Het detecteren van bijzonder resistente micro organismen met chromogene agar platen en met behulp van de Eswab

(1)

Het Detecteren van Bijzonder

Resistente Micro Organismen met

Chromogene Agar Platen en met

Behulp van de ESwab

Angela de Wit Juni 2013

(2)

A. de Wit 2

Het Detecteren van Bijzonder Resistente

Micro Organismen met Chromogene Agar

Platen en met Behulp van de ESwab.

Auteur:

A. de Wit

Afstudeerscriptie voor de opleiding ATGM, Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek Avans Hogeschool, Breda

Begeleider Avans Hogeschool:

Dr. Ing. J. Ramakers

Opdrachtgever:

SJG Weert, afdeling Medische Microbiologie en Ziekenhuis Hygiëne

Begeleiders SJG Weert:

Dr. B.J. van Dijke O.A.J. Brouns-Jansen

Afstudeerperiode:

(3)

A. de Wit 3

Voorwoord

Ter afsluiting van mijn deeltijd opleiding aan Avans Hogeschool Breda, Academie voor Technologie van Gezondheid en Milieu, heb ik een onderzoek gedaan naar het detecteren van bijzonder resistente micro organismen met behulp van selectieve platen en de ESwab.

Ik wil hiervoor alle medewerkers van de afdeling Medische Microbiologie en Ziekenhuis Hygiëne bedanken voor de ondersteuning tijdens het afstuderen. Ook wil ik persoonlijk de arts-microbioloog mw. Drs. B.J. van Dijke bedanken voor de organisatorische begeleiding en voor het geven van advies en vakinhoudelijke begeleiding. Mw. O.A.J. Brouns-Jansen wil ik graag bedanken voor de begeleiding op het laboratorium.

Angela de Wit 30.04.2013

(4)

A. de Wit 4

Samenvatting

De gezondheidszorg heeft in toenemende mate te maken met resistente micro-organismen. Hierdoor is het van belang dat BRMO’s tijdig gedetecteerd worden. Momenteel is er nog geen standaard protocol voor de screening van BRMO’s op de afdeling Medische Microbiologie van het SJG Weert. Voor de screening op BRMO’s in de toekomst wilt men gebruik gaan maken van chromogene agar platen voor de detectie van ESBL, VRE, CRE en gentamycine resistente micro organismen. Samen met deze platen is het de bedoeling om de ESwab in gebruik te gaan nemen in plaats van de CultureSwab EZ. Met de ESwab is er bij een aanvraag naar meerdere onderzoeken voldoende aan één swab.

Om de chromogene platen en de Eswab te testen zijn verschillende onderzoeken uitgevoerd om na te gaan of deze hanteerbaar zijn binnen de afdeling. Om de platen te testen is er eerst een verdunningsreeks van positieve ESBL, CRE, VRE en genta stammen gemaakt op de platen, om na te gaan of de platen de stammen ook in lage concentraties detecteren. Ook zijn de platen onderzocht op storende factoren vanuit patiëntenmateriaal. Hiervoor is weer een verdunningsreeks gemaakt van bekende positieve BRMO stammen, waar in de gebruikte verdunningen faeces is toegevoegd. Om de ESwab te vergelijken met de CultureSwab EZ is er ook weer gewerkt met de verdunningen van de BRMO stammen. De Swabs zijn beënt met deze verdunningen en 0-4 uur en 20-4 uur (overnacht) in de koelkast weggelegd. Hierna zijn de platen met deze swabs beënt. Ook werden de swabs na de opslagtijd in een ophopingsmedium gedaan. Al deze resultaten zijn met elkaar vergeleken. Dit onderzoek is ook uitgevoerd met faeces. Uit de resultaten van het onderzoek is naar voren gekomen dat de specifieke platen een lage detectiegrens hebben voor BRMO’s. Echter moet er wel rekening mee gehouden worden dat de screening niet negatief is wanneer er geen groei op de platen zit, omdat het aantal KVE ook onder de detectiegrens van de selectieve voedingsbodem kan liggen. Faeces hebben een storende werking op de ESBL- en VRE plaat, dit geeft zich weer als een gekleurde waas. Deze waas is afkomstig van de commensale flora, E.coli en E.faecalis in de faeces, en zal dus niet aanwezig zijn vanuit andere patiëntenmaterialen. De ESwab heeft een iets hogere detectiegrens dan de CultureSwab EZ, doordat de stammen nog een extra stap verdund worden in het Amies medium. Echter na ophopen is van dit verschil niets meer te zien.

Om dit onderzoek goed af te ronden is het nog nodig om de platen en de ESwab in vivo te testen.

(5)

A. de Wit 5

Summary

Health care has increasingly dealing with resistant microorganisms. That’s why it is important to detect BRMO timely. Currently there is no standard protocol for screening for BRMO in the microbiology laboratory of SJG Weert. In the future they want to screen on BRMO and then use chromogenic agar plates for ESBL, VRE, CRE and Gentamicin resistant microorganisms. Together with these plates they want to implement the Eswab in place of the CultureSwab EZ. With the Eswab they can do multiple researches of only one swab.

To test the chromogenic plates and the ESwab, several studies have been done in order to verify whether these would be manageable within the department. In order to test the plates, first a series of dilutions was made of positive and negative ESBL, CRE, VRE and Genta resistant microorganisms to check if the plates determine the bacteria in low concentrations. Also, the plates are examined for compounding factors from patient material. This is done to make series dilutions of positive and negative BRMO’s and add some faces into the dilution.

To compare the ESwab with the CultureSwab EZ, there is also worked with dilutions of BRMO’s. The swabs are inoculated with the dilutions for 0-4 hour, and 24 hour (overnight) in the refrigerator. After this, the plates and enrichment medium were inoculated with these swabs. The results are compared with each other. This experiment was also conducted with faces.

The results of this study have shown that the specific plates have a low detection range for the BRMO’s. However, it should be kept in mind that the screening isn’t negative when there is no growth on the plate, because the number of CFU may also lie under the range of the selective plate. Faces has a disturbing effect on the ESBL- and the VRE plate. This is shown by a colored haze. The haze is formed by commensal microorganisms E.coli and E.faecalis in de faces, and will not be present in other patient materials.

The ESwab has a slightly higher detection range than the CultureSwab EZ, because the BRMO’s would be a little diluted in the Amies medium. However, after accumulating this different is gone.

To complete this research, there is still need to be an in vivo experiment to test the ESwab and CultureSwab EZ.

(6)

A. de Wit 6

Inhoudsopgave

VOORWOORD 3 SAMENVATTING 4 SUMMARY 5 INHOUDSOPGAVE 6 1. INLEIDING 8 2. THEORETISCHE ACHTERGROND 9 2.1. ANTIBIOTICA 9

2.1.1. Β-LACTAMASES, ESBL EN CRE 10

AMBLER KLASSE A 10 AMBLER KLASSE B 11 AMBLER KLASSE C 11 AMBLER KLASSE D 11 2.1.2. VRE 11 2.1.3. GENTAMYCINE RESISTENTIE 13

2.2. ESWAB EN CULTURESWAB EZ 13

2.2.1. BBL CULTURESWAB EZ 13

2.2.2. ESWAB 13

2.3. HUIDIGE DETECTIEMETHODE BRMO 14

3. MATERIAAL EN METHODEN 17

3.1. BACTERIESTAMMEN 17

3.2. HET OEFENEN VAN EEN VERDUNNINGSREEKS 17

3.3. MAKEN VAN VERDUNNINGSREEKSEN OP SPECIFIEKE PLATEN 17

3.4. DE INVLOED VAN PATIËNTENMATERIAAL OP SPECIFIEKE PLATEN 18

3.5. ESWAB VERGELIJKEN MET DE CULTURESWAB EZ 18

3.6. DE INVLOED VAN PATIËNTMATERIAAL OP DE ESWAB EN DE CULTURESWAB 19

4. RESULTATEN 21

4.1. HET OEFENEN VAN EEN VERDUNNINGSREEKS 21

4.2. MAKEN VAN VERDUNNINGSREEKSEN OP SPECIFIEKE PLATEN 21

4.2.1. ESBL PLAAT 22

4.2.2. VRE PLAAT 22

4.2.3. CRE PLAAT 23

(7)

A. de Wit 7

4.3. DE INVLOED VAN PATIËNTMATERIAAL OP SPECIFIEKE PLATEN 24

4.3.2. VRE PLAAT 24

4.3.3. CRE PLAAT 24

4.3.4. GENTA PLAAT 25

4.4. ESWAB VERGELIJKEN MET DE CULTURESWAB EZ. 26

4.4.2. VRE PLAAT 27

4.4.3. CRE PLAAT 29

4.4.4. GENTA PLAAT 30

4.5. DE INVLOED VAN PATIËNTENMATERIAAL OP DE ESWAB EN DE CULTURESWAB EZ. 32

4.5.1. ESBL 32

4.5.2. VRE 33

4.5.3. CRE 33

4.5.4. GENTA 34

5. DISCUSSIE 35

5.1. SUGGESTIES VOOR VERDER ONDERZOEK 37

5.2. AANBEVELINGEN 37 6. CONCLUSIE 38 6.1. CHROMOGENE PLATEN 38 6.2. ESWAB 38 LITERATUUR 39 SYMBOLEN-/AFKORTINGENLIJST 41 BIJLAGEN 42 I. VERZAMELDE BACTERIESTAMMEN 43

