103 6 6 14 14 104 + + + + 57 102 1 11 Geen groei 2 103 1 11 5 14 104 23 + 56 +
In bovenstaande tabel zijn alleen de positieve Genta stammen weergegeven. Zoals te zien is ook bij dit onderzoek belangrijk om de negatieve platen 24-48 uur te incuberen, aangezien er stammen zijn waarbij na 18-24 uur geen groei is en na 24-48 uur incuberen wel. De detectierange voor de Genta plaat met patiëntenmateriaal na 24-48 uur incuberen voor zowel de Eswab als de CultureSwab EZ is 150 KVE/ml. Dit betekent dat patiëntenmateriaal geen negatieve invloed heeft op de minimale range (deze is bepaald in §4.2.4) van de CRE plaat.
A. de Wit 35
5. Discussie
Bij het maken van een verdunningsreeks op de specifieke platen is gebruik gemaakt van positieve en negatieve stammen. Hierdoor zijn er resultaten waar geen of sporadisch groei bij aanwezig was. Bij de ESBL stammen bleek er één stam, een E.coli, niet te groeien op de ESBL plaat. Van deze stam is een ESBL E-test ingezet om na te gaan of de stam echt geen ESBL stam was. De E-testen waren negatief, en verklaren waarom de stam niet op de ESBL plaat groeide. Bij de volgende onderzoeken is deze stam dan ook niet meer gebruikt. Bij de VRE stammen groeiden slechts twee stammen goed op de VRE agar. Dit komt omdat alle andere stammen vancomycine gevoelige stammen waren. Deze stammen zijn meegenomen in het onderzoek om te controleren of de VRE plaat geen groei vertoont bij vancomycine gevoelige stammen. Omdat deze stammen meegenomen zijn, zijn er veel stammen zonder groei op de VRE plaat. Eén vancomycine gevoelige stam groeide wel op de VRE plaat bij een lage verdunning (1,5·108 KVE/ml). Dit is verklaarbaar omdat de plaat slechts de vancomycine gevoelige stammen remt.17 Van de CRE stammen die ingezet zijn, groeide slechts één stam. Alle andere stammen waren stammen met een MIC van ≥0,5 mg/L voor meropenem, en ≥2,0 mg/ml imipenem die naar het referentielaboratorium zijn gestuurd voor Carbapenemase fenotype, en als Carbapenemase negatief terug zijn gekomen. Van de genta stammen die zijn gebruikt voor dit onderzoek groeiden twee stammen pas na 24-48 uur incuberen op de plaat. Dit zou kunnen komen omdat er remmende factoren in de plaat aanwezig zijn, en de bacteriestammen langzamer groeien dan wanneer er een verrijkt medium zou zijn gebruikt. Voor alle geteste BRMO platen geldt dat de detectierange laag is. Wanneer er geen groei op de platen is, kan niet gezegd worden dat de screening negatief is, maar dat de bacterie niet aangetoond kan worden omdat het aantal aanwezige resistente bacteriën ook onder de detectiegrens kunnen liggen.
Wat betreft het testen van de invloed van patiëntenmateriaal op de specifieke platen, is naar voren gekomen dat patiëntenmateriaal alleen bij de ESBL- en VRE plaat een storende factor heeft. Op deze platen ontstaat een blauwe- (ESBL) en een paarse (VRE) waas. Deze waas is voor beide platen te verklaren omdat op de ESBL plaat een ESBL positieve E.coli blauw groeit. Een ESBL negatieve E.coli zal geremd worden op de plaat. Omdat een E.coli als commensaal voorkomt in de darmen, en dus in de faeces, is het vanzelfsprekend dat deze geremd op de plaat “groeit”. Voor de VRE plaat geldt hetzelfde, maar dan voor de E.faecalis. Ook dit is een bacterie die als commensaal voorkomt in de darmen. Een vancomycine resistente E.faecalis op de VRE plaat groeit als paarse kolonies, en een vancomycine gevoelige E.faecalis wordt geremd op de VRE plaat. Hierdoor wordt de paarse waas veroorzaakt.
Bij het vergelijken van de ESwab en CultureSwab EZ is vaak aangetoond dat de Eswab toch een lagere groeidichtheid heeft dan de CultureSwab EZ. Echter is dit verklaarbaar doordat bij de Eswab de stammen nog een extra stap verdund worden in het Amies medium. Hoewel de Eswab een minder hoge groeidichtheid heeft, worden de BRMO’s wel bij dezelfde verdunning aangetoond, maar in mindere mate. Ook bij dit onderzoek is naar voren gekomen dat de platen wanneer ze negatief zijn nogmaals overnacht geïncubeerd moeten worden. Vooral bij de VRE en genta stammen is dit gebleken. In dit onderzoek is naar voren gekomen dat de ophoping van de swabs niet kan verdwijnen bij gebruik van de Eswab.
A. de Wit 36 Van de CRE stammen die meegenomen zijn in het onderzoek, groeide één stam niet. Dit was een P.mirabilis. Echter was hier slechts maar één stam van, en kan er niet gezegd worden of dat het aan de plaat ligt, of aan de bacteriesoort. Er is wel nagegaan of er nog zo’n stam verkregen kon worden bij het laboratorium waar deze stam vandaan kwam, maar dit is niet gelukt. Ook is gebleken dat gentamycine resistente micro organismen ook op de CRE agar groeien. Dit is per ongeluk gebeurd door een gentamycine resistente stam op de plaat te enten in plaats van een carbapenemase stam. Waarschijnlijk zit er in de CRE agar gentamycine. Hier is via de mail navraag over gedaan bij Oxoid, maar de samenstelling van deze plaat is strikt geheim en is hier dus niet meer duidelijkheid over verkregen. Hierdoor betekent het wel dat wanneer een patiënt een gentamycine resistente bacterie bij zich draagt deze als carbapenemase positieve stam gezien kan worden. Echter na het determineren van de stam zal blijken dat het om een gentamycine stam gaat en niet om een carbapenemase stam.
Bij het testen van de invloed van patiëntenmateriaal op de ESwab en CultureSwab EZ is weer gebleken dat de negatieve platen opnieuw overnacht geïncubeerd moeten worden. Ook bij dit onderzoek is gebleken dat de faeces een storende factor heeft op de ESBL en VRE plaat.
A. de Wit 37
5.1. Suggesties voor verder onderzoek
Om dit onderzoek volledig af te ronden is het nog nodig om de Eswab en CultureSwab met elkaar te vergelijken in een in vivo onderzoek. Hiervoor dienen kweken te worden afgenomen van patiënten die bekend zijn met een ESBL, VRE, CRE of gentamycine resistente stam. Ook zal er bij dit onderzoek bekeken moeten worden of dat het patiëntenmateriaal niet te ver wordt verdund in het Amies medium waardoor er mogelijk vals negatieve resultaten kunnen ontstaan.
Omdat gentamycine resistentie alleen onder BRMO valt wanneer deze resistentie gepaard gaat met resistentie tegen antibiotica uit de quinolonen groep, kan er nog onderzoek gedaan worden hoe dit tegelijk onderzocht kan worden. Hierbij kan gedacht worden aan een quinolonen antibiotica disk op de genta plaat, of een plaat met beide componenten. Ook kunnen deze onderzoeken nogmaals herhaald worden met meerdere bekend positieve stammen, waardoor de resultaten betrouwbaarder worden. Nu zijn er veel negatieve stammen meegenomen om te controleren of de plaat de negatieven echt remt in de groei. Al deze stammen vertoonde geen groei op de specifieke platen, en kunnen in het vervolgonderzoek weg gelaten worden.
5.2. Aanbevelingen
De chromogene platen ESBL, VRE en CRE zijn een goede toevoeging aan de routinematige analyses die worden uitgevoerd op de Medische Microbiologie van SJG Weert. Wanneer er bijvoorbeeld een toevalsbevinding ESBL wordt ontdekt in patiëntenmateriaal, zijn deze platen geen toevoeging. Maar wanneer het gaat om het screenen van Bijzonder Resistente Micro Organismen zijn deze platen een hele goede vervanger van de huidige methode. Vooral de snelheid van de kweek gaat met chromogene platen omhoog. Met de huidige methode duurt een BRMO screening drie á vier dagen, terwijl wanneer de chromogene agars gebruikt gaan worden dit twee á drie dagen is. Wel zal er voordat de screening ingezet wordt een Grampreparaat gemaakt moeten worden om micro organismen uit te kunnen sluiten van het onderzoek. Wanneer er in het Grampreparaat bijvoorbeeld Gram positieve coccen gevonden worden, hoeven de specifieke platen voor Gram negatieven niet beënt te worden.
De ESwab is een goede vervanger van de CultureSwab EZ. Uit de resultaten is gebleken dat deze een vergelijkbare werking hebben met elkaar. Ook wanneer er meerdere onderzoeken uitgevoerd moeten worden, kan dit vanuit één swab. Voor de specialisten en huisartsen is het wenselijk om maar één wattenstok af te nemen. In de praktijk op het laboratorium moet er nog wel worden bekeken wat gemakkelijker is, platen enten met de swab zelf, of de platen enten met het Amies medium met behulp van een pipet. Het blijft helaas wel nodig om de kweken op te hopen, waardoor er geen tijdwinst is met de ESwab.
A. de Wit 38
6. Conclusie
6.1. Chromogene platen
Uit het onderzoek is gebleken dat de detectiegrens van de ESBL plaat 150-1.500 KVE/ml is, en dat faeces deze detectiegrens niet verstoort. De commensale flora, E.coli, in faeces zorgt wel voor een wazige groei op de ESBL plaat. Deze stam zal in andere patiëntenmaterialen niet aanwezig zijn als commensaal, en dus geen storende factoren leveren.
Uit het onderzoek is gebleken dat de detectiegrens van de VRE plaat 1.500-15.00 KVE/ml is, en dat faeces deze detectiegrens niet verstoort. De commensale flora, E.faecalis, in faeces zorgt wel voor een wazige groei op de VRE plaat. Deze stam zal echter niet in andere patiëntenmaterialen aanwezig zijn als commensaal, en zal dan ook geen storende factoren veroorzaken.
Verder is uit het onderzoek gebleken dat de detectierange voor zowel de CRE- als de genta plaat 1.500 KVE/ml is, en dat faeces geen storende factoren op deze platen heeft. Wat bij vooral de genta plaat is gebleken, is dat wanneer een plaat na 18-24 uur incuberen nog geen groei vertoont de plaat nog een overnachting geïncubeerd moet worden om de laat positieve stammen ook te kweken.
6.2. ESwab
Uit het onderzoek is gebleken dat de ESwab een iets hogere detectie range heeft dan de CultureSwab EZ, doordat de stammen nog een extra stap verdund worden in het Amies medium. Echter na ophopen is van dit verschil niets meer te zien. De ophopingsmethode zal niet verdwijnen bij inname van de ESwab. Wanneer de ESwab wordt gebruikt in combinatie met patiëntenmateriaal, is er ook geen verschil detecteerbaar tussen zonder en met patiëntenmateriaal wat betreft de groeidichtheid op de platen. Ook is er nauwelijks verschil tussen de ESwab en de CultureSwab EZ wanneer deze gebruikt worden met patiënten materiaal.
De eindconclusie is dat de chromogene agars een goede toevoeging zijn in de routinematige diagnostiek van de afdeling MMDIP van SJG Weert, met betrekking tot de screening op BRMO’s. En dat de ESwab een goede vervanger is voor de huidige CultureSwab EZ voor alle kweken die worden afgenomen met een swab. Het ophopen van de kweken zal met de ESwab niet verdwijnen.
A. de Wit 39
Literatuur
1. Becton Dickinson, BD. (2010) BD BBL CultureSwab EZ. [Bijsluiter] 2. Becton Dickinson, BD. (2010) BD BBLTM Prepared Turbidity Standard.
[Bijsluiter]
3. Copan. (2010) Copan Liquid Amies Elution Swab (ESwab) Collection and Transport System. [bijsluiter]
4. D.L. Paterson & R.A. Bonomo (Oktober 2005) Extended-Spectrum β- Lactamases: a Clinical Update, Clinical Microbiology Reviews, 657–686
5. E. Sauvage, F. Kerff, M. Terrak, J. A. Ayala, and P. Charlier. (2008). The penicillin-binding proteins: structure and role in peptidoglycan biosynthesis. FEMS Microbiol. P. 234–58.
6. E.Koppen en D.Potters (november 2011) 003868, BRMO, risicocategorieën. Document KwaliteitsSysteem (DKS)
7. Extended spectrum beta-lactamases.
http://www.microrao.com/micronotes/pg/ESBLs.pdf Geraadpleegd op: 20 april 2013.
8. J. Cohen, W.G. Powderly. (2004) Infectious diseases second edition. Mosby 9. J. Huisman et. al. (december 2003) Antibiotica en resistentie. cahiers bio-
wetenschappen en maatschappij, Vol. 23.
10. J. Thomas Cross, Jr, and Richard F, Jacobs. (Juli 2007)Vancomycin-Resistant Enterococcal Infections. Seminars in Pediatric Infectious Diseases
11. J.A. Ricco (1999) Metallo-β-lactamases: does it take two to tango? Coördination Chemistry Reviews. P.519-535
12. K.G. van Horn, C.D. Audette, D. Sebeck, K.A. Tucker (2008). Comparison of the Copan ESwab system with two Amies agar swab transport systems for maintenance of microorganism viability. J Clin Microbiol P. 1655-1658.
13. M. Sarina et al (Mei 2007) Comparative Evaluation of Three Transport Swabs Potential to MaintainViability of Clinically Important Aerobic and Anaerobic Organisms American Society for Microbiology.
14. M.T. Madigan, J.M. Martinko, P.V. Dunlap, D.P. Clark (2009) Brock-Biology of microorganisms 12th edition Pearson Benjamin Cummings
15. M.Timmermans-Jongboom (september 2012) VB-105, Confirmatie van ESBL’s d.m.v. E-test-methode, Document KwaliteitsSysteem(DKS)
A. de Wit 40 16. M.Timmermans-Jongboom en O. Brouns-Jansen (Januari 2013) VB-100,
Gevoeligheidsbepalingen d.m.v. agardiffusie. Document KwaliteitsSysteem (DKS) 17. Oxoid (2009) Culture Media BillianceTM VRE Agar [Bijsluiter]
18. Y. Cetinkava, P. Falk, C.G. Mayhall. (oktober 2000) Vancomycin Resistant Enterococci. Clinical Microbiology.
A. de Wit 41