De analyse van Metanefrinen in plasma m.b.v. Vloeistofchromatografie en Tandem Massaspectrometrie

(1)

De analyse van Metanefrinen in plasma

m.b.v. Vloeistofchromatografie en Tandem

Massaspectrometrie

Scriptie

Afstudeerstage

Aloischa Tanghe

15 mei 2013

(2)

De analyse van Metanefrinen in plasma

m.b.v. Vloeistofchromatografie en Tandem

Massaspectrometrie

Scriptie

Afstudeerstage

Periode: oktober 2012 – mei 2013

Klinisch chemisch en hematologisch laboratorium (KCHL) St. Elisabeth ziekenhuis

Hilvarenbeekseweg 60, 5022 GC Tilburg

013-539 13 13

Contactpersoon: Bob Wieggers b.wieggers@elisabeth.nl Begeleider: Henk Kavelaars h.kavelaars@elisabeth.nl Klinisch Chemicus: Bernadette Jakobs b.jakobs@elisabeth.nl Stage begeleider: Ahmed Lazaar a.lazaar@elisabeth.nl

Avans hogeschool Breda

Stage begeleidster: Nicole van den Braak npwcj.vandenbraak@avans.nl Student: Aloischa Tanghe aea.tanghe@student.avans.nl

(3)

Voorwoord

Voor het afronden van de opleiding Biologie en medisch laboratoriumonderzoek is een afstudeeronderzoek uitgevoerd. Na eerst stage te hebben gelopen op de routine afdeling van het Klinisch chemisch en hematologisch laboratorium (KCHL) van het St. Elisabeth ziekenhuis heb ik aansluitend mijn afstudeerstage binnen het KCHL uitgevoerd. Dit onderzoek heb ik verricht binnen de afdeling specieel. Tot deze afdeling behoort onder andere neonatale screening, metabool onderzoek, DNA-diagnostiek en Tandem MS. Ik heb mijn opdracht uitgevoerd op de UPLC-Tandem MS. Tot nu toe wordt alleen nog de analyse van methylmalonzuur (MMA) en de aminozuren uitgevoerd op de UPLC-MS/MS. De analyse van vrije metanefrinen in plasma zou hierbij de derde bepaling worden.

Graag wil ik nog een aantal mensen bedanken voor hun hulp en begeleiding tijdens mijn afstudeerstage. Veel dank gaat uit naar Henk Kavelaars voor zijn goede praktijkbegeleiding op het laboratorium. Ook wil ik bedanken Bernadette Jakobs die als klinisch chemicus het project begeleide, Bob Wieggers voor het aanbieden van de stage plaats, Ahmed Lazaar stagebegeleider en alle collega’s van het KCHL die mij geholpen hebben en waardoor ik hier met veel plezier heb gewerkt. Vanuit Avans Hogeschool wil ik graag Nicole van den Braak bedanken voor haar begeleiding tijdens de afstudeerperiode.

(4)

Samenvatting

De analyse van metanefrinen in urine wordt al uitgevoerd in het Klinische chemisch en hematologisch laboratorium (KCHL) van het St. Elisabeth ziekenhuis. Aanvragen voor de bepaling van vrije metanefrinen in plasma worden nu ingestuurd naar het UMC Groningen. Op basis van gevoeligheid en specificiteit is de bepaling van vrije plasma metanefrinen de beste bepaling voor het stellen van de diagnose feochromocytoom. Het doel is een analysemethode te ontwikkelen die in het KCHL gebruikt kan worden voor het bepalen van vrije metanefrinen in plasma.

Er wordt gebruik gemaakt van een UPLC-MS/MS methode. De componenten die gemeten worden zijn metanefrine (MN), normetanefrine (NMN) en 3-methoxytyramine (3MT). Er zijn eerst waterige stock oplossingen gemaakt van MN, NMN en 3MT. Hiermee zijn de optimale instellingen van de massaspectrometer vastgesteld. Vervolgens is de chromatografie methode geoptimaliseerd. De gevoeligheid van de methode is getest met waterige stockoplossingen metanefrinen met concentraties van 0,1nmol/L tot en met 10nmol/L. Plasma monsters zijn vervolgens gespiked met metanefrinen om een monster voorbewerking methode op te zetten. De recovery van deze voorbewerkings methode is getest.

De plasma monsters worden voorafgaand aan de analyse met een solid phase extractie (SPE) methode voorgezuiverd. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van Oasis weak cation exchange (WCX) cartridges. Chromatografische scheiding van de analyten en gedeutereerde interne standaarden wordt verkregen door hydrophilic interation chromatografie (HILIC). Massa spectrometrische detectie wordt uitgevoerd in de multiple reaction monitoring mode (MRM) gebruik makend van een quadrupole tandem massa spectrometer in positieve electrospray ionisatie mode.

De analysemethode voor het bepalen van vrije metanefrinen in plasma is opgezet. Metanefrinen in een waterige oplossing kunnen gedetecteerd worden tot een concentratie van 0,1nmol/L. Gespikte plasma monsters zijn gedetecteerd tot een concentratie van 20nmol/L. De opgezette analysemethode moet nog verder worden geoptimaliseerd en gevalideerd voordat deze in gebruik genomen kan worden.