II. RESULTATEN ESWAB VERGELIJKEN MET DE CULTURESWAB EZESBL 45 III. RESULTATEN ESWAB VERGELIJKEN MET DE CULTURESWAB EZVRE 51 IV. RESULTATEN ESWAB VERGELIJKEN MET DE CULTURESWAB EZCRE 53 V. RESULTATEN ESWAB VERGELIJKEN MET DE CULTURESWAB EZGENTA 57

(8)

A. de Wit 8

1. Inleiding

De gezondheidszorg heeft in toenemende mate te maken met resistente micro-organismen. Hierdoor is het van belang dat BRMO’s tijdig gedetecteerd worden. Een bekend voorbeeld is de meticilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), waartegen in Nederland met succes een search and destroy-beleid wordt gevoerd. Er zijn echter meer micro-organismen die in staat zijn resistentie te ontwikkelen tegen de meeste eerste keus antibiotica of tegen een combinatie van therapeutisch belangrijke antibiotica. Op de afdeling Medische Microbiologie en Ziekenhuis Hygiëne (MMZH) van het SJG Weert wil men gebruik gaan maken van chromogene agar platen voor Bijzonder Resistente Micro Organismen, zodat er standaard gescreend kan gaan worden op deze micro organismen. Ook wil men gebruik gaan maken van de ESwab, waardoor bij aanvragen voor meerdere onderzoeken, zoals banaal, anaeroob en BRMO, maar één swab nodig is.

Het doel van dit onderzoek is het testen van chromogene agar platen voor extended spectrum beta-lactamases (ESBL), vancomycine resistente Enterococcen (VRE), carbapenemase resistente Enterobacteriaceae (CRE) en gentamycine resistente micro organismen, en het vergelijken van de ESwab met de huidige CultureSwab EZ waarbij verwacht wordt dat de ESwab niet onder doet aan de CultureSwab EZ, en zelfs betere resultaten oplevert.

In hoofdstuk twee wordt de theoretische achtergrond besproken. Hierin staat de informatie over ESBL’s, VRE’s, CRE’s en Gentamycine resistentie. De verschillen tussen de CultureSwab EZ en de ESwab zullen hier ook worden uitgelegd, en ook wordt de huidige detectiemethode voor BRMO’s besproken in dit hoofdstuk. In hoofdstuk drie worden de materiaal en methode voor het onderzoek uitgelegd, waarna in hoofdstuk vier de resultaten worden weergegeven. In het vijfde hoofdstuk staat de discussie beschreven samen met suggesties voor verder onderzoek en mijn aanbevelingen voor de afdeling MMDIP van het SJG Weert. In het zesde en laatste hoofdstuk staat de conclusie van het onderzoek.

(9)

A. de Wit 9

2. Theoretische achtergrond

2.1. Antibiotica

Antibiotica zijn gifstoffen die het ene organisme tegen het andere inzet als ‘chemische wapens'. Deze stoffen kunnen de groei van bacteriën remmen of zelfs doden. Veel antibiotica worden in de natuur geproduceerd door schimmels en bacteriën. Alexander Fleming ontdekte in 1940 een antibioticum dat door een schimmel werd uitgescheiden. In 1944 kwam dit antibioticum, penicilline, op de markt en kon door artsen worden ingezet tegen bepaalde infecties. Penicilline is sindsdien door vele andere antibiotica gevolgd. Sommige zijn afkomstig uit natuurlijke bronnen zoals schimmels, andere zijn in het laboratorium gemaakt. Nieuwe antibiotica waren nodig om een weerwoord te hebben tegen de talloze soorten bacteriën die bij mensen en dieren ziektes kunnen veroorzaken.9 Sommige antibiotica zijn effectief tegen meerdere soorten bacteriën, andere zijn erg specifiek en doden maar ėėn soort. Zo is in Afbeelding 1 te zien dat Vancomycine een veel smaller spectrum heeft dan bijvoorbeeld tetracycline.14

Afbeelding 1: Antimicrobiële werkingsspectra.14

Antibiotica worden op verschillende manieren ingedeeld. Dit kan zijn op basis van de structuur, hun werkingsmechanisme op het aangrijpingspunt op de bacterie. In Afbeelding 2 zijn verschillende antibiotica verdeeld op aangrijpingspunt.9

(10)

A. de Wit 10

2.1.1. β-lactamases, ESBL en CRE

lactam antibiotica zijn antibiotica met een β-lactamring, zoals penicillines en cefalosporines (Afbeelding 3). ß-lactam antibiotica werken als remmers van de celwand synthese door het blokkeren van de transpeptidases. Transpeptidasen zorgen voor het cross-linken van twee glycaan-gelinkte eiwit ketens waardoor interpeptide bruggen ontstaan, een belangrijk kenmerk van de bacteriële celwand synthese. De transpeptidase enzymen van de celwand binden aan penicilline of een ander β-lactam antibiotica. Deze transpeptidasen worden Penicilline-Bindende-Proteïnen (PBP’s) genoemd. Wanneer deze PBP’s zich binden aan het antibiotica, kan de transpeptidase reactie niet goed uitgevoerd worden, terwijl de celwand synthese gewoon door gaat. Hierdoor

is de nieuw

gevormde celwand

niet langer gecrosslinkt, en kan deze zijn sterkte niet behouden. Het resultaat is dus een zwakke zelf-afbrekende celwand (Afbeelding 3).5

Ook kan het zijn dat de osmotische waarde in de cel en buiten de cel anders zijn waardoor de cel lyseert. β-lactam antibiotica zijn hierdoor alleen effectief tegen snel delende bacteriën. Onder deze groep antibiotica vallen o.a. penicillines, cefalosporines en carbapenems (imipenem en meropenem).8 β-lactamases zijn enzymen die de β-lactamring van de antibiotica afbreken, waardoor resistentie ontstaat tegen de β-lactam antibiotica (Afbeelding 4). β-lactamases worden in vier klassen onderverdeeld, Ambler klasse A t/m D. Dit classificatieschema is gebaseerd op de eiwithomologie (aminozuur gelijkenis) en niet op fenotypische kenmerken. In dit classificatieschema zijn de β-lactamases van de klassen A, C en D serine-β-lactamases en de enzymen van klasse B zijn metallo-β-lactamases. ESBL’s zijn plasmide gecodeerde enzymen die in staat zijn penicillines, cefalosporines van de 1e, 2e en 3e generatie (deze hebben een oxyimino zij-keten) en aztreonam te hydrolyseren.4

Ambler klasse A

Deze klasse bestaat uit penicillinases, cephalosporines en carbapenemases die een serine-deel in het actieve deel van het eiwit hebben. Deze groep bevat Extended Spectrum Beta Lactamases (ESBL's) van de volgende vormen:

SHV β-lactamases

SHV staat voor SulfHydryl Variabel, dat verwijst naar de biochemische eigenschappen van het enzym. SHV ESBL’s zijn gedetecteerd in vele Enterobacteriaceae, en het meest voorkomend in Klebsiella pneumoniae.4

TEM β-lactamases

ESBL TEM β-lactamases zijn afgeleid van TEM-1 en TEM-2. TEM-1 en TEM-2 zijn geen ESBL’s, maar TEM-3 is dit wel. TEM-3 is afgeleid van TEM-2, maar verschilt in twee aminozuren. TEM-1 kan ampicilline beter hydrolyseren dan carbenicilline, oxacelline of Afbeelding 3: De celwandsynthese. De

transpeptidases / PBP’s (roze) zorgen voor het cross-linken van twee glycaan gelinkte eiwit ketens (zwart). Het antibiotica bind

aan de PBP, waardoor de transpeptidase reactie niet goed uitgevoerd kan worden.9

Afbeelding 4: Beta-lactam antibiotica, en de werking van β-lactamases.11

(11)

A. de Wit 11 cepholatin. TEM-2 heeft hetzelfde hydrolyse profiel als TEM-1, maar verschilt in iso-elektrisch punt. TEM-type β-lactamases worden het meest gevonden in E.coli en K.pneumoniae.4

CTX-M β-lactamases

De naam CTX-M geeft de sterke hydrolytische activiteit tegen cefotaxime weer. CTX-M β-lactamases hebben een typisch resistentiepatroon tegen cefotaxime, resistent, (MIC van >64mg/ml), terwijl deze Intermediair zijn voor ceftazidime (MIC van 2 to 8 mg/ml). Deze enzymen worden gevonden op het chromosoom van Kluyvera spp., een zeldzaam pathogene commensale bacterie. En wordt het meeste gevonden in Salmonella spp. en E.coli.4

Ambler klasse B

Ambler klasse B β-lactamases zijn Carbapenemases met een Zn2+_{ion op de active site.} De klasse B Beta Lactamases zijn ook wel bekend als metallo-beta-lactamases, MBL. Ze kunnen penicillines, cephalosporines, carpenemases hydroliseren en zijn resistent tegen de meeste Beta Lactamase remmers. Deze hydrolitische activiteit heeft geen effect op Aztreonam. Het MBL bla gen is in Bacillus spp., Chryseobacterium spp. en in S. maltophilia gecodeerd op het chromosoom. In P.aeruginosa, K.pneumoniae en A.baumannii is het MBL bla gen gecodeerd op mobiele genetische elementen.7

Ambler klasse C

Deze klasse β-lactamases omvat cefalosporines die net als de klasse A β-lactamases een serine-deel op de actieve site van het eiwit hebben. Deze zijn meestal gecodeerd op het bacteriële chromosoom, maar komen ook steeds vaker voor op het plasimide. De chromosomaal gecodeerde variant komt voor in Enterobacter spp. en in Citrobacter spp.. De plasmide gecodeerde variant komt vaak voor in Klebsiella spp., Salmonella spp. en in Proteus spp.. De stammen die deze enzymen produceren zijn resistent voor aminopenicillines, cefalosporines, cefamycines en beta-lactamase remmers.7

Ambler klasse D

Deze enzymen zijn gecategoriseerd als de oxacillinases, omdat ze in staat zijn om oxacilline te hydroliseren. Daarom worden deze enzymen OXA β-lactamases genoemd. OXA ESBL’s (OXA-11, -15) zijn resistent tegen oxyimino-cefalosporines. OXA carbapenemases (OXA-23, -48) kunnen carbapenems hydrolyseren. De meeste OXA enzymen zijn resistent tegen remming door clavulaanzuur, sulbactaman tazobactam.7 In 2011 is er een uitbraak geweest met een OXA-48 K.pneumoniae in het Maasstadziekenhuis in Rotterdam.

2.1.2. VRE

VRE staat voor Vancomycine Resistente Enterococcus. Hierbij gaat het dan voornamelijk om E.faecium en E.faecalis, omdat andere Enterococcus soorten minder vaak geïsoleerd worden. Voordat infecties met Enterococcen behandeld werden met vancomycine, werden deze behandeld met β-lactam antibiotica en vervolgens met aminoglycosiden. Echter is deze groep bacteriën hier resistent tegen geworden waardoor alleen vancomycine nog hielp. Nu zijn er ook stammen die tegen vancomycine resistent zijn geworden, waardoor behandeling van deze bacterie bijna onmogelijk is.18 _{Vancomycine is}

(12)

A. de Wit 12 een glycopeptide antibiotica. Deze antibiotica verhinderen het late stadium van de peptidoglycaan-, en dus de celwand-, synthese. De celwand bestaat uit afwisselend N-acetylmuraminezuren (NAM) en N-acetylglucosamine (NAG) eenheden. Deze glycoside-eenheden zijn verbonden door transglycosidasen. Een pentapeptide is verbonden aan elke NAM eenheid en de cross-linking van twee D-alanine-D-alanine NAM pentapeptides wordt gekatalyseerd door PBPs, die fungeren als transpeptidasen.5 _{Glycopeptiden binden} zich aan de D-alanine-D-alanine aansluitingen van de pentapeptide-uiteinden die aan de buitenkant aan de oppervlakte zitten van het membraan. De daarop volgende hindering van de pentapeptide aansluitingen, blokkeren de aansluiting van peptidoglycaan door de activiteit van transglycosylasen (verantwoordelijk voor de nieuwe disacharide-pentapeptide onderdelen op het nieuwe peptidoglycaan) en transpeptidasen te remmen. Onder deze groep antibiotica vallen vancomycine en teicoplanine.

Er zijn zes verschillende soorten vancomycine resistentiegenen, VanA, VanB, VanC, VanD, VanE en VanH. De oorsprong van Van genen in enterococcen is onbekend. De D-Ala-D-Ala ligase is verantwoordelijk voor de productie van de D-D-Ala-D-Ala dipeptide, een deel van de celwand, welke bij Gram-positieve bacteriën het doel is van glycopeptide antibiotica. Omdat VanA en VanB overdraagbaar zijn via plasmiden, vormen deze een grote bedreiging. De andere resistentiegenen zijn chromosomaal en dus niet overdraagbaar op andere bacteriën.8

Het VanA gen codeert voor een ligase die D-alanine met D-lactaat (D-Ala-D-Lac) bindt, in plaats van de twee D-alanines. Wanneer D-Ala-D-Lac wordt gebonden aan het celmembraan tijdens de celwandsynthese, wordt er een andere pentapeptide gevormd. Wanneer vancomycine aan dit pentapeptide wilt binden, is de binding minder sterk dan wanneer deze aan D-Ala-D-Ala bindt. Het micro organisme gaat verder met de celwandsynthese, en vancomycine is inactief geworden (Afbeelding 5). VanA resistentiegenen worden het meest gezien in E.faecium maar ook in E.faecalis, E.durans, E.gallinarum en in E.avium. Het resistentiepatroon van micro organismen met het VanA gen is een hoge resistentie voor vancomycine (MIC >256 µg/ml) samen met een resistentie voor teicoplanine (MIC 16-512 µg/ml).

Het VanB gen wordt vaak gezien in E.faecium en E.faecalis. Deze micro organismen hebben een variabele resistentie tegen vancomycine en zijn vaak gevoelig voor teicoplanine.10

Afbeelding 5: Het werkingsmechanisme van Vancomycine resistentie. (NAM= N-acetylmuramic acid

(13)

A. de Wit 13

2.1.3. Gentamycine resistentie

Gentamycine is een aminoglycoside antibiotica die werkt op de eiwitsynthese van een micro-organisme. Wanneer een micro organisme resistent is tegen gentamycine valt dit micro organisme alleen onder BRMO’s wanneer deze resistentie samen gaat met resistentie tegen quinolonen.16

Resistentie tegen aminoglycosiden komt voor in zowel positieve als in Gram-negatieve bacteriën. Inactivering van aminoglycosiden is het belangrijkste mechanisme van resistentie tegen deze groep antibiotica, terwijl ribosomale modificatie en verminderde permeabiliteit ook kan leiden tot resistentie. De enzymen die verantwoordelijk zijn voor de inactivering worden ingedeeld in drie klassen, afhankelijk van het type modificatie dat de inactivering veroorzaakt: de phosphotransferases (APH), acetyltransferases (AAC) en nucleotidyltransferases (ANT). De genen zijn, binnen de enzymklassen, nauw verwant met elkaar. Bijvoorbeeld de APH(3’) enzymen van Streptococcen en Stapylococcen lijken erg op elkaar, net als de enzymen in Gram-negatieve transposons (Tn) Tn5 en Tn903. Er zijn echter minder overeenkomsten tussen de enzymen van positive en negatieve bacteriën. De genen van de Gram-negatieven lijken zelfs meer op een gen van Streptomyces fradiae (een schimmel), dan op de genen van Gram-positieven.8

2.2. ESwab en CultureSwab EZ

Om patiëntenmaterialen af te nemen wordt er gebruik gemaakt van afnameswabs. In deze paragraaf worden de huidige BBL CultureSwab EZ (BD) en de nieuwe Liquid Amies Elution Swab (Copan) besproken.

2.2.1. BBL CultureSwab EZ

De BBL CultureSwab EZ van BD is een steriele wattenstok voor het afnemen van kweken. De swab bestaat uit een polyurethaan tip die aan een plastic steel is bevestigd, deze steel is aan de dop bevestigd. De swab is in een plastic buis geplaatst, en hierdoor blijft deze steriel.

Omdat de tip van polyurethaan niet toxisch is, kan het

transport van micro-organismen zonder transportmedium plaats vinden. Hierdoor wordt het afname materiaal niet verdund, en kan overgroeiing van bacteriën worden voorkomen.1

2.2.2. ESwab

De Liquid Amies Elution Swab (Eswab) Collection and Transport System is een swab die voor meerdere doeleinden bacteriën kan verzamelen en transporteren, waarbij aerobe- en anaerobe bacteriën en bacteriën met specifieke leefomstandigheden tot 48 uur bewaard kunnen worden.2 _{De Eswab bestaat uit}

nylon vezels die recht op het stokje zitten waardoor de verzamelde bacteriën in zijn geheeld loslaten. Bij de huidige CultureSwab EZ raken de bacteriën “verstrikt” in de swab, en is de opbrengst lager. Ook heeft de ESwab een hogere opnamecapaciteit en een betere materiaalafgifte in het Amies medium door de structuur van de ESwab.12,13

Afbeelding 6: De structuur van de CultureSwab EZ.

Afbeelding 7: De structuur van de ESwab.

(14)

A. de Wit 14

2.3. Huidige detectiemethode BRMO

Met de huidige werkwijze worden alleen risicopatiënten en bekend positieve patiënten gescreend op BRMO. Risicopatiënten zijn patiënten die rechtstreeks worden overgenomen op de intensive care vanuit een intensive care afdeling van een buitenlands ziekenhuis, patiënten die worden overgenomen van een ander Nederlands ziekenhuis, van een afdeling waar een BRMO epidemie heerst die nog niet onder controle is en patiënten die met een andere patiënt met BRMO in contact is geweest. Wanneer een patiënt met BRMO wordt opgenomen op de IC wordt van deze patiënt twee maal per week een urine en sputumkweek opgevangen om te screenen op BRMO. Wanneer er op een andere afnameplaats een BRMO is gekweekt wordt deze afnameplaats ook meegenomen, bijvoorbeeld de keel, perineum of wonden. Patiënten bekend met een BRMO op een andere verpleegafdeling dan de IC worden wekelijks gescreend op BRMO in de keel en perineum. Ook hierbij geldt als er op een ander afnameplaats een BRMO gekweekt is wordt deze afnameplaats ook meegenomen.6

Wanneer een kweek binnenkomt op het laboratorium wordt deze aangevraagd met de vraagstelling BRMO, en geënt op een verrijkt medium, bloedagar. Na een incubatietijd van 18-24 uur bij 35°C wordt de plaat beoordeeld op de aanwezigheid van pathogene bacteriën. Wanneer deze aanwezig zijn wordt hiervan een identificatie (naam) en resistentiepatroon op de Vitek ingezet. De Vitek is een analyser die middels fluorescentietechnologie een betrouwbare identificatie geeft van de micro-organismen. De dag na het inzetten van de Vitek is de naam en het resistentiepatroon bekend van het micro organisme. Volgens Tabel 1 wordt beoordeeld of er sprake is van een BRMO of niet.

Tabel 1: Definitie BRMO. Welke antibioticagroep(en) zijn (is) resistent wanneer het micro-organisme een

BRMO genoemd mag worden.16

Antibioticagroepen Micro-organismen A m in o gl yc o si d en C arba p en em ase C ef ta zi d im e C o tr im ox azo l E S B L Pen ici lli n e Pi p era ci lli n e Qu in o lo n en V an co m yc in e E.coli B A - - A - - B - Klebsiella spp. B A - - A - - B - Enterobacteriaceae (overige) B A - - A - - B - Acinetobacter spp. B C B - A - - B - Stenotrophomonas maltophilia - - - A - - - -

-Non fermenters (overige) C C C - A - C C -

S. pneumoniae - - - A - - A

E. faecium - - - B - - B

A: Indicatie voor BRMO.

B: Resistentie voor antibiotica uit ten minste twee groepen is een indicatie voor BRMO. C: Resistentie voor antibiotica uit ten minste drie groepen is een indicatie voor BRMO.

Voor de detectie van ESBL door de Vitek wordt het breekpunt >1mg/L (ongevoelig) voor cefotaxime en ceftazidime gebruikt voor Enterobacteriaceae. Vervolgens wordt gekeken

(15)

A. de Wit 15 Positief:

ESBL

of de stam tot groep I of groep II behoort, waarop de ESBL confirmatie uitgevoerd wordt door middel van de E-test. In tabel 2 is te zien wanneer het om een groep I of II gaat en welke E-testen er worden ingezet.

* n.t.b. Out of range (MRC > E-test strip) bij één van de twee strips.

Bij de Enterobacteriaceae uit groep I worden de E-testen uitgevoerd met zowel cefotaxime als ceftazidime. Indien deze niet te beoordelen zijn omdat ze out-of-range zijn, dient ook een cefepime E-test te worden uitgevoerd.Bij de Enterobacteriaceae uit groep II wordt allen de cefepime E-test uitgevoerd, indien de te onderzoeken stam ook resistent is tegen tenminste twee andere antimicrobiële klasses (quinolonen, cotrimoxazol, aminoglycosides, nitrofurantoïne).Bij het beoordelen van de ESBL E-testen worden de MRC-waarden afgelezen op het snijpunt van de door totale groeiremming gevormde ellips en de rand van de strip. Als de geteste stam ESBL positief is, dan is de MRC waarde met clavulaanzuur veel lager dan de MRC waarde zonder clavulaanzuur, dit scheelt minstens een factor 8. Ook is een stam altijd ESBL positief als er een fantoomeffect (zie Afbeelding 8) te zien is bij één van de E-testen, ongeacht het testresultaat. Wanneer er geen sprake is van de twee bovenstaande gevallen, is de stam ESBL negatief. Wanneer de MRC waarden wel heel hoog zijn, kan dat wijzen op de aanwezigheid van andere resistentie mechanismen.15

ESBL Screening

Verhoogde gevoeligheid voor Ceftazidim en/of Cefotaxim of

geautomatiseerd systeem positief

Geen ESBL -

Species determinatie +

Groep I: E.coli, Klebsiella spp., P. mirabilis,

Salmonella spp., Shigella spp.

Groep II: Species met chromosomal AmpC gen: Enterobacter spp., Citrobacter freundii,

Morganella morganii, Providencia spp., Hafnia alvei, Serratia spp.

ESBL confirmatie Met ceftazidim en cefotaxim +_/

- clavulaanzuur (ESBL E-test TZ/TZL en CT/CTL) Negatief: geen ESBL n.t.b. * ESBL confirmatie Met cefepim +_/ - clavulaanzuur (ESBL E-test PM/PML) Negatief: geen ESBL n.t.b.* Positief: ESBL Tabel 2: ESBL-detectie algoritme voor Enterobacteriaceae15

Afbeelding 8 Fantoomeffect. Een ESBL

E-test cefepime met in het midden een fantoomeffect.

(16)

A. de Wit 16 Voor de detectie van carbapenemase bij Enterobacteriaceae wordt er gelet op de MIC waarde van de carbapenem antibiotica, imipenem en meropenem. Wanneer de Vitek een MIC van ≥0,5 mg/L voor meropenem en/of een MIC van ≥2,0 mg/L voor imipenem heeft gemeten, wordt de confirmatie voor carbapenemase ingezet met behulp van de E-testen imipenem en meropenem. Wanneer de E-test voor imipenem ≥2,0 mg/L en/of de MIC voor meropenem ≥0,5 mg/L dan wordt de stam opgestuurd voor carbapenemase screening naar een referentielaboratorium. Wanneer de uitslag van de E-testen lager is dan de eerder gegeven waarden, is de stam carbapenemase negatief.

Een VRE stam wordt ontdekt doordat de vitek deze stam als vancomycine resistent heeft afgegeven. Na deze bevinding wordt de stam nog gecontroleerd met een vancomycine E-test.

Een gentamycine resistente stam valt alleen onder BRMO’s wanneer deze resistentie gepaard gaat met quinolonen resistentie. Deze BRMO wordt ontdekt nadat het resistentiepartoon uit de vitek bekend is.

Uiteindelijk heeft een ESBL positieve stam drie dagen nodig om als een ESBL positieve stam gerapporteerd te worden. Voor een carbapenemase stam is dit veel langer doordat deze naar een referentielaboratorium opgestuurd wordt. Voor een VRE stam is deze weg net als de ESBL stam 3 dagen. Een gentamycine resistente stam doet er 2 dagen over om gerapporteerd te worden. Echter moet bij deze uitspraken er van uit worden gegaan dat de stam een goed groeiende stam is, en na 18-24 uur incuberen de stam voldoende gegroeid is om de vitek in te zetten. Wanneer dit niet het geval is, of de stam is niet rein, komt er nog een dag extra bij deze tijden bij.

(17)

A. de Wit 17

3. Materiaal en methoden

3.1. Bacteriestammen

Voor het onderzoek zijn bacteriestammen verzameld met verschillende resistentiepatronen. Dit zijn bijvoorbeeld E.coli ESBL positief, K.pneumoniae ESBL positief, P.aeruginosa Carbapenemase negatief, M.morganii Carbapenemase positief, E.coli Carbapenemase positief, E.faecalis Vancomycine gevoelig, E.faecium Vancomycine gevoelig en ongevoelig (VRE) en Gentamycine ongevoelige P.aeruginosa. Voor het complete overzicht zie bijlage I.

De stammen zijn ingevroren bij -70°C. Voor gebruik van deze stammen werden deze eerst twee maal rein geënt op een bloedagar.

3.2. Het oefenen van een verdunningsreeks

Voordat gestart werd met het project was het belangrijk om de techniek om een verdunningsreeks te maken onder de knie te hebben. Om dit te oefenen werden verdunningsreeksen gemaakt van een 0,5 McFarland suspensie, dit staat gelijk aan 1,5·108_KVE/ml2_{, van S.aureus, E.faecalis, E.coli en K.pneumoniae. Van deze suspensies} werden met behulp van FZ een verdunningsreeks gemaakt van 1,5·108_{t/m 1,5·10}1 KVE/ml. Van deze verdunningen werd 10µl op een bloedagar gepipetteerd en met behulp van een steriele spatel uitgespreid over de plaat. De platen werden gedurende 18-24u bij 35°C geïncubeerd, en de volgende dag werden de platen beoordeeld op het aantal KVE.

3.3. Maken van verdunningsreeksen op specifieke platen

Omdat de ESBL, CRE, VRE en gentamycine agar volledig onbekend zijn bij het SJG Weert, is het van belang om te weten wat de minimale concentratie micro organismen is wat deze platen nog detecteren. Voor dit onderzoek werd een verdunningsreeks gemaakt van de stammen die in Tabel 3 staan. Om de verdunningsreeks te maken werd een 0,5 McFarland suspensie in FZ gemaakt, en vanuit deze suspensies werden de verdunningsreeksen gemaakt van 1,5·108_{t/m 1,5·10}1_{KVE/ml in FZ. Van deze} verdunningsreeksen werd 10µl op ¼ plaat gepipetteerd, en met een ose uitgestreken. De platen werden gedurende 18-24u geïncubeerd bij 35°C. Na incubatie werden de platen beoordeeld op de hoeveelheid groei per kwadrant, daarna werden de platen nogmaals 18-24u geïncubeerd bij 35°C.

Tabel 3: De bacteriestammen die zijn gebruikt voor de verdunningsreeks op de specifieke platen.

Stamnummer Bacteriestam Voedingsbodem Stamnummer Bacteriestam Voedingsbodem

2 P.aeruginosa CRE + Genta 23 E.faecalis VRE

5 P.aeruginosa CRE + Genta 25 K.pneumoniae Genta

7 P.aeruginosa CRE + Genta 28 M.morganii CRE

8 E.coli ESBL 29 K.pneumoniae CRE

10 E.coli ESBL 30 K.oxytoca ESBL

13 E.faecium VRE 31 K.pneumoniae ESBL

16 E.faecium VRE 35 E.coli ESBL

20 E.faecium VRE 36 E.cloacae ESBL

21 E.faecalis VRE 39 C.freundii ESBL

(18)

A. de Wit 18

3.4. De invloed van patiëntenmateriaal op specifieke platen

Het is van belang om de platen ook te testen met patiëntmateriaal, om na te gaan of er storende factoren aanwezig kunnen zijn van de patiëntenmaterialen die als vals positief beschouwd kunnen worden. Voor dit onderzoek werd een verdunningsreeks gemaakt van de stammen die te vinden zijn in Tabel 4. Om de verdunningsreeks te maken werd een 0,5 McFarland suspensie in FZ gemaakt, en vanuit deze suspensies werden de reeksen gemaakt van 1,5·108_{t/m 1,5·10}1_{KVE/ml in FZ. Per stam werden drie verdunningen} meegenomen: 1,5·102_{- 1,5·10}3_-1,5·104_{, deze verdunningen gelden voor CRE, VRE en} genta stammen. Voor de ESBL stammen gelden de verdunningen: 1,5·101_-1,5·102 -1,5·103_{. Naar aanleiding van de resultaten van het experiment uit § 3.3 zijn is voor deze} verdunningen gekozen. Voor de verdunning van 1,5·102_{werd er 100µl stam verdunning} 1,5·103 _{aan 900µl faeces toegevoegd. Dit is op deze manier voor alle stammen en} verdunningen gedaan. Van elke stam/faeces suspensie werd 10µl op de betreffende specifieke plaat gepipetteerd, en met een ose werd de reinstrijk gemaakt. De platen werden gedurende 18-24 uur geïncubeerd bij 35°C. Na incubatie werden de platen afgelezen per verdunning op de hoeveelheid groei, en de kleur van de kolonies. Alle platen werden nogmaals overnacht geïncubeerd bij 35°C.

Tabel 4: De bacteriestammen die zijn gebruikt voor de invloed van patiëntmateriaal op de specifieke platen.

1 P.aeruginosa CRE 26 P.aeruginosa Genta

2 P.aeruginosa Genta 28 M.morganii CRE

3 P.aeruginosa CRE 29 K.pneumoniae CRE

4 P.aeruginosa CRE 30 K.oxytoca ESBL

6 P.aeruginosa Genta 31 K.pnuemoniae ESBL

9 E.coli ESBL 32 K.pneumoniae ESBL

18 E.faecium VRE 36 E.cloacea ESBL

19 E.faecium VRE 37 E.faecium VRE

21 E.faecalis VRE 38 E.faecium VRE

22 E,faecalis VRE 39 C.freundii ESBL

25 K.pneumoniae Genta

3.5. ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ

Wanneer er een wonduitstrijk binnenkomt, kan deze aangevraagd zijn op banale-, anaerobe kweek, BRMO en MRSA. Om al deze kweken in te zetten is het noodzakelijk om meerdere wattenstokken te krijgen. Met de ESwab is dit niet meer nodig. Om de ESwab te kunnen gaan gebruiken is het van belang om vooraf te weten of dat de ESwab dezelfde of zelfs een betere opbrengst van micro organismen heeft dan de huidige CultureSwab EZ. Ook is het belangrijk om te weten of er met de ESwab een ophoping nodig is. Met de huidige CultureSwab EZ is dit wel het geval, maar ophopen neemt één dag langer in beslag dan wanneer er niet opgehoopt zou worden. In dit onderzoek is er opgehoopt in Nutriënt Broth. Om dit alles te testen werd van de bacteriestammen die weergegeven zijn in Tabel 5 een suspensie in FZ gemaakt van 0,5 McFarland. Deze McFarland waarde staat gelijk aan 1,5·108_{KVE/ml. Deze suspensie werd in FZ} doorverdund tot een uiteindelijke verdunning van 1,5·102_{KVE/ml. Per stam zijn vier} verdunningen meegenomen: 1,5·102_{- 1,5·10}3_{- 1,5·10}4_{- 1,5·10}5_{KVE/ml, deze} verdunningen gelden voor CRE, VRE en genta stammen. Voor de ESBL stammen gelden

(19)

A. de Wit 19 de verdunningen: 1,5·101_-1,5·102_-1,5·103 _{- 1,5·10}4 _{KVE/ml. In deze verdunningen} werden per stam twee CultureSwabs en één ESwab gedompeld. De ESwab en één CultureSwab worden gedurende 0-4 uur opgeslagen in de koelkast, de andere CultureSwab EZ werd overnacht opgeslagen in de koelkast. Ook zijn er acht stammen meteen na het enten van de swabs op de platen en in de Nutriënt Broth geënt. Na de vier uur opslagtijd is elke swab afgeënt op een bloedplaat, de betreffende specifieke plaat en een Nutriënt Broth buis voor de ophoping. De ESwab ging terug de koelkast in voor de opslagtijd van 24 uur (overnacht). De platen en de Nutriënt Broth zijn gedurende 18-24 uur geïncubeerd bij 35°C. Na incubatie zijn de platen beoordeeld op de hoeveelheid groei. Alle platen zijn nogmaals 18-24 uur geïncubeerd. Ook zijn, na incubatie, de Nutriënt Broth buizen over geënt op een bloedplaat en de betreffende specifieke plaat. Na de opslagtijd van 18-24 uur (overnacht) van de swabs is hetzelfde uitgevoerd als bij de swabs met 0-4u opslagtijd.

Tabel 5: Bacteriestammen die zijn gebruikt voor het vergelijken van de ESwab met de CultureSwab EZ

2 P.aeruginosa CRE 26 P.aerguginosa Genta

5 P.aeruginosa Genta 27 P.aeruginosa CRE

6 P.aeruginosa CRE + Genta 28 M.morganii CRE

9 E.coli ESBL 29 K.pneumoniae CRE

12 E.coli ESBL 30 K.oxytoca ESBL

20 E.faecium VRE 36 E.cloaecea ESBL

22 E.faecalis VRE 37 E.faecium VRE

25 K.pnuemoniae Genta

3.6. De invloed van patiëntmateriaal op de ESwab en de CultureSwab

Omdat de ESwab mogelijk gebruikt gaat worden om patiëntenmaterialen in te zetten, is het van belang om te weten wat voor invloed patiëntenmaterialen hebben op de ESwab, en of dat de ESwab ook mèt patiëntenmaterialen niet onder doet aan de CultureSwab EZ. Om dit uit te zoeken is een combinatie gemaakt van de experimenten die beschreven zijn in paragraaf 3.4 en 3.5. Er is op dezelfde manier als in paragraaf 3.4 een

verdunningsreeks gemaakt met dezelfde verdunningen. In de eindverdunningen met faeces zijn op dezelfde manier de ESwab en CultureSwab EZ gedompeld. Bij dit

experiment zijn de swabs 0-4 uur in de koelkast opgeslagen. De platen zijn gedurende 18-24u bij 35°C geïncubeerd, en na incubatie beoordeeld op de hoeveelheid groei en eventuele storende factoren. Alle platen zijn nog een overnachting terug in de stoof bij 35°C gezet. De bacteriestammen die zijn gebruikt voor dit experiment staan in Tabel 6.

(20)

A. de Wit 20 Tabel 6: Bacteriestammen die zijn gebruikt voor de invloed van patiëntenmaterialen op de ESwab en de

CultureSwab EZ.

5 P.aeruginosa CRE 29 K.pneumoniae CRE

7 P.aeruginosa CRE 30 K.oxytoca ESBL

10 E.coli ESBL 36 E.cloacea ESBL

13 E.faecium VRE 37 E.feacium VRE

15 E.faecium VRE 38 E.faecium VRE

16 E.faecium VRE 39 C.freundii ESBL

17 E.faecium VRE 41 E.coli CRE

23 E.faecalis VRE 42 P.mirabilis CRE

24 E.faecalis VRE 44 K.pneumoniae CRE

26 P.aeruginosa Genta 45 C.freundii ESBL

27 P.aeruginosa CRE 49 E.coli Genta

(21)

A. de Wit 21

4. Resultaten

Omdat het onderzoek uit meerdere onderdelen bestaat, zijn de resultaten hier ook naar ingedeeld. Alle platen zijn beoordeeld met sporadisch, +, ++. +++ zie Tabel 7. Wanneer het mogelijk was, zijn de kolonies geteld.

Tabel 7: Beoordeling van de voedingsbodems

Beoordeling Aantal kolonies op de plaat

Sporadisch Minder dan 10 kolonies

+ Alleen op het aanstrijkgebied wat (10-100) kolonies ++ Alleen het aanstrijkgebied vol met kolonies

+++ Op het aanstrijkgebied en andere ent gedeeltes kolonies

4.1. Het oefenen van een verdunningsreeks

In Tabel 8 is te zien dat de verdunningsreeksen die gemaakt zijn, mooi oplopende reeksen zijn. Met deze resultaten is er bewezen dat het maken van een verdunningsreeks netjes verloopt, en er van uit gegaan kan worden dat de verdunningsreeksen die bij de andere onderzoeken gemaakt zijn, betrouwbaar zijn.

Tabel 8: Resultaten van het oefenen van een verdunningsreeks met de bacteriestammen S.aureus, E.faecalis, E.coli en K.pneumoniae.

Aantal KVE/10µl

Verdunning (1,5·…KVE.ml) S.aureus E.faecalis E.coli K.pneumoniae

108 _>500 _>500 _>500 _>500 107 _>500 _>500 _>500 _>500 106 _>500 _>500 _>500 _>500 105 _±400 _>500 _>500 ₃₆₀ 104 ₃₄ ₉₂ ₅₀ ₆₃ 103 ₅ ₁₁ ₄ ₁₁ 102 ₀ ₁ ₀ ₂ 101 ₀ ₀ ₀ ₀

Fysiologisch zout controle 0 0 0 0

Spatel controle 0

4.2. Maken van verdunningsreeksen op specifieke platen

Voor het maken van de verdunningsreeksen op de specifieke platen zijn vier verschillende platen gebruikt, de ESBL-, VRE-, CRE- en Genta plaat. De resultaten zijn ingedeeld in de verschillende categorieën van BRMO’s.

Voor het opstellen van de resultaten zijn niet alleen de ”echte” BRMO’s gebruikt, zoals E.coli ESBL positief, E.faecium Vancomycine resistent, K.pneumoniae Carbapenemase positief en P.aeruginosa Gentamycine resistent, maar ook de negatieve stammen zijn meegenomen in de resultaten.

(22)

A. de Wit 22

4.2.1. ESBL plaat

Grafiek 1: Verdunningsreeks ESBL plaat In bovenstaande grafiek is het aantal stammen die groeien bij elke

verdunning per groeidichtheid weergeven. De X-as geeft de verdunningsreeks weer in KVE/ml. De Y-as geeft het aantal stammen die groeien weer. Onder de grafiek staat de legenda waar onderscheid wordt gemaakt tussen geen groei, sporadisch, enkele, meerdere en veel groei. Het aantal ESBL stammen die gebruikt zijn is 10. De gebruikte stammen zijn: E.coli, K.pneumoniae, K.oxytoca, E.cloacea en C.freundii.

Van de 10 ESBL stammen die zijn meegenomen bleek één stam geen ESBL te zijn, dit is gecontroleerd met een ESBL E-test. Deze stam is in Grafiek 2 te zien bij de verdunningen 1,5·107_{en 1,5·10}8_{KVE/ml als de sporadisch gegroeide stam. De andere stammen (n=7)} groeiden vooral tot een verdunning van 1,5·102_{KVE/ml. Twee andere stammen groeiden} tot een verdunning van 1,5·103_{KVE/ml. De minimale range die voor de ESBL plaat geldt} is 150-1500 KVE/ml.

4.2.2. VRE plaat

Grafiek 2: Verdunningsreeks VRE plaat In bovenstaande grafiek is het aantal stammen die groeien bij elke

verdunning per groeidichtheid weergeven. De X-as geeft de verdunningsreeks weer in KVE/ml. De Y-as geeft het aantal stammen die groeien weer. Onder de grafiek staat de legenda waar onderscheid wordt gemaakt tussen geen groei, sporadisch, enkele, meerdere en veel groei. Het aantal VRE stammen die gebruikt zijn is 8. De gebruikte stammen zijn: E.faecalis (Vancomycine gevoelig) en E.faecium (Vancomycine gevoelig en ongevoelig).

Van de acht stammen die verzameld zijn, groeiden slechts twee stammen goed op deze plaat. De andere zes stammen zijn Vancomycine gevoelige stammen en horen ook niet op deze plaat te groeien. Eén stam groeide tot een verdunning van 1,5·103_{KVE/ml. De} andere stam groeide niet als echte kolonies, maar als een waas, tot de verdunning 1,5·104_{KVE/ml. Een van de zes stammen die Vancomycine gevoelig is groeide met één} kolonie op de verdunning 1,5·108_{KVE/ml. Dit is te verwachten, omdat de plaat deze}

0 2 4 6 8 10 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 A a n ta l sta mm en (n = 1 0 ) Verdunning (1,5·...KVE/ml)

Veel (+++) Meerdere (++) Enkele (+) Sporadisch Geen groei

0 2 4 6 8 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 A an tal s tamm en (n = 8 ) Verdunning (1,5·...KVE/ml)

(23)

A. de Wit 23 stammen remt, en niet zorgt dat deze helemaal niet groeien. De range van de VRE plaat is 1.500 – 15.000 KVE/ml.

4.2.3. CRE plaat

Grafiek 3: Verdunningsreeks CRE plaat. In bovenstaande grafiek is het aantal stammen die groeien bij elke

verdunning per groeidichtheid weergeven. De X-as geeft de verdunningsreeks weer in KVE/ml. De Y-as geeft het aantal stammen die groeien weer. Onder de grafiek staat de legenda waar onderscheid wordt gemaakt tussen geen groei, sporadisch, enkele, meerdere en veel groei. Het aantal CRE stammen die gebruikt zijn is 5. De gebruikte stammen zijn: P.aeruginosa, M.morganii en K.pneumoniae.

Zoals te zien in Grafiek 3 is er maar één stam die groeit. De andere stammen zijn stammen die volgens het protocol opgestuurd zijn naar een referentielaboratorium voor typering, en als Carbapenemase negatief terug zijn gekomen. De stam die wel groeide, groeide tot een verdunning van 1,5·103_{KVE/ml. Één Carbapenemase negatieve stam} vertoonde bij de verdunning 1,5·108_{KVE/ml gele kolonies van verschillende grootten. De} range van de CRE plaat is 1.500 KVE/ml.

4.2.4. Genta plaat

Grafiek 4: Verdunningsreeks Genta plaat. In bovenstaande grafiek is het aantal stammen die groeien bij

elke verdunning per groeidichtheid weergeven. De X-as geeft de verdunningsreeks weer in KVE/ml. De Y-as geeft het aantal stammen die groeien weer. Onder de grafiek staat de legenda waar onderscheid wordt gemaakt tussen geen groei, sporadisch, enkele, meerdere en veel groei. Het aantal Genta stammen die gebruikt zijn is 4. De gebruikte stammen zijn: P.aeruginosa en K.pneumoniae.

In Grafiek 4 is te zien dat er slechts één stam groeide op de Genta plaat. Deze stam groeide tot een verdunning van 1.500 KVE/ml. Van de andere stammen bleken er twee geen Gentamycine resistente stammen te zijn. De range van de Genta plaat is 1.500 KVE/ml. 0 1 2 3 4 5 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 A a n ta l sta mmen (n = 5 ) Verdunning (1,5·…KVE/ml)

Veel (+++) Meerdere (++) Enkele (+) Sporadisch Geen groei

0 1 2 3 4 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 A a n ta l sta mmen (n = 4 ) Verdunning (1,5·… KVE/ml)

(24)

A. de Wit 24

4.3. De invloed van patiëntmateriaal op specifieke platen 4.3.1. ESBL plaat

Op de bloedagar, die als groeicontrole is meegenomen, is bij alle drie de verdunningen (1,5·101_{, 1,5·10}2_{en 1,5·10}3_{KVE/ml) veel groei aangetoond, dit houdt in dat de faeces} genoeg micro organismen bevat die een storende factor kunnen hebben op de ESBL plaat.

Op de ESBL plaat is bij alle drie de verdunningen een blauwe waas zichtbaar (Afbeelding 9). Deze waas is afkomstig van de E.coli die als commensale flora aanwezig is in faeces. Deze blauwe waas bemoeilijkt het aflezen van de platen wanneer er blauwe of groene kolonies groeien. Echter zijn deze kolonies na 24-48 uur incuberen wel duidelijk te onderscheiden van de waas. Voor dit onderzoek zijn tien stammen gebruikt hiervan was één stam geen ESBL stam, en één stam bevatte een besmetting waardoor deze resultaten niet betrouwbaar zijn. Van de overige stammen groeiden vier stammen door tot een

verdunning van 1,5·102_{KVE/ml, de andere vier stammen groeide door tot een} verdunning van 1,5·103_{KVE/ml. Dit is ook te zien in Tabel 9. De range van de plaat is} met patiëntenmateriaal hetzelfde als zonder patiëntenmateriaal, namelijk 150-1.500 KVE/ml.

Tabel 9: Het aantal ESBL stammen dat bij welke verdunning groeit (n=8). Detectiegrens (KVE/ml) Aantal stammen (n=8)

15 0

150 4

1.500 4

Op de bloedagar, die als groeicontrole is meegenomen, is bij alle drie de verdunningen (1,5·102_{, 1,5·10}3_{en 1,5·10}4_{KVE/ml) veel groei aangetoond, dit houdt in dat de faeces} genoeg micro organismen bevat die een storende factor kunnen hebben op de VRE plaat. Op de VRE plaat is bij alle drie de verdunningen een lichte paarse waas zichtbaar. Deze waas is afkomstig van de Enterococcen die als commensale flora aanwezig zijn in faeces. Deze paarse waas stoort niet bij het aflezen van de platen, de kolonies die groeien zijn goed te onderscheiden hiervan. Voor dit onderzoek zijn acht stammen gebruikt, hiervan waren vijf stammen gevoelig voor Vancomycine, en groeiden niet op de plaat. Twee stammen groeide tot de verdunning 1,5·103 _{KVE/ml. Eén stam groeide op alle drie de} verdunningen. Dit is ook te zien in Tabel 10. De range van de plaat is niet beïnvloed door het patiëntenmateriaal en is 150-1.500 KVE/ml, dit is zelfs een verdunning hoger dan eerder getest.

Tabel 10: Het aantal VRE stammen dat bij welke verdunning groeit (n=3). Detectiegrens (KVE/ml) Aantal stammen (n=3)

150 1

1.500 2

15.000 3

Op de bloedagar, die als groeicontrole is meegenomen, is bij alle drie de verdunningen (1,5·102_{, 1,5·10}3_{en 1,5·10}4_{KVE/ml) veel groei aangetoond, dit houdt in dat de faeces}

Afbeelding 9: Blauwe waas op de ESBL plaat.

(25)

A. de Wit 25 genoeg micro organismen bevat die een storende factor kunnen hebben op de CRE plaat. Op de CRE plaat zijn geen storende factoren aangetoond.

Voor dit onderzoek zijn vijf stammen gebruikt, hiervan waren vier stammen geen Carbapenemases, en groeiden niet op de plaat. Eén stam groeide door tot een verdunning van 1,5·103_{KVE/ml. De detectierange van de plaat is niet beïnvloed door het} patiëntmateriaal en is 1.500 KVE/ml.

Op de bloedagar, die als groeicontrole is meegenomen, is bij alle drie de verdunningen (1,5·102_{, 1,5·10}3_{en 1,5·10}4_{KVE/ml) veel groei aangetoond, dit houdt in dat de faeces} genoeg micro organismen bevat die een storende factor kunnen hebben op de Genta plaat.

Op de Genta plaat zijn geen storende factoren aangetoond.

Voor dit onderzoek zijn vier stammen gebruikt hiervan groeiden twee stammen pas na 24-48 uur incuberen. Eén stam groeide door tot de verdunning 1,5 ·102_{KVE/ml, en de} andere drie stammen groeiden door tot een verdunning hoger, 1,5·103 _{KVE/ml. Dit is ook} te zien in Tabel 11. De range van de plaat is niet beïnvloed door het patiëntmateriaal en is 150-1.500 KVE/ml, dit is zelfs een verdunning hoger dan eerder getest.

Tabel 11: Het aantal Genta stammen dat bij welke verdunning groeit (n=4). Detectiegrens (KVE/ml) Aantal stammen (n=4)

150 1

1.500 3

(26)

A. de Wit 26

4.4. ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ.

Om de resultaten van dit onderzoek betrouwbaar te maken, zijn alleen de “echte” BRMO stammen meegenomen. Bijvoorbeeld een vancomycine gevoelige E.faecalis is niet meegenomen bij de resultaten voor de VRE en een P.aeruginosa die voor carbapenemase is opgestuurd naar het referentielaboratorium en als negatief terug is gekomen is ook niet meegenomen in deze resultaten. Deze stammen zijn wel getest, maar vertoonden allemaal geen groei op de specifieke platen. In de tabellen zijn de gemiddelde waarde (het rondje), hoogst gemeten waarde (bovenste streepje) en de laagst gemeten waarden (onderste streepje) weergegeven. Wanneer deze waarden allemaal, zowel bij de ESwab als de CultureSwab EZ, gelijk zijn vallen al deze waarden op één punt.

4.4.1. ESBL plaat

In Afbeelding 10 is te zien dat er na 18-24 uur incuberen bij 35 °C nauwelijks verschil is tussen de gemiddelde groeidichtheden bij opslagtijden van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Dit geldt voor de directe methode, maar ook voor de ophopingsmethode. Er is wel verschil te zien in de hoogste en laagste gemeten groeidichtheid, maar de gemiddelden zijn vrijwel gelijk. Tussen de directe methode en de ophopingsmethode is wel duidelijk verschil te zien. Dit verschil is voornamelijk te zien in de groeidichtheid bij

0 1 2 3 4 10^1 10^2 10^3 10^4 Direct Na ophopen 0 1 2 3 4 10^1 10^2 10^3 10^4 Opslagtijd: 0-4 uur Opslagtijd: 24 uur (overnacht) 0 1 2 3 4 10^1 10^2 10^3 10^4 ESBL (n=9) 18-24u incuberen

Afbeelding 10: ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ op de ESBL plaat na 18-24 uur incuberen.

In bovenstaande afbeelding is de opbrengst van de ESBL stammen (n=9) na 18-24 uur incuberen weergegeven bij een opslagtijd van de swabs van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Wanneer de Swab direct op de platen is geënt, en na ophopen in Nutriënt broth. In de grafieken wordt per concentratie (X-as) de gemiddelde, de hoogste en de laagste gemeten groeidichtheid (Y-as) voor de ESwab (blauw) en de CultureSwab EZ (rood) weergegeven.

Groeidichtheid: 0 = Geen groei, 1 = sporadisch 2 = +, 3 = ++, 4 = +++ Gro ei d ic ht he id Verdunning (1,5 ·… KVE/ml) ESwab CultureSwab EZ 0 1 2 3 4 10^1 10^2 10^3 10^4

(27)

A. de Wit 27 de verdunningen. Deze is veel hoger dan zonder ophopen. Tussen de CultureSwab EZ en de ESwab is bij de directe methode nagenoeg geen verschil aangetoond, terwijl bij het ophopen wel verschil te zien is tussen de CultureSwab EZ en de ESwab. Dit is voornamelijk bij de lage verdunningen. De ESwab heeft bij de verdunning 1,5·102 KVE/ml nog stammen die geen groei vertonen, terwijl de CultureSwab EZ bij deze verdunning alle stammen veel groei hebben. Na 24-48 uur incuberen bij 35°C zijn precies dezelfde waarden gevonden. De exact gemeten waarden zijn terug te vinden in bijlage II.

In Afbeelding 11 is te zien dat er na 18-24 uur incuberen bij 35 °C nauwelijks verschil is tussen de gemiddelde groeidichtheden bij opslagtijden van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Dit geldt voor de directe methode, maar ook voor de ophopingsmethode. Er is wel verschil te zien in de hoogste en laagste gemeten groeidichtheid, maar de gemiddelden zijn vrijwel gelijk. Tussen de directe methode en de ophopingsmethode is wel duidelijk verschil te zien. Dit verschil is voornamelijk te zien in de groeidichtheid bij de verdunningen. Deze is veel hoger bij het ophopen dan zonder ophopen. Tussen de CultureSwab EZ en de ESwab is bij de directe methode nagenoeg geen verschil

Direct Na ophopen Opslagtijd: 0-4 uur Opslagtijd: 24 uur (overnacht) VRE (n=3) 18-24u incuberen

Groeidichtheid: 0 = Geen groei, 1 = sporadisch 2 = +, 3 = ++, 4 = +++ Gro ei d ic ht he id Verdunning (1,5 ·… KVE/ml) ESwab CultureSwab EZ 0 1 2 3 4 10^2 10^3 10^4 10^5 0 1 2 3 4 10^2 10^3 10^4 10^5 0 1 2 3 4 10^2 10^3 10^4 10^5 0 1 2 3 4 10^2 10^3 10^4 10^5

Afbeelding 11: ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ op de VRE plaat na 18-24 uur incuberen.

In bovenstaande afbeelding is de opbrengst van de VRE stammen (n=3) na 18-24 uur incuberen weergegeven bij een opslagtijd van de swabs van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Wanneer de Swab direct op de platen is geënt, en na ophopen in Nutriënt broth. In de grafieken wordt per concentratie (X-as) de gemiddelde, de hoogste en de laagste gemeten groeidichtheid (Y-as) voor de ESwab (blauw) en de CultureSwab EZ (rood) weergegeven.

(28)

A. de Wit 28 aangetoond in de gemiddelden. Bij het ophopen is er tussen de CultureSwab EZ en de ESwab ook bijna geen verschil. Het enige verschil ligt bij de laagste verdunning bij de hoogst gemeten waarde. De exact gemeten waarden zijn terug te vinden in Bijlage III.

In Afbeelding 12 is vrijwel hetzelfde te zien als in Afbeelding 11, maar in sommige gevallen is de hoogst gemeten waarde omhoog gegaan doordat de stammen nog een overnachting langer hebben kunnen groeien, hierdoor zijn die gemiddelden ook omhoog gegaan. Ook is na het ophopen bij een opslagtijd van 0-4 uur en bij de verdunning 1,5·105 _{KVE/ml de minimale groeidichtheid gestegen van geen groei naar sporadisch.} Uiteindelijk is het verschil tussen 18-24 uur en 24-48 uur incuberen heel minimaal, maar hieruit blijkt wel dat ophopen wel nodig is. De exact gemeten waarden zijn te vinden in bijlage III. Direct Na ophopen Opslagtijd: 0-4 uur Opslagtijd: 24 uur (overnacht) VRE (n=3) 24-48u incuberen

Afbeelding 12: ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ op de VRE plaat na 24-48 uur incuberen.

In bovenstaande afbeelding is de opbrengst van de VRE stammen (n=3) na 24-48 uur incuberen weergegeven bij een opslagtijd van de swabs van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Wanneer de Swab direct op de platen is geënt, en na ophopen in Nutriënt broth. In de grafieken wordt per concentratie (X-as) de gemiddelde, de hoogste en de laagste gemeten groeidichtheid (Y-as) voor de ESwab (blauw) en de CultureSwab EZ (rood) weergegeven.

(29)

A. de Wit 29

Bij de resultaten van dit onderzoek is er ook groei aangetoond bij stammen die CRE negatief zijn. Deze stammen zijn niet meegenomen bij het verwerken van de resultaten. De oorzaak van deze groei wordt in de discussie uitgelegd.

In Afbeelding 13 is te zien dat er na 18-24 uur incuberen bij 35 °C nauwelijks verschil is tussen de gemiddelde groeidichtheden bij opslagtijden van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Dit geldt voor de directe methode, maar ook voor de ophopingsmethode. Tussen de directe methode en de ophopingsmethode is wel duidelijk verschil te zien. Dit verschil is voornamelijk te zien in de groeidichtheid bij de verdunningen. Deze is veel hoger bij het ophopen dan zonder ophopen. Tussen de CultureSwab EZ en de ESwab is bij de directe methode nagenoeg geen verschil aangetoond in de gemiddelden. Bij het ophopen is er tussen de CultureSwab EZ en de ESwab ook bijna geen verschil. De gemiddelde groeidichtheid van de ESwab ligt bij 0-4 uur opslagtijd en bij de laagste verdunning lager dan de CultureSwab. Na 24-48 uur incuberen zijn exact dezelfde resultaten gevonden. De exact gemeten waarden zijn te vinden in bijlage IV.

Direct Na ophopen Opslagtijd: 0-4 uur Opslagtijd: 24 uur (overnacht) CRE (n=5) 18-24u incuberen

Afbeelding 13: ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ op de CRE plaat na 18-24 uur incuberen.

In bovenstaande afbeelding is de opbrengst van de CRE stammen (n=5) na 18-24 uur incuberen weergegeven bij een opslagtijd van de swabs van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Wanneer de Swab direct op de platen is geënt, en na ophopen in Nutriënt broth. In de grafieken wordt per concentratie (X-as) de gemiddelde, de hoogste en de laagste gemeten groeidichtheid (Y-as) voor de ESwab (blauw) en de CultureSwab EZ (rood) weergegeven.

(30)

A. de Wit 30

In Afbeelding 14 is te zien dat er na 18-24 uur incuberen bij 35 °C nauwelijks verschil is tussen de gemiddelde groeidichtheden bij opslagtijden van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Dit geldt voor de directe methode, maar ook voor de ophopingsmethode. Bij de directe methode is er alleen verschil bij de hoogste verdunning in de hoogst gemeten waarde bij de ESwab en de CultureSwab EZ, maar de gemiddelden zijn wel gelijk. Ook is de hoogst gemeten waarde van zowel de ESwab als de CultureSwab EZ bij de verdunning 1,5·103_{KVE/ml bij 4 uur opslagtijd hoger van bij een opslagtijd van 24 uur (overnacht).} Tussen de directe methode en de ophopingsmethode is wel duidelijk verschil te zien. Dit verschil is voornamelijk te zien in de groeidichtheid bij de verdunningen. Deze is veel hoger bij het ophopen dan zonder ophopen. Tussen de CultureSwab EZ en de ESwab zijn in de gemiddelden bijna geen verschillen aangetoond. De hoogst gemeten waarden verschillen soms wel met elkaar. De exact gemeten resulatetn zijn te vinden in bijlage V.

Direct Na ophopen Opslagtijd: 0-4 uur Opslagtij d: 24 uur (overnac ht) Genta (n=3) 18-24u incuberen

Afbeelding 14: ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ op de Genta plaat na 18-24 uur incuberen. In bovenstaande afbeelding is de opbrengst van de Genta stammen (n=3) na 18-24 uur

incuberen weergegeven bij een opslagtijd van de swabs van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Wanneer de Swab direct op de platen is geënt, en na ophopen in Nutriënt broth. In de grafieken wordt per concentratie (X-as) de gemiddelde, de hoogste en de laagste gemeten groeidichtheid (Y-as) voor de ESwab (blauw) en de CultureSwab EZ (rood) weergegeven.

(31)

A. de Wit 31

In Afbeelding 15 is vrijwel hetzelfde te zien als in Afbeelding 14, maar is er in sommige gevallen de hoogst- en/of laagst gemeten waarde omhoog gegaan doordat de stammen nog een overnachting langer hebben kunnen groeien, hierdoor zijn die gemiddelden ook iets omhoog gegaan. Ook is na het ophopen de minimale groeidichtheid gestegen van geen groei naar sporadisch of zelfs meer. Uiteindelijk is het verschil tussen 18-24 uur en 24-48 uur incuberen heel minimaal, maar wel nodig om de detectie optimaal te houden. De exact gemeten waarden zijn te vinden in bijlage V.

Direct Na ophopen Opslagtijd: 0-4 uur Opslagtijd: 24 uur (overnacht) Genta (n=3) 18-24u incuberen

Afbeelding 15: ESwab vergelijken met de CultureSwab EZ op de Genta plaat na 24-48 uur incuberen. In bovenstaande afbeelding is de opbrengst van de Genta stammen (n=4) na 24-48 uur

incuberen weergegeven bij een opslagtijd van de swabs van 0-4 uur en 24 uur (overnacht). Wanneer de Swab direct op de platen is geënt, en na ophopen in Nutriënt broth. In de grafieken wordt per concentratie (X-as) de gemiddelde, de hoogste en de laagste gemeten groeidichtheid (Y-as) voor de ESwab (blauw) en de CultureSwab EZ (rood) weergegeven.