Als je echter nog even doorkweekt, dan gaan de cellen door naar de volgende fase. Omdat 1/3 van de cellen op het moment van behandeling met radioactief T in de S fase was, zal 1/3e van de cellen (ook G1, G2 en M) de radioactieve T bevatten. De S echter niet meer, want de cellen zijn uit die fase.
Gebruik je een radioactieve U, dan zal op tijdstip nu in alle kernen een radioactief deeltje aanwezig zijn, behalve van de cellen die zich in mitose bevinden. Na 12 uur doorkweken bevindt het RNA, dus de radioactieve U, zich niet meer in de kern, maar in het
cytoplasma (dit dan ook bij de fasen G2, G1 en S). Bij het gebruik van een radioactieve A zul je op tijdstip 0 alleen radioactieve A’s in de kernen van cellen uit G1, S en G2 fase zien. In de kern van de cel in de S fase zal deze iets meer A bevatten omdat A zich zowel in het DNA als RNA bevindt. Na 12 uur is de A zowel in het cytoplasma als in de kern van alle cellen te zien. Maar omdat niet alle A in de kern is gebleven (DNA alleen gekleurd in S fase en RNA verdwijnt naar het cytoplasma), zal in totaal maar 30% van de cellen een kern hebben met radioactief A erin.
Bij flow cytometrie gebruikt met een apparaat dat ook wel ‘cell sorter’ genoemd wordt.
Hiermee is het mogelijk cellen apart te scoren op volume of fluorescentie.
Je kunt dan uitzetten hoeveel cellen op een bepaald moment hoeveel DNA per cel hadden. De top boven 1 hoeveelheid van DNA per cel duidt op de G1 fase. De top boven de 2 eenheden DNA per cel duidt op de G2 fase. De cellen in het stuk er tussen in bevinden zich in de S fase. Bij deze methode kleur je met DAPI. Je kunt hierbij ook Bromo-deoxyUridine (BrdU) toevoegen, die dan op de plaats van T komt. Deze kun ej vervolgens weer aankleuren. Cellen in de S fase krijgen deze dan ingebouwd, daar zie je deze dan ook op de curve. Vervolgens kun je stipjes zetten voor elke individuele cel of ze BrdU fluorescentie hadden en hoeveel DNA ze dan per cel hadden. Omdat deze in de S fase worden ingebouwd, zal er dus enige BrdU fluorescentie zijn op het gebied tussen 1 en 2 DNA eenheden per cel. Kleur je speciaal voor cellen in de mitose, dan zullen vooral de cellen oplichten die in G2 zitten, dus net naar de mitose gaan.
DNA replicatie remmers
Er zijn verschillende soorten te onderscheiden, allemaal van belang voor chemotherapie van kanker:
- Nucleotide – homologen: deze kunnen niet in het DNA worden ingebouwd. Bij een hoge concentratie ervan komt het DAN polymerase- enzym niet verder.
- Enzym – remmers: deze leggen de polymerase zelf stil, bijv. aphidicoline - DNA beschadigende stoffen: de gewone DNA polymerasen blijven bij de DNA
schade steken
Voeg je aphidicoline toe aan een kweek, dan zullen de cellen in de S fase blijven steken.
De cellen van G2 gaan wel door en komen in G1 terecht. In G1 zal er dus een hogere top zijn en in G2 helemaal geen top. S blijft hetzelfde.
Www.JoHo.nl
15
Contact-remming
Zodra je een kweek behandeld met BrdU voor korte tijd en daarna fixeert, zal in 30%
van de cellen, de cellen die op dat moment in de S fase waren, het BrdU inbouwen. Dit gebeurt zowel in fibroblasten als in een fibrosarcoom. Maar kweek je nog enige tijd door todat er een monolaag van cellen is verkregen en je voert dit dan nogmaals uit, dan heb je een ander resultaat. Van de fibroblasten zal nu 0% herkenbaar zijn, deze zijn namelijk niet verder gegroeit omdat ze confluent waren: de cellen lagen tegen elkaar. Er was geen ruimte meer om te groeien. Dit noemen we contact inhibitie. Bij een fibrosarcoom blijft een confluente kweek ook doorgroeien, waardoor er daarvan dus gewoon 30% in de S-fase in tijdens behandeling, dus evenveel procent is uiteindelijk waar te nemen onder de microscoop.
Karakteristieken van een foci waar een fibrosarcoom is, dus een opeenhoping van cellen:
• Losse mitose
• Dode cellen
• Meer lagen
• Willekeurige rangschikking Checkpoints
Tijdens de celcyclus bestaan er een aantal controle – punten waar gespecialiseerde eiwitgroepen doorgang naar de cyclus kunnen tegenhouden.
Voorbeelden:
• Het G1-checkpoint, dat contactremming veroorzaakt en dat behalve op celdichtheid ook reageert op de concentratie van groeifactoren.
• Het DNA-schade checkpoint: Dit leidde in het voorbeeld tot een G2/M blok activatie. Cellen konden dus niet overgaan van G2 naar M. Hierdoor is er een veel hogere G2 piek. Na enige tijd zijn er allemaal kleine piekjes te zien: Sub G1 pieken. Deze duiden op dode cellen en bijvoorbeeld op microkernen. Na wat langere tijd zie je de curve weer herstellen: de fout is gerepareerd.
Zelfstudieopdrachten
ZO1: Moleculair - genetische analyse – basistechnieken
Bij tumorvorming ontstaan onder andere afwijkingen in celgroeiregulerende genen. Zij bevorderen de groei door een directe groeiactiverende werking of door het wegvallen van groeiremmende invloeden (tumorsuppressorgenen). Modificaties van
groeiregulerende genen kunnen onderzocht worden door moleculair-genetische laboratoriumtechnieken.
Analyse op eiwit-niveau
Voor het bestuderen van eiwitten in een weefselmonster of in cellen bestaan
verschillende technieken. Specifieke antilichamen geven de mogelijkheid het eiwit in kwestie zichtbaar te maken en zijn daarmee het belangrijkste gereedschap.
Immunoblot
De meest gebruikte techniek voor het bestuderen van een eiwit in een weefsel- of celextract is de immunoblot. De eiwitten worden gedenatureerd en op grootte van elkaar gescheiden met behulp van SDS-elektroforese in gels. Denaturatie betekent het
opheffen van de 3D structuur van een eiwit. Vervolgens wordt het te onderzoeken eiwit op de gel zichtbaar gemaakt met het antilichaam.
Om het antilichaam zichtbaar te maken wordt er met een tweede antilichaam gewerkt dat immunoglobulinen herkent. Aan dit tweede antilichaam is chemisch een extra molecuul gekoppeld, waarmee het zichtbaar gemaakt kan worden. Op het verkregen blot kan men de positie van de eiwitband aflezen, die iets over de MW (grootte) van het eiwit zegt. Ook is het mogelijk de intensiteit van de band af te lezen, hier kun je de hoeveelheid van het eiwit van afleiden. Als laatste zijn er ook nog verschillende banden te zien, het aantal hiervan zegt iets over of er meerdere vormen van een eiwit
voorkomen of meerdere soorten eiwitten die met het antilichaam kunnen reageren.
Immunoprecipitatie
Bij immunoprecipitatie wordt het extract behandeld met het antilichaam. De eiwit- antilichaam-complexen slaan neer (precipiteren) en kunnen worden geïsoleerd.
Vervolgens wordt het precipitaat geanalyseerd, bijvoorbeeld met SDS-elektroforese.
Studie van eiwitten in weefsels en cellen
Met antilichamen kunnen specifieke eiwitten ook zichtbaar gemaakt worden in
microscopische preparaten van cellen of weefsels. Veelgebruikte manieren om het eiwit zichbaar te maken:
§ Enzym-gekoppelde antilichamen, bv peroxidase
§ Fluoriserende antilichamen, met fluorescentie-microscopie
Bij deze methode kun je individuele cellen met elkaar vergelijken, je kunt kijken waar in de cel het eiwit zich bevindt en je kunt met veel minder materiaal toe dan bij de
elektroforese, dus is het veel gevoeliger.
Translatie
Bij het translatie proces worden de eiwitten afgelezen van een mRNA molecuul. De aminozuurvolgorde van een gecodeerd eiwit is uit de gensequentie afgeleid, de grootte van het gen-product (eiwit) volgt ook uit deze aminozuurvolgorde, en geef je weer in kD.
Bij AUG wordt de transcriptie gestart, bij UAG, UAA en UGA wordt hij gestopt. Je kunt het leesraam vinden door het leesraam met de minste stopcodons te zoeken.
De regel van Kozak houdt in dat de meest geschikte zetting voor basen voldoet aan de volgorde …PuCCAUGG, waarbij de purine ervoor (dat is een A of G) en de Guanine erachter het meest doorslaggevend zijn.
Het begrip ‘open leesraam’ staat voor een start-plaats gevolgd door een serie codons zonder stop. In het mRNA voor een eiwit van bijvoorbeeld 100 aminozuren, moet zich een open leesraam van 300 basen bevinden.
Transcriptie
TATA staat voor de transcriptie-start en AATAAA staat voor poly-adenylerings-signaal.
Het promoter-gebied bevindt zich altijd ‘stroomopwaarts’ ten opzichte van de
transcriptie-start. Je hebt bij een gen dus altijd eerst een promotor-gebied, dan TATA, vervolgens de stop en dan AATAAA. mRNA heeft voor het definief mRNA wordt nog een aantal modificaties nodig: de intronen moeten eruit gehaald worden met splicing.
Www.JoHo.nl
17
cDNA
cDNA is een dubbelstrengig DNA molecuul, dat in basevolgorde overeenkomt met een rijp mRNA. cDNA wordt gemaakt door een reverse transcriptase enzym met als
beginnetje een stuk poly-T. Genomisch DNA van een gen heeft een promoter en introns, dat heeft zijn cDNA niet.
De RNA blot: moleculaire hybridisatie
Ook een mRNA-mengsel kan worden bestudeerd met elektroforese, om specifieke mRNA’s zichtbaar te maken past men moleculaire hybridisatie toe.
Moleculaire hybridisatie is de vorming van een dubbele helix uit twee enkelstrengige nucleïnezuren met een homologe nucleotidenvolgorde.
Een probe is een bekend stuk enkelstrengig DNA dat kan hybridiseren met een specifiek enkelstrengig DNA of RNA molecuul.
De RNA-blot procedure lijtk veel op de immunoblot. In plaats van het antilichaam wordt nu een bekend stukje DNA gebruikt, de probe, dat met het mRNA in kwestie kan hybridiseren. Gewoonlijk is deze probe van tevoren radioactief gemarkeerd, zodat hij kan worden zichtbaar gemaakt op een fotografische film.
Ook bij de RNA blot zijn er drie grootheden. De positie zegt iets over de grootte (lengte) van het mRNA. De intensiteit zegt iets over de hoeveelheid mRNA. De hoeveelheid banden zegt iets over de aanwezigheid van verschillende transcripten van dit gen.
Specifieke probes kunnen ook worden toegepast in de microscopie, RNA-hybridisatie in situ. Ook hier maakt men gebruik van fluorescerende probes.
Een voordeel van RNA-hybridisatie in situ t.o.v. de blotting techniek:
§ Onderlinge verschillen tussen cellen in een orgaan of weefsel. Lokalisatie natuurlijk voornamelijk cytoplasmatisch (ook een beetje in kern)
§ Veel minder materiaal nodig Analyse van DNA
Moleculaire hybridisatie met probes kan ook worden toegepast voor de analyse van DNA. Voordat deze probes kunnen hybridiseren moeten eerst beide strengen van het te onderzoeken DNA worden gescheiden (denaturatie).
FISH
Fluorescente probes in de microscopie wordt ook wel FISH (fluorescente in situ
hybridisatie) genoemd. Je kunt genen aankleuren in cellen in verschillende fases van de celcyclus.
De polymerase ketting-reactie (PCR)
Bij de analyse van DNA is moleculaire hybridisatie alom aanwezig. De meest gebruikte is de PCR. De korte stukjes enkelstrengig DNA die bij een PCR worden gebruikt heten primers. Ze dienen als begin voor de aanmaak van een DNA molecuul op een
voorbeeldstreng (template) met behulp van een toegevoegd DNA polymerase-enzym.
Een primer is een relatief kort stuk enkelstrengig DNA (meestal <50 nt) dat kan hybridiseren met een template DNA streng om een startpunt voor DNA replicatie te vormen. Het doel van de PCR is het selectief sterk vermeerderen van een gekozen DNA
segment ten opzichte van alle andere. DNA replicatie vindt van de 5’ naar de 3’ kant plaats en hiermee kun je dus de juiste primers kiezen (forward en reverse).
DNA sequencing: het bepalen van de nucleotiden-volgorde
Een stukje template DNA kan dus in een reageerbuis worden gerepliceerd. Naast buffers en zouten zijn er voor zo’n eenvoudige polymerase-reactie nodig:
§ DNA substraat
§ Primer
§ Polymerase-enzym
§ Vier bouwstenen in de trifosfaat-vorm: deoxyATP, deoxyTTP, deoxyCTP en deoxyGTP
Bij het DNA-sequencing voegt men daaraan ook nog een kleine hoeveelheid gewijzigde bouwstenen toe waarbij de polymerase-reactie stopt. Na inbouw van deze bouwstenen kan de keten niet worden verlengd. De verschillende lengtes kunnen per toevoeging (A, G, C en T) kunnen worden gescheiden en zo kan de sequentie afgelezen worden. Ook kunnen de vier varianten gekleurd worden en in een enkele grafiek worden afgebeeld.
Puntmutatie: een verandering in één enkele nucleotide van de volgorde noemt men een puntmutatie. Al naar gelang het effect van de puntmutatie op de genetische code onderscheidt men verschillende typen mutaties.
Nonsense mutatie: een coderend codon is veranderd in een stop-codon. Bijvoorbeeld UAU (tyrosine) naar UAA.
Missense mutatie: verandering van het ene codon naar het andere. Bijvoorbeeld AGG (arginine) naar GGG (glycine).
Synonieme (stille) mutatie: De aminozuurvolgorde verandert niet. Bijvoorbeeld AGA naar AGG (beide arginine).
Splice-mutatie: De mutatie verandert een splice-donor of splice-acceptor sequentie (verdwijnen van een bestaande of creëren van een nieuwe) waardoor het mRNA fout wordt gespliced.
Deletie: verlies van een of meerdere nucleotiden.
Insertie: Toevoeging van een of meerdere nucleotiden. Als het aantal geen veelvoud van drie is treedt een ter plaatse leesraamverschuiving (frameshift) op. Er ontstaat onzin-code die al gauw gevolgd wordt door een stop in het foute leesraam.
Gewoonlijk gaat een PCR vooraf aan de sequencing om het te onderzoeken DNA segment te amplificeren. Dit te amplificeren segment kan gewoonlijk niet veel langer dan een paar duizend bp zijn. Vervolgens kan men eventuele mutaties opsporen. Deze moeten dan wel gelegen zijn in de eiwit-coderende stukken van het gen. Om een bepaald stuk exon te onderzoeken op mutaties moet je een PCR doen met primers die de introns links en rechts van dat exon herkennen. Dan krijg je alleen het exon met slechts een klein beetje intron. Ben je op zoek naar de plek waar een mutatie zit in een coderend gebied, dan moet je eerst cDNA maken en dan ga je dit hele cDNA (eventueel in stukken) amplificeren met primers homoloog aan dit cDNA.
DNA marker onderzoek
Www.JoHo.nl
19
Over het gehele genoom bevinden zich stukjes DNA die weliswaar overerfbaar zijn, maar per persoon (per familie/stamboom) sterk verschillen. Zo’n stukje DNA heet een marker. Als de variatie geen effect heeft op de eigenschappen van de drager, spreekt men van een polymorfisme en een polymorfe marker. Het kan gaan om een enkele (single nucleotide polymorfism: SNP) of om een langer variabel segment. Veel
voorkomend zijn de microsatellieten: een herhaling van een bepaalde volgorde basen, bijvoorbeeld …CACACACACA….
Vergelijkende genoom-hybridisatie (CGH)
Vergelijkende genoom-hybridisatie is een bijzondere vorm van FISH. Het is bedoeld om in een testweefsel (tumor) te onderzoeken of bepaalde stukken DNA meer voorkomen dan gewoonlijk, zonder dat daarvoor de chromosomen onderzocht hoeven te worden.
Test DNA en controle DNA worden verschillend gekleurd en aangebracht in een
preparaat. Het DNA dat dubbel is mengt, hetgeen wat de oorspronkelijke testkleur heeft is overmaat en hetgeen wat de oorspronkelijke controlekleur heeft is ondermaat.
Men onderscheidt de chromosomale CGH en de matrix CGH naar gelang men gebruik maakt van normale metafase-chromosomen of DNA-chips met duizenden bekende DNA fragmenten. In beide gevallen bepaalt het kleurspectrum van de hybridisatie of in het te onderzoeken genomische DNA monster bepaalde DNAs abnormaal vaak of juist te weinig voorkomen.
Zaadcellen zijn natuurlijk haploïd: ze zijn of 23X of 23Y, maar de verhouding van deze twee in het zaadmonster is natuurlijk 1:1. Kortom, alle chromosomen zien geel.
Micro-arrays en gen-expressie profielen
Wat in de matrix CGH gedaan wordt met DNA monsters, kan ook worden toegepast op RNA geïsoleerd uit weefsels. De micro-arrays bevatten nu fragmenten van alle genen in het genoom (>30.000) of van een bepaalde subset daaruit waarop men de specifiek de aandacht wil richten. Ook nu verkrijgt men relatieve waarden tussen twee monsters, bijvoorbeeld een tumor ten opzichte van overeenkomstig normaal weefsel. Het resultaat van een RNA onderzoek op microarrays noemt men het expressieprofiel. Elk weefsel brengt een kenmerkende set genen tot expressie en met een kenmerkende sterkte. Dat levert dus een kenmerkend ‘profiel’ op. Voor een DNA test kun je zowel intron als exon probes gebruiken; voor een expressie-matrix natuurlijk alleen exon- of cDNA.
Wanneer men meer informatie wil over een specifiek gen, kan er cDNA gemaakt worden van het mRNA en vervolgens PCR gedaan worden. De DNA-concentratie is dan een maat voor de hoeveelheid mRNA op het begin. Dit heet een kwantitatieve reverse PCR (RT-PCR)
ZO2: Mitose en cytogenetica deel 2 – karyotypering en chromosoomafwijkingen Een belangrijk terugkerend kenmerk van tumoren is genomisch instabiliteit. Deze komt
voor een deel tot stand door stoornissen tijdens mitose. Een aanzienlijk deel van de huidige cytostatica grijpt ook op de mitose in.
Karyotypering – banderingstechnieken
Met de bloedkweektechniek kunnen menselijke cellen in mitose het makkelijkst verkregen worden. Hierbij wordt phytocaemagglutinine aan een mengsel van bloed en kweekmedium toegevoegd, zodat de lymfocyten gaan delen. Na drie dagen wordt colchicine toegevoegd, waardoor cellen niet verder komen dan de (pro)metafase. Dit komt doordat de aanmaak van tubuline geremd wordt. Hierdoor kan geen spoelfiguur gevormd worden, terwijl de chromosomen wel condenseren. De cel zwelt en fixeert en wordt vervolgens op een objectglas gebracht. Wanneer het fixatief verdampt, de
plasmamembraan open breekt blijven de losse kernen en chromosomen liggen zodat je deze goed kunt bekijken. Dit bekijken gaat met behulp van kleuring. Bij lage vergroting zijn de interfasekernen als ronde bollen met weinig structuur en ontdaan van cytoplasma zichtbaar. Bij hogere vergroting worden de kleine chromosomen zichtbaar als groepjes gedeeltelijk over elkaar een liggende staafjes. Bij de hoogste vergroting is een
gedetailleerd bandenpatroon te zien. Afhankelijk van de gebruikte techniek wordt een gewone lichtmicroscoop of een fluorescentiemicroscoop gebruikt om de chromosomen te bestuderen.
Cytogenetica is de tak van de wetenschap die zich bezighoudt met de studie van chromosoomsamenstelling en –structuur. Karyotypering is het bepalen van de chromosoomsamenstelling.
Wanneer er geen kleuring wordt gedaan, dus geen bandering, kunnen chromosomen alleen in zeven groepen worden onderscheiden, aangeduid met letters A t/m G. Hierbij wordt rekening gehouden met de lengte en relatieve positie van het centromeer.
Wanneer er wel bandering gedaan wordt, kunnen alle chromosomen van elkaar onderscheiden worden. Er kunnen dan afwijkingen worden waargenomen in het aantal van een of meerdere chromosomen ten opzichte van het normale vrouwelijke of mannelijke karyogram. Wanneer een numerieke afwijking al bij conceptie aanwezig is, zal dit leiden tot gezondheidsproblemen. Voorbeelden zijn de syndromen van Turner (1 X chromosoom zonder Y: 45;XO), Kinefelter (1 extra X chromosoom: 47;XXY) en Down (1 extra chromossom 21: 47;XY+21 of 47;XX+21). Bij het syndroom van Turner en Kinefelter is het belangrijk om de diagnose zo snel mogelijk vast te stellen in verband met hormoontherapie. Bij het syndroom van Down is dit belangrijk in verband met het herhalingsrisico bij volgende zwangerschap. Trisomieën van het X-chromosoom zijn minder ernstig dan die van de meeste autosomen. Dit komt doordat elk tweede en verdere X-chromosoom wordt geïnactiveerd, waardoor de gen-expressie van de cel nog monosoom is. De klinische verschijnselen die bij Turner/Down ontstaan komen doordat een klein stukje X chromosoom altijd aan de inactivatie ontsnapt.
Banderingspatronen zijn wel altijd identiek op de twee chromatiden van een
chromosoom, maar de twee overeenkomstige (homologe) chromosomen hebben een verschillend banderingspatroon. Je kunt een G-bandering doen, dat doe je met trypsine/Giemsa, of een reverse bandering, R-bandering met Acridine Oranje. De banderingspatronen die je met de verschillende kleuringen verkijgt (G of R) zijn elkaars spiegelbeeld. Bij G-bandering wordt een positieve band zwart en bij R-bandering wordt deze juist wit. R-bandering is meestal van betere kwaliteit.
Een cel is aneuploïd als het aantal chromosomen niet een meervoud is van 23 en/of niet alle chromosomen voorkomen in gelijke hoeveelheid.
Non-disjunctie is het ongelijk verdelen van chromatiden over de twee dochtercellen. Dit kan voorkomen bij de meiose (homologe chromatiden) of bij de mitose (identieke
chromatiden).
Fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
Bij FISH wordt het DNA in de gespreide metafase-preparaten gedenatureerd (strengen van elkaar gescheiden) met behoud van de zichtbare chromosoomstructuur. Vervolgens wordt een specifiek stuk enkelstrengs DNA, een probe, dat tevoren is gemarkeerd aan de chromosomen gehybridizeerd, waarmee de homologe chromosoomregio’s zichtbaar
Www.JoHo.nl
21
gemaakt worden. Het markeren van probes gebeurt tegenwoordig met fluorescentie- technieken. Deze techniek is zeer geschikt om snel de chromosomale localisatie van een nieuw-geïsoleerd gen te bepalen en om sommige soorten chromosomale
afwijkingen te detecteren, zowel numerieke als structurele afwijkingen. Voordeel van de interfase FISH is dat je geen delende cellen nodig hebt.
Het is ook mogelijk om totale chromosomen of chromosoomdelen met behulp van FISH te laten oplichten. Dit noemen we chromosome painting. Door de probe-mengsels voor verschillende chromosomen te voorzien van verschillende verhoudingen
kleurstoffen wordt multicolor-analyse mogelijk. SKY/painting is het minst geschikt voor relatief kleine chromosomale deleties. Het is wel geschikt voor translocaties en
numerieke afwijkingen. Wil je wel een deletie aantonen met FISH, dan zul je een fluorescerende scoop moeten maken met alleen dat stukje. Daarvoor moet deze dan natuurlijk wel bekend zijn. Als chromosomen over elkaar heen liggen is het lastig beoordelen. Om dit te voorkomen moet je het spreidingsfiguur eerst even controleren voordat je hem gaat analyseren. Tevens moet je voldoende colchicine toedienen, zodat het spoelfiguur daadwerkelijk helemaal weg is.
Bij een gebalanceerde translocatie gaat in het algemeen geen genetische informatie verloren, ook al zit het op een ander chromosoom; tijdens de mitose blijft het evenwicht behouden. Daarom gaat een gebalanceerde translocatie maar zelden gepaard met gezondheidsproblemen. Maar tijdens de meiose ontstaat er frequent onbalans. Dat heet een ongebalanceerde translocatie waarbij er voor grote delen van chromosomen trisomie of monosomie kan optreden. Zoiets is meestal niet gezond, gewoonlijk sterft de vrucht al vroeg af. De ernst is wel afhankelijk van de plaats van de
translocatiebreukpunten.
In een standaard bloeduitstrijk kun je soms al het geslacht van de donor bepalen. Dit doordat je kunt kijken naar drumsticks in de neutrofiele granulocyten. Dit zijn de geïnactiveerde X-chromosomen, de lichaampjes van Barr, die je ziet bij granulocyten van een vrouwelijke donor.
Chromosomale afwijkingen
Overzicht van een aantal typen afwijkingen:
Zuiver numerieke afwijkingen: 1 of meerdere chromosomen teveel of te weinig. Ze komen tot stand door onjuiste verdeling van een chromatidepaar over de dochtercellen.
Dit wordt veroorzaakt door storingen in het anafase-checkpoint.
Dicentrische chromosomen: Ze kunnen tijdens ana- en telofase aanleiding geven tot een brug en tot microkernen. Ze zijn het gevolg van foutief gerepareerde DNA breuken.
Centrosoom amplificatie: Cellen (meestal in meta- of anafase) waarin een afwijkend aantal centriolenparen te zien is.
Homogeen kleurende gebieden (HSRs): door een te sterke vermenigvuldiging van een bepaalde regio in het chromosoom.
Translocaties: ontstaan op dezelfde manier als dicentrische chromosomen, maar veroorzaken geen afwijkingen tijdens de mitose.
Anafasebruggen en microkernen ontstaan vanwege een fout in het spoelfiguur. Niet elk acentrisch fragment levert een brugfiguur op. Dit is afhankelijk van twee factoren. Ten eerste is het wel zo, dat een rearrangering die een dicentrisch chromosoom produceert altijd tegelijk een acentrisch fragment met zich meebrengt. Maar acentrische fragmenten kunnen ook op andere wijze ontstaan, bijvoorbeeld een gewone chromosoombreuk. Ten
tweede geldt nog altijd dat een dicentrisch chromosoom maar met 50% kans op een brug oplevert.
Er zijn verschillende chromosomale afwijkingen, zowel stabiele als instabiele. Een instabiele afwijking blijft niet bestaan, hij is alleen te zien in de eerstvolgende
(pro)metafase nadat de schade is opgetreden. Er zijn verschillende redenen voor de instabiliteit. Ten eerste kan het een probleem zijn tijdens de anafase of later: een dicentrisch chromosoom vormt vroeg of laat een brug, met de ringchromosomen gaat het zeker mis. Ten tweede kan de afwijking van zodanige ernst zijn daad de cel al snel dood gaat, doordat er na de deling essentieel materiaal verloren is gegaan, wat
bijvoorbeeld bij ene deletie kan voorkomen. De derde reden is dat ook acentrische fragmenten niet stabiel zijn, want ze worden willekeurig over de dochtercellen verdeeld.
Voorbeelden van stabiele afwijkingen: trisomie en gebalanceerde translocatie.
Elke afwijking die een acentrisch chromosoom produceert kan na de mitose een microkern opleveren.
Het soort breuken en rearrangeringen dat in chromosomen wordt waargenomen hangt af van het moment van de bestraling. Daarbij is vooral de timing tijdens de celcyclus van belang. Als een cel bestraald is tijdens de S-fase dan kun je binnen één cel zowel chromosoomtype afwijkingen (door nog niet gerepliceerde delen op stralingsmodel) en chromatidetype afwijkingen (door delen die al klaar waren op het stralingsmodel) vinden.
Zusterchromatide-afwijkingen (SCE) kun je met standaard bandering en met FISH/painting niet opsporen. Dit komt doordat de twee chromatiden van het chromosoom identiek zijn.
Twee verschillen tussen een acentrisch en dubbel minuut (DM) chromosoom:
1. Alle DM chromosomen in een cel bevatten (vrijwel) hetzelfde genetisch materiaal.
2. Een DM chromosoompje is altijd heel klein.
In gekweekte tumorcellen met aneuploïdie loopt het aantal chromosomen vaak uiteen tussen aparte cellen. Bij ander soort tumorcellen met een bepaalde trisomie of
monosomie vertonen dit veel minder. Een mogelijke verklaring voor deze verschillen in heterogeniteit is dat de nondisjunctie het gevolg kan zijn van eenmalig falen van het anafase checkpoint, de cellen van de tumor zullen ongeveer gelijk zijn. Als er een structureel probleem is met dit checkpoint treden er voortdurend nieuwe nondisjuncties op.
Bij het ontstaan van anafasebrug, SCE, translocatie, microkernen en komeetafwijkingen speelt DNA schade een belangrijke rol. Bij de HSR’s, tripolaire mitose, trisomie en polyploidie speelt DNA schade niet zo’n belangrijke rol.
In een cel die een cytostatische behandeling met vincristine of taxol heeft overleefd verwacht je afwijkingen in de spoel die nondisjunctie veroorzaken, er zal dus aneuploïdie optreden.
De uiteinden van de chromosomen, telomeren, vormen een speciale structuur op zich, belangrijke begrippen hierbij zijn (TTAGGG) repeat en T-loop.De T-loop ontstaat doordat het uiteinde enkelstrengs is en in de eigen helix verdwijnt. Telomeren spelen een
sleutelrol bij de cellulaire levensduur en celimmortalisatie. Telomeren moeten een
Www.JoHo.nl
23
bepaalde structuur hebben omdat er speciale voorzieningen moeten worden getroffen voor de volledige replicatie van uiteinden. Een andere reden voor de speciale structuur is dat een niet-berschermd open uiteinde zal worden gezien als een dubbestrengsbreuk, die vervolgens door de herstelsystemen gerepareerd zou worden, met
chromosoomfusies als gevolg. Dicentrische chromosomen kunnen ontstaan door straling en daaraan verwante cytostatica, en telomeererosie.
In acrocentrische chromosomen (13,14,15,21 en 22) is de p-arm erg klein en bevat weinig erfelijke informatie. Hierin bevinden zich variabele heterochromatine gebieden met niet-coderend repeterend DNA.
Harlekijn-chromosomen: door in een celcyclus Broom-desoxy-Uridine (BUdR) toe te voegen wordt dit ingebouwd in DNA op de plaats van thymidine. Bij de tweede celcyclus voeg je dit niet toe, waarna er chromosomen ontstaan met één chromatide met BUdR.
DNA-beschadigende verbindingen zorgen voor problemen tijdens de S-fase, waarbij er breuken kunnen ontstaan die met recombinatie gerepareerd worden. Het nieuwe DNA wordt aan het oude gehecht, waardoor je een zuster chromatide uitwisseling krijgt (SCE) die op een BUdR kleuring te zien is als een harlekijn-kleuring.
ZO3: Aneuploidie en coloncarcinoma
De meeste solide tumoren hebben chromosomale afwijkingen. Omdat solide tumoren meestal slecht te kweken zijn, kunnen ze niet op grote schaal gekaryotypeerd worden om de chromosomale veranderingen te bestuderen. Daarom wordt vaak CGH
(comparitive genomic hybridization) gebruikt om belangrijke gebieden te vinden. Daarna worden deze gericht onderzocht met microsatellietanalyse (MA). Hiermee wordt loss-of- heterozygosity (LOH) opgespoord.
Normale humane cellen bevatten 23 chromosoomparen. In de metafase van de celcyclus zijn de chromosomen gecondenseerd en kunnen ze onder de microscoop zichtbaar gemaakt worden. In principe hebben alle cellen in het lichaam dezelfde set van 46 chromosomen. Bij aneuploidie is er een abnormale hoeveelheid DNA in een cel, als gevolg van chromosomale afwijkingen.
Vaak worden in kankercellen veranderingen in het karyogram waargenomen. Een cellijn kan oneindig doorgekweekt worden in een medium met voldoende voedingsstoffen. Het lukt soms om van tumoren een cellijn te maken, normale cellen gaan in een kweek snel dood. Bij veel tumoren lukt het cellen kweken voor een karyogram echter ook niet goed.
Bovendien kost het veel tijd en kunnen er nieuwe veranderingen ontstaan tijdens het kweken.
Kanker wordt veroorzaakt door veanderingen in proto-oncogenen en
tumorsuppressorgenen. Door verlies van chromosomen of chromosoom-armen zullen tumorsuppressorgenen die op die chromosomen/armen liggen verloren gaan. Als het overblijvende allel van het gen uitgeschakeld is door een kleine mutatie vervalt de tumorsuppresserende werking van dit gen in zijn geheel.
Een andere manier om naar chromosomale veranderingen te kijken is d.m.v. CGH, waarmee ‘gains’ en ‘losses’ van chromosomale gebieden kunnen worden opgespoord.
Grote hoeveelheden tumoren kunnen tegelijk en in korte tijd worden geanalyseerd, zodat een goed overzicht wordt verkregen.
Uit de data van een analyse van 125 darmtumoren blijken bepaalde chromosomen de meeste afwijkingen te vertonen. In veel tumoren is er verlies van het bovenste deel van