(5)

Inhoudsopgave

Voorwoord...3

Samenvatting...4

1. Inleiding...6

2. Theoretische achtergrond ziektebeeld...7

2.1 Feochromocytoom...7

2.2 Catecholaminen en metanefrinen...7

2.3 Diagnose...8

3. Theoretische achtergrond technieken...10

3.1 Tandem massaspectrometrie...10

3.2 Metanefrinen meten m.b.v. MRM methode...12

3.3 Ultra performance liquid chromatography...14

3.4 Monster voorbewerking...16

4. Materiaal en methode...20

4.1 Tandem Massaspectrometer (MS/MS) methode ontwikkeling...20

4.2 Chromatografie methode ontwikkeling...22

4.3 Monstervoorbewerking methode ontwikkeling...23

5. Resultaten...26

5.1 Tandem Massaspectrometer (MS/MS) methode ontwikkeling...26

5.2 Chromatografie methode ontwikkeling...31

5.3 Monstervoorbewerking methode ontwikkeling...39

6. Conclusie...43

7. Discussie/aanbeveling...44

Literatuurlijst...45

Bijlage I: Berekeningen bereiden stockoplossingen MN, NMN en 3MT...47

(6)

1. Inleiding

Metanefrinen in plasma worden bepaald voor het stellen van de diagnose feochromo-cytoom. Een feochromocytoom is een catecholamine-producerende tumor, welke vooral voorkomt in het bijniermerg. Catecholaminen zijn stresshormonen, die zorgen voor onder andere een hoge bloeddruk en flushes. Overmatige secretie van catecholaminen kan levensbedreigend zijn wanneer dit niet gediagnosticeerd of op de juiste wijze behandeld wordt. Metanefrinen, de afbraakproducten van catecholaminen, worden gemeten omdat deze een hogere sensitiviteit en specificiteit hebben voor het stellen van de diagnose feochromocytoom.

Het doel is om een methode te ontwikkelen voor het bepalen van vrije metanefrinen in plasma met behulp van ultra performance vloeistofchromatografie (UPLC) en Tandem massaspectrometrie (MS/MS). De te bepalen componenten zijn metanefrine (MN), normetanefrine (NMN) en 3-methoxytyramine (3MT). De ontwikkeling van een LC-MS/MS methode bestaat uit verschillende stappen. Eerst is een multiple reaction monitoring (MRM) methode opgezet voor de detectie van metanefrinen. Vervolgens is gewerkt aan een chromatografische scheiding van de componenten. In plasma komen veel componenten voor die storend kunnen werken in deze analyse methode. Er is daarom gezocht naar een geschikte manier om de plasmamonsters voor te bewerken.

Het verslag is opgedeeld in verschillende hoofdstukken met in hoofdstuk 2 en 3 de theoretische achtergrond waarbij de nodige informatie wordt gegeven over aspecten welke ter sprake komen in het onderzoek. Hoofdstuk 4 is materiaal en methode. Hierin staan de experimenten beschreven. Hoofdstuk 5 bevat de resultaten van deze uitgevoerde experimenten. De conclusie wordt besproken in hoofdstuk 6, gevolgd door de discussie en aanbeveling in hoofdstuk 7.

(7)

2. Theoretische achtergrond ziektebeeld

Het bepalen van vrije metanefrinen in plasma wordt uitgevoerd voor het stellen van de diagnose feochromocytoom. Ook na het stellen van de diagnose kan, tijdens en na de behandeling, het verloop van het ziekte proces worden gecontroleerd met de concentratie metanefrinen in plasma. Theoretische achtergrond over het ziektebeeld en de diagnose hiervan is weergegeven in dit hoofdstuk.

2.1 Feochromocytoom

Een feochromocytoom is een catecholamine-producerende tumor die ontstaat uit chromaffiene cellen. Feochromocytomen komen voor 90% voor in het bijniermerg maar kunnen ook op andere plaatsen in het lichaam voorkomen. Wanneer uit chromaffiene cellen die zich buiten de nieren bevinden een tumor ontstaat, worden deze extra-adrenale feochromocytomen of paragangliomen genoemd.[1] _{Het feochromocytoom komt}

voornamelijk voor bij volwassenen. De tumor is bij meer dan 90% van de gevallen goedaardig, maar door de constante of in aanvallen optredende secretie van catecholaminen toch potentieel levensbedreigend.[2]_{Een hypertensieve crisis, waarbij de bloeddruk enorm}

stijgt, kan cardiogeen longoedeem veroorzaken of adult respiratory distress syndrome (ARDS). Daarnaast leidt de extreme afgifte van catecholaminen tot een diffuse schade van het capillaire endotheel in het longvaatbed.[3]

Feochromocytomen variëren in grootte maar zijn gemiddeld 5 tot 6 cm in diameter en wegen 50 tot 200 gram. Het komt zelden voor dat de tumor zo groot is dat deze symptomen veroorzaakt als gevolg van druk of obstructie. De catecholamine hormonen die door de tumor worden uitgescheiden zorgen voor de kenmerkende symptomen. Deze symptomen zijn onder andere een opvallend hoge bloeddruk (hypertensie), hoofdpijn, zweten en een snelle hartslag.[4]_{Bijna de helft van de mensen met een feochromocytoom vertoont behalve}

een hoge bloeddruk geen symptomen. Hierdoor kan de arts een feochromocytoom nog wel eens over het hoofd zien. Een feochromocytoom is een relatief zeldzame tumor, slechts bij 0,1% van de mensen met een hoge bloeddruk is deze tumor aanwezig. Familiair komt het feochromocytoom samen met het medullaire schildkliercarcinoom en een hyperparathyreoidie voor bij het zogenoemde MEN-2A-syndroom. Ook wordt een kenmerkende combinatie gezien bij de ziekte van Von Hippel-Lindau. Bij families met deze aandoening blijkt 60-70% een feochromocytoom te hebben.[3]

2.2 Catecholaminen en metanefrinen

Catecholaminen zoals adrenaline en noradrenaline zijn pep- of stresshormonen. Deze hormonen zorgen voor een zogenaamde ‘vlucht of vecht’-reactie en voor de regulatie van de bloeddruk. Bij een verhoging van deze hormonen zal de hartslag en de bloedtoevoer naar de spieren toenemen. Adrenaline veroorzaakt bloedvatverwijding (vasodilatatie) in de spieren met variabele effecten op de bloeddruk, terwijl noradrenaline zorgt voor een algemene bloedvatvernauwing (vasoconstrictie) met hypertensie tot gevolg. Catecholaminen worden gesynthetiseerd door neuronen en bijniermergcellen.

(8)

Om niet de hele dag gestrest te blijven worden catecholaminen meteen afgebroken. Catecholaminen worden onder invloed van het enzym Catechol-O-methyltransferase (COMT) omgezet naar metanefrinen, zie figuur 1. Zo wordt adrenaline omgezet naar metanefrine, noradrenaline naar normetanefrine en dopamine naar 3-methoxytyramine.

Vervolgens worden metanefrine en normetanefrine weer door monoamine oxidase (MAO) omgezet in vanillylamandelzuur (VMA) en homovanillinezuur (HVA) is het afbraakproduct van 3-methoxytyramine.[3]

Figuur 1: Afbraak van catecholaminen naar metanefrinen door Catechol-O-Methyl- Transferase (COMT).

2.3 Diagnose

Het ligt voor de hand om de diagnose van feochromocytoom te stellen door de catecholaminen concentratie in bloed of urine te meten. Echter de halfwaardetijd van catecholaminen zijn zo kort, dat alleen een directe meting tijdens een aanval zinvol is. De afbraakproducten van catecholaminen, de metanefrinen, zijn hier minder gevoelig voor. Onderzoek heeft aangetoond dat de gevoeligheid van vrije metanefrinen in plasma en metanefrinen in urine hoger is dan die van catecholaminen in plasma, catecholaminen in urine, urine totale metanefrinen en vanillylamandelzuur in urine[4]_{.Op basis van gevoeligheid}

en specificiteit is de analyse van vrije metanefrinen in plasma de beste test voor het bevestigen of uitsluiten van de diagnose feochromocytoom.Combinaties van verschillende testen geven geen betere diagnostische uitslagen dan enkel de bepaling van vrije metanefrinen in plasma.[4] _{Indien de metanefrinen-waarden zijn verhoogd kan met behulp}

van beeldvormende technieken zoals computertomografie (CT) of magnetische resonantie imaging (MRI) de tumor gelokaliseerd worden.[1]

(9)

Op het Klinisch chemisch en hematologisch laboratorium (KCHL) in het St. Elisabeth ziekenhuis Tilburg worden nu alleen de metanefrinen in urine bepaald. Aanvragen voor vrije metanefrinen in plasma worden doorgestuurd naar het UMC Groningen. In figuur 2 zijn de waarden van de vrije metanefrinen in plasma van 10 patiënten weergegeven met een histologisch bewezen feochromocytoom welke bepaald zijn in het UMC Groningen. Hier worden voor plasma vrije metanefrinen de volgende referentie waarden gebruikt[5]_:

Metanefrine: 0,07 – 0,33nmol/L Normetanefrine: 0,23 – 1,07nmol/L 3-methoxytyramine: < 0,17nmol/L

Figuur 2: De vrije metanefrinen concentraties (nmol/L) in plasma van 10 patiënten met een histologisch bewezen feochromocytoom.[5]

Behandeling

De behandeling bestaat meestal uit het chirurgisch verwijderen van het feochromocytoom. Echter een hoge catecholaminespiegel tijdens een operatie kan gevaarlijk zijn. Zowel bij het starten van de narcose als tijdens de operatie kan de bloeddruk erg schommelen, dit kan zelfs een beroerte tot gevolg hebben. Voordat de operatie kan plaatsvinden, moet daarom de afgifte van catecholaminen door de tumor onderdrukt worden met behulp van medicijnen. Hiervoor worden vooral alpha-blokkers gebruikt, zoals doxazosine en fenoxybenzamine. Deze medicijnen gaan de effecten van adrenaline en noradrenaline in het lichaam tegen.[6]_{De tumor wordt, los van het histologisch uiterlijk, als goedaardig beschouwd}

(10)

3. Theoretische achtergrond technieken

Voor het analyseren van de vrije metanefrinen in plasma wordt gebruik gemaakt van een UPLC-MS/MS techniek. Hierbij vindt scheiding van de te analyseren stoffen plaats met behulp van vloeistofchromatografie, gevolgd door een selectie, fragmentatie en uiteindelijk detectie van de analyten in de Tandem MS. Om storende componenten uit de plasma monsters te verwijderen, worden de monsters voorafgaand aan de analyse door middel van solid phase extractie (SPE) voorgezuiverd. In dit hoofdstuk wordt de theorie van de gebruikte technieken besproken.

3.1 Tandem massaspectrometrie

Massa detectie is een selectieve detectie methode, daarom moet bij het ontwikkelen van een UPLC-MS/MS methode eerst begonnen worden met het optimaliseren van het massaspectrometrie gedeelte. Hier worden de analyten op basis van massa per lading(m/z) geselecteerd en uiteindelijk gedetecteerd. In dit onderzoek is hiervoor gebruik gemaakt van een multiple reaction monitoring (MRM) methode. Dit wil zeggen dat na scheiding op de kolom, de te meten analyten in de massadetector komen. Hier worden de analyten geïoniseerd en daarna worden m.b.v. MS 1 analyten met een bepaalde m/z doorgelaten. In de collision cell worden de doorgelaten analyten blootgesteld aan een energie, die er voor zorgt dat de doorgelaten analyten gefragmenteerd worden (uit elkaar vallen). In MS 2 kan dan weer een specifieke m/z geselecteerd worden, die m.b.v. de detector gedetecteerd wordt. Een schematische weergave van de Tandem MS is weergegeven in figuur 3.

Figuur 3: Schematische opbouw van een Tandem MS.

Electrospray ionisatie

Om de analyten door een MS filter te laten migreren moeten deze eerst geïoniseerd worden. Dit gebeurd in de bron, tijdens dit onderzoek wordt hiervoor gebruik gemaakt van electrospray ionisatie (ESI). Dit is een zachte ionisatietechniek waarbij de vloeistofstroom, die vanuit de UPLC komt, door de binnenzijde van een dubbelwandig capillair gevoerd wordt. In de buitenzijde van deze capillair wordt een vernevelings gas (desolvation gas) gevoerd, die er voor zorgt dat de vloeistof verneveld wordt. Door een hoge spanning aan te brengen op de

(11)

capillair, worden geladen druppels gevormd. De hoge temperatuur (desolvation temperatuur) zorgt dat de nevel verdampt. De neveldruppels krimpen en de ionen komen dichter bij elkaar te liggen. Tussen de capillair en de cone van de massaspectrometer heerst een atmosferische druk. Door het aangelegde potentiaal verschil tussen capillair en cone ontstaat een elektrisch veld. Er ontstaan uiteindelijk enkelvoudig geladen moleculen. Deze ionen worden via een cone naar de massaspectrometer geleid. [8]

In afbeelding 4 is het mechanisme van ionvorming via ESI weergegeven. Vorming van ionen is bij deze techniek van groot belang. Door een betere ionisatie wordt de gevoeligheid van het apparaat namelijk verhoogd.

Figuur 4: Mechanisme van ionvorming via electrospray ionisatie (ESI).

RF-lens

Vanuit de bron gaan de gevormde ionen door de cone en worden m.b.v. de RF lens gefocust. De RF lens is een hexapool (6 rods). Over de rods van deze RF lens staat een klein spanningsverschil. De frequentie, waarmee positieve en negatieve lading over de rods veranderd, is ter grootte van de radio frequentie (rf). Alle ionen worden gefocust doorgelaten. Deze gefocuste ionenstroom komt in massafilter 1.

Massafilter

De massafilters (MS 1 en MS 2) zijn quadrupolen, zoals te zien in afbeelding 5. Een quadrupool bestaat uit vier hyperbolische staven (rods) die zich op gelijke afstand van een centrale as bevinden.

Figuur 5: Massafilter.

Twee tegenoverliggende rods hebben wisselend een positieve of negatieve lading. De frequentie, waarmee positieve en negatieve lading over de rods veranderd, is ter grootte van de radio frequentie. Door de frequentie te wijzigen kunnen de verschillende massa’s worden gefilterd. De golfbewegingen van de radiofrequentie en de wisselstroomspanning kunnen zo

(12)

worden ingesteld dat slechts de ionen met één bepaalde m/z verhouding worden doorgelaten en alle andere ionen worden afgebogen en niet in de collision cell terecht komen. Door de frequentie aan te passenkunnen steeds ionen met een andere m/z waarde worden geselecteerd.[8]

Collision cell

MS 1 wordt zo ingesteld dat de ionen van de te bepalen analyten worden doorgelaten en in de collision cell terecht komen. In de collision cell vindt fragmentatie van de ionen plaats via collision induced dissociation (CID). Ionen worden hierbij gefragmenteerd in de gasfase door stijging van het voltage in vacuüm gevolgd door botsing van de ionen met een neutraal gas zoals helium of argon. Tijdens de botsing wordt een deel van de kinetische energie opgenomen waardoor chemische bindingen in het ion verbroken worden. Hierdoor vallen de precursor ionen in fragmenten uit elkaar, wat resulteert in product ionen.[9]_{Het CID proces is}

weergegeven in afbeelding 6.

Figuur 6: Fragmentatie proces in de collision cell.[9]

De product ionen worden bij verlaten van de collision cell door een lens in een brandpunt bij elkaar gefocust en gaan zo MS 2 in. Hierin gebeurt hetzelfde als in MS 1. De product ionen met de ingestelde m/z-waarden worden geselecteerd en doorgelaten naar de detector. De detector reageert op de aanwezigheid van een component en geeft een elektrisch signaal. Het signaal wordt, in functie van de tijd, weergegeven in een chromatogram. De grootte van een signaal, hoogte of oppervlakte, wordt gebruikt voor de kwantitatieve analyse.[13]

Met MS/MS detectie kan hoge selectiviteit en sensitiviteit worden behaald, omdat unieke parent-daughter ionen gebruikt worden voor kwantificatie[5]_{. Moleculen met een precursor}

ion dat dezelfde m/z waarde heeft, maar na fragmentatie verschillende product ionen produceren kunnen door middel van Tandem MS gekwantificeerd worden.[9]

3.2 Metanefrinen meten m.b.v. MRM methode

Bij het opzetten van de MRM methode moeten alle parameter settings van de massaspectrometer optimaal ingesteld worden voor een goede detectie van de metanefrinen. Deze parameters zijn onder andere het voltage wat over de capillair staat, de desolvation temperatuur, de temperatuur in de bron, de gas flow, het cone voltage en de collision energie. Het optimaliseren van alle parameters kost tijd en veel metingen.

Tijdens de ionisatie kunnen de moleculen positief of negatief geïoniseerd worden, afhankelijk van de instelling van het capillair voltage. Uit literatuur onderzoek blijkt dat voor het bepalen van metanefrinen gebruik wordt gemaakt van positieve ionisatie[5]_{. Door deze positieve}

(13)

ionisatie worden ionen met een m/z geproduceerd welke één hoger is dan de molmassa: M+ [H+_{]. In tabel 1 zijn de eigenschappen van de te bepalen metanefrinen weergegeven.}

Tabel 1: Fysische eigenschappen metanefrine, normetanefrine en 3-methoxytyramine.

Het instellen van de juiste m/z waarden waarop de massafilters moeten selecteren is erg belangrijk. Alleen van deze doorgelaten ionen wordt het signaal gedetecteerd. De berekende massa’s zoals in tabel 1 vermeld staan blijken in de literatuur niet de massa’s te zijn van de precursor ionen. In de ion source treedt bij de geproduceerde ionen een spontaan verlies van water op. Water, H2O, heeft een molmassa van 18. De precursor ionen welke in de eerste

massa filter geselecteerd worden hebben hierdoor een lagere m/z waarde; [M+H-H2O]+. In de

collision cell worden de precursor ionen gefragmenteerd en worden de product ionen gevormd. In figuur 7 is van de verandering van het normetanefrine molecuul tijdens de MRM transitie weergegeven. Hierbij heeft het precursor ion een m/z waarde van 166 en het product ion 134 m/z.[10]

Figuur 7: Normetanefrine transitie tijdens MRM.[10]

Het zelfde waterverlies treedt ook op bij metanefrine en 3-methoxytyramine.[5]_De

precuror ionen bestaan hierdoor ook uit de vorm [M+H-H2O]+. De m/z waarden van de

precursor en product ionen van de metanefrinen welke in de literatuur

voornamelijk gevonden werd zijn in tabel 2 weergegeven. Tijdens het opzetten van de MRM methode wordt gecontroleerd of deze precursor ionen echt verkregen worden. Voor alle

Structuurformule Molecuul formule Mol massa M+[H+_]

MN C10H15NO3 197 198 m/z

NMN C9H13NO3 183 184 m/z

(14)

componenten wordt een massaspectrum bepaald. Hierin is weergegeven welke ionen na fragmentatie gevormd worden.

Tabel 2: Precursor en procuct ionen MN, NMN en 3MT.[11]

3.3 Ultra performance liquid chromatography

De chromatografische scheiding van de monsters voorafgaand aan de detectie in de Tandem MS vindt in dit onderzoek plaats met behulp van ultra performance liquid chromatografie (UPLC). Plasmamonsters zijn mengsels waarin veel verschillende componenten voorkomen. Scheiding van de componenten uit het plasma monster voordat het de MS binnenkomt, kan een betere detectie opleveren. Wanneer minder componenten tegelijk elueren wordt de kans op het negatief beïnvloeden van de ionisatie van metanefrinen moleculen door coëluerende componenten verkleind.[12]

Het basisprincipe van vloeistof chromatografie is als volgt. Het monster met daarin de te bepalen componenten wordt geïnjecteerd en bevindt zich dan in het eluens, ook wel de lopende fase of mobiele fase genoemd. De mobiele fase wordt langs een stilstaande fase geleid, de stationaire fase. De stationaire fase bestaat uit kleine particles die zich in een kolom bevinden. Als een monstercomponent een bepaalde interactie ondergaat met de stationaire fase vindt er vertraging plaats, deze vertraging wordt retentie genoemd. Hoe sterker de interactie, hoe groter de retentie. De interactie krachten zijn afhankelijk van de individuele componenten en de fasen. Hierdoor ontstaat verschil in interactie wat resulteert in verschil in retentie. Scheiding ontstaat doordat de monstercomponenten die op een gelijk tijdstip gestart zijn, op verschillende tijdstippen het systeem verlaten.[13]

Een chromatografiesysteem bestaat uit een aantal onderdelen. Dit zijn onder andere een reservoir voor de mobiele fase, de pomp, injectiesysteem, de kolom en een detector, zoals te zien in afbeelding 8. In dit onderzoek bevindt zich na de kolom de Massaspectrometer waarin de componenten ook gedetecteerd worden.

Component Precursor product

MN 180 m/z 148 m/z

NMN 166 m/z 134 m/z

(15)

Afbeelding 8: Onderdelen van een LC systeem.[8]

De samenstelling van de mobiele fase, speelt een belangrijke rol in het chromatografisch proces. Bij de in dit onderzoek opgezette UPLC methode wordt gebruik gemaakt van twee verschillende soorten eluentia. De samenstelling van het eluens, de hoeveelheid eluens A en eluens B die gepompt wordt kan tijdens het proces veranderd worden. Hierdoor ontstaat een gradiënt. De gradiënt wordt zo ingesteld dat de beste chromatografische scheiding van de te onderzoeken componenten wordt verkregen.

De kolom die in dit onderzoek gebruikt wordt voor het scheiden van de metanefrinen is een Acquity UPLC BEH Amide kolom met een diameter van 2,1 mm en een lengte van 100 mm. In de kolom bevindt zich de stationaire fase. De stationaire fase bestaat uit gemodificeerde siliciumoxide moleculen met een deeltjes grootte van 1,7 µm. Aan het Ethylene Bridged Hydrid (BEH) deel wat aan het silicium molecuul zit een amine groep die ervoor zorgt dat de stationaire fase polair is, zie figuur 9.

Figuur 9: Ethylene Bridged Hybrid (BEH) deeltjes type wat zich in de UPLC BEH Amide kolom bevindt.

[17]

Het scheidingsprincipe is op basis van Hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Metanefrine, normetanefrine en 3-methoxytyramine zijn polaire stoffen. Het gebruik van HILIC voor de analyse van polaire basen zorgt voor een verbeterde analytische gevoeligheid in vergelijking met traditionele reversed-phase methoden bij het gebruik van electrospray ionisatie. Metanefrinen worden hierbij geëlueerd met voor een groot deel bestaand uit organisch oplosmiddel. Voor het desolvation proces is een organisch oplosmiddel efficiënter.

(16)

3.4 Monster voorbewerking

De metanefrinen die bepaald moeten worden bevinden zich in plasma. In plasma komen veel stoffen voor die storend kunnen werken op de bepaling. Vooral fosfolipiden, zouten en eiwitten uit het plasma kunnen ion suppressie veroorzaken[14]_{. Voordat de plasma monsters}

geïnjecteerd kunnen worden op de kolom moeten deze daarom eerst worden voorbewerkt. Solid-phase extractie (SPE) is een goede manier om monsters te bewerken en zo stoffen welke ion suppressie veroorzaken te verwijderen [12]_.

De metanefrine bepaling zoals deze in het UMC Groningen wordt uitgevoerd diende als leidraad in dit onderzoek. In het UMC Groningen wordt echter gebruik gemaakt van een Spark Holland Symbiosis online SPE system voor de monsterbewerking. Deze staat direct aangesloten op de analytische kolom. Dit systeem bestaat onder andere uit een temperatuur geregelde autosampler, een SPE controller unit waarin automatisch de cartridges verwisseld worden en een oplosmiddel toevoersysteem. De cartridges die hierbij gebruikt worden zijn Oasis weak cation exchange 10 bij 1 mm SPE cartrigdes van Waters.[5]

Oasis WCX SPE cartridges

Het KCHL beschikt niet over de apparatuur om online SPE uit te voeren. Er zal daarom gebruik gemaakt moeten worden van offline SPE cartridges. MN, NMN en 3MT bevatten allemaal dezelfde functioneel geladen amino groepen. Hierdoor kan gebruik gemaakt worden van een selectieve SPE door het gebruik van cation exchange mechanisme. Literatuur onderzoek wees uit dat Oasis WCX SPE cartridges een goed offline alternatief bieden voor de monsterbewerking van plasma bij de analyse van vrije metanefrinen[12]_{. Dit zijn weak cation}

exchange cartridges. In figuur 10 is een Oasis WCX cartridge weergegeven met het cation exchange mechanisme. Hiermee kunnen de metanefrinen uit het plasma monster worden gezuiverd en geconcentreerd.

Figuur 10: Oasis WCX cartridges.[16]

Voordat de plasma monsters over de cartridges worden gebracht, moeten de cartridges eerst geconditioneerd en geëquilibreerd worden. Hierbij wordt de kolom in een conditie gebracht waarbij de metanefrinen aan de kolom binden. In figuur 10 is te zien dat de stationaire fase in de kolom een lading kan krijgen. Dit gebeurd wanneer een basisch milieu wordt toegevoegd. De metanefrinen hebben ook een lading en zullen binden aan de stationaire fase. De cartridges kunnen hierna grondig gespoeld worden met water en methanol zonder

(17)

elutie van de metanefrinen. Nadat de cartridges gewassen zijn zodat alle andere storende componenten uit het plasma verwijdert zijn, wordt een zuur milieu aan de cartrigdes toegevoegd. Hierdoor komt de stationaire fase weer in de ongeladen stand. De binding van de metanefrinen aan de kolom valt weg en de metanefrinen worden van de kolom geëlueerd. Het eluaat wordt vervolgens drooggedampt. In de drooggedampte buis wordt nu een kleine hoeveelheid mobiele fase gebracht. Door weinig eluens te gebruiken vindt er een concentratie stap plaats. Na het oplossen van de metanefrinen kan het monster geïnjecteerd worden op de kolom.[5]

Interne standaard

Tijdens de voorbewerking van het plasma monster wordt een interne standaard (IS) toegevoegd. Dit is een stof welke erg lijkt op de te bepalen component. Tijdens de chromatografische scheiding van het monster gedraagt de interne standaard zich hetzelfde als de te bepalen component. Tijdens de detectie moet er wel onderscheid gemaakt kunnen worden. De interne standaard heeft daarom een andere massa. In dit onderzoek worden er drie gedeutereerde interne standaarden gebruikt. Metanefrine-d3, normetanefrine-d3 en

3-methoxythyramine-d4, deze hebben een m/z waarde van 3 of 4 hoger dan de metanefrinen.

Tijdens de monstervoorbewerking, de ionisatie of op een ander moment tijdens de bepaling kan een deel van de metanefrinen uit het plasma verloren gaan waardoor een lagere hoeveelheid gedetecteerd wordt. Door het toevoegen van een hoeveelheid interne standaard waarvan de concentratie bekend is kan dit verlies van de te bepalen component tijdens het analyse proces gecorrigeerd worden. Een goede interne standaard moet dezelfde eigenschappen vertonen als de te bepalen component, maar mag zelf niet in het monster voorkomen.

Recovery test

Het principe van de recovery test is om te controleren of de hoeveelheid metanefrinen welke op de WCX cartridges worden gebracht er na elueren ook weer af komen, zie figuur 11.

(18)

Wanneer er zich na het elueren een kleinere hoeveelheid metanefrinen in het monster bevindt dan voor de bewerking over de WCX cartridges, is mogelijk een deel verloren gegaan tijdens het SPE proces. Dit kan worden getest door een plasma monster zonder metanefrinen voor te bewerken over de WCX cartridges. Nadat het monster over de cartridges is geweest, wordt het eluaat gespiked, dit wil zeggen dat er een bekende hoeveelheid metanefrinen aan het monster wordt toegevoegd. Bij het tweede monster wordt aan het plasma monster eenzelfde hoeveelheid metanefrinen toegevoegd als aan het eerste monster, maar dan voorafgaand aan de monsterbewerking over de WCX cartridges. Na detectie van de metanefrinen uit beide monsters kan berekend worden of er tijdens het voorbewerkings proces metanefrinen verloren gaan. De opbrengst metanefrinen van monster twee wordt gedeeld door de opbrengst metanefrinen van monster één en vermenigvuldigd met 100. Bij een goede SPE methode is de recovery 100%.

Matrix effect

Niet alleen tijdens de monster voorbewerking kan een deel van de te bepalen componenten verloren gaan. Het kan zijn dat er na de na SPE nog steeds stoffen aanwezig zijn die de bepaling, voornamelijk bij de ionisatie, kunnen verstoren. Om dit te controleren moet bepaald worden of de matrix van het monster effect heeft op de bepaling. In figuur 12 is het principe van de matrix effect test weergegeven.

Figuur 12: Principe matrix effect test.[16]

Een plasma monster zonder metanefrinen wordt met behulp van de WCX cartridges voorbewerkt. Na de elueer stap wordt het monster gespiked met een bekende hoeveelheid metanefrinen. Deze metanefrinen bevinden zich dan in de matrix welke overblijft na de SPE voorbewerking. In het tweede monster bevindt zich dezelfde hoeveelheid metanefrinen, deze bevinden zich echter niet in de matrix welke overblijft na SPE voorbewerking van het plasma maar in dest. Wanneer de matrix geen effect heeft op de bepaling zullen beide monsters dezelfde respons geven tijdens de detectie van de metanefrinen.

(19)

Ion suppressie

Een veel voorkomend en lastig fenomeen bij massa detectie is het optreden van ion suppressie. Dit houdt in dat de ionisatie van de te bepalen componenten beïnvloed wordt door co-eluërende componenten afkomstig uit de matrix. Wanneer een monster voorbewerking methode is ontwikkeld, kan gecontroleerd worden of bij de opgezette analyse methode ion suppressie optreedt. Een voorbeeld van een positieve en negatieve ion suppressie test is weergegeven in figuur 13.

Figuur 13: Voorbeeld ion suppressie test; bovenste chromatogram geen storende ion suppressie en onderste chromatogram wel storende ion suppressie.[15]

Tijdens een ion suppressie test wordt een waterige metanefrine oplossing via directe infusie in de Tandem MS geïnjecteerd. Dit resulteert in een constant signaal van deze metanefrine in de detector. Tegelijkertijd wordt een voorbewerkt plasma monster, zonder metanefrinen, geïnjecteerd op de UPLC-MS/MS. Wanneer componenten uit de matrix ion suppressie veroorzaken zal het constante signaal wat verkregen wordt door de directe infusie van de metanefrine oplossing worden verstoord. Wanneer de ion suppressie samenvalt met de retentietijd van de metanefrinen heeft dit gevolgen voor het kwantificeren van de metanefrinen. Wanneer de ion suppressie plaatsvindt bij een andere retentietijd dan die van de te bepalen component, heeft dit geen invloed op de kwantificering en kan de methode gewoon gebruikt worden.

(20)

4. Materiaal en methode

Het Waters Acquity Ultra Performance LC systeem gekoppeld aan een massaspectrometer, een Triple Quad (TQ) Detector, zie figuur 14, is gebruikt tijdens dit onderzoek. Het opzetten van de methode voor het bepalen van vrije metanefrinen in plasma bestaat uit verschillende stappen. Eerst is literatuur onderzoek uitgevoerd. Hierbij is gezocht naar verschillende artikelen over eerder uitgevoerde onderzoeken naar het opzetten van een methode voor deze bepaling. De methode die in het UMC Groningen wordt voor het bepalen van vrije metanefrinen in plasma, dient als leidraad voor dit onderzoek. Allereerst is begonnen met het opzetten van de MRM methode op de Tandem MS. Daarna is de Chromatografie methode opgezet en vervolgens is de monsterbewerking met behulp van Oasis WCX SPE cartridges onderzocht. In dit hoofdstuk staat de werkwijze beschreven.

Figuur 14: Waters Acquity Ultra Performance LC; Binary Solvant Manager, Sample Manager, TUV Detector, TQ Detector.

4.1 Tandem Massaspectrometer (MS/MS) methode ontwikkeling

Er zijn eerst stockoplossingen van metanefrine, normetanefrine en 3-methoxytyramine gemaakt. Hiervoor zijn de stoffen D,L-Metanephrine hydrochloride, D,L-Normetanephrine hydrochloride en D,L-3-Methoxytyramine hydrochloride van de firma Sigma gebruikt. Deze stockoplossingen zijn gemaakt in dest, de berekeningen hiervan zijn weergegeven in bijlage I.

In het programma Acquity UPLC Consule is via TQ Detector de TQD Instrument Tune Page geopend. Hierin kunnen alle MS parameters worden ingesteld. De verdunde stockstandaarden MN, NMN en 3MT met een concentratie van 10µmol/L zijn één voor één via directe infusie in de massaspectrometer gebracht. Voor het instellen van de parameters zijn meerdere injecties per component nodig en zijn verschillende scans uitgevoerd.

(21)

MS Scan

Als eerste zijn MS scans uitgevoerd. Hierbij wordt in de MS stand gemeten en wordt nog geen gebruik gemaakt van de collision energie zodat de ionen intact blijven. Door de parameter settings in te stellen en aan te passen is gezocht naar de beste instellingen waarmee de precursor zichtbaar wordt bij de juiste m/z waarden en een zo hoog mogelijk signaal geeft. De volgende parameter zijn vastgesteld: capillary voltage, extractor (v), source temperatuur, desolvation temperatuur, gas flow, LM en HM resolutions, ion energie 1 en 2, entrance en exit collision cell en collision gas flow zodat deze voor alle drie de componenten optimaal signaal gaven. Voor het instellen van de parameters zijn meerder metingen gedaan.

Product scan

Vervolgens zijn voor MN, NMN en 3MT een product scans uitgevoerd. Hierbij is gemeten in de MS/MS stand. Door de collision energie verdween de precursor piek of is deze kleiner en ontstaan de product ionen, deze worden in de product scan zichtbaar. Tijdens het infuseren worden de parametersettings verder geoptimaliseerd om een zo hoog mogelijk signaal te verkrijgen voor alle drie de componenten. Voor het optimaliseren worden meerdere metingen gedaan.

Auto tune

Voor alle drie de componenten is één zelfde tune file gemaakt, alleen de instellingen van het cone voltage en de collision energie verschillen per component. Via de functie Auto tune wizard in het programma Acquity UPLC Consule zijn scans gemaakt waarmee de optimale cone voltage en collision energie bepaald zijn. Voor het maken van deze scans worden via directe infusie stockoplossing van 10µmol/L per component geïnjecteerd. Uit deze scans zijn tevens de precieze m/z waarden van de precursor ionen en product ionen bepaald en ion spectra gemaakt. De scans zijn per component verschillende keren achter elkaar uitgevoerd.

Later in het onderzoek worden ook voor de drie gedeutereerde interne standaarden de m/z waarden van de precursor ionen en van de product ionen bepaald. Evenals de optimale instellingen per component voor het cone voltage en de collision energie. Dit gebeurt op dezelfde manier als hierboven beschreven is voor de metanefrinen componenten.

(22)

4.2 Chromatografie methode ontwikkeling

Voor het ontwikkelen van de chromatografie methode moet een geschikte kolom en eluens worden gekozen. De optimale pH van het eluens en de gradiënt moet bepaald worden evenals de optimale temperatuur van de kolom.

Naar aanleiding van het literatuur onderzoek is gekozen voor een Acquity UPLC BEH amide kolom[11]_{. In hetzelfde artikel wordt voor eluens A gebruik gemaakt van 100mmol/L}

ammoniumformate op pH 3 gebracht met formic acid. Eluens B is 100% acetonitril (ACN) [11]_.

Deze eluens samenstelling is gebruikt voor het bepalen van de gradiënt waarmee de metanefrinen het beste gescheiden worden. Vanuit de waterige stock oplossingen MN, NMN en 3MT is een mengsel gemaakt met een concentratie van 330 nmol/L. Verschillende gradiënten zijn getest.

Nadat de beste gradiënt gekozen is, wordt de pH van eluens A geoptimaliseerd. Eluens A wordt eerst 1:1 gemengd met ACN. Door middel van verschillende hoeveelheden formic acid toe te voegen worden verschillende pH-waarden verkregen. Eluens A met een pH van 2.1, 3, 4 en 6.9 zijn getest. Ook de temperatuur van de kolom is geoptimaliseerd. Dit is gedaan door dezelfde meng oplossingen van metanefrinen te injecteren bij verschillende temperaturen van de kolom. Er is gemeten bij een kolom temperatuur van 30°C, 35°C, 40°C en 45°C. De gemeten pieken in de chromatogrammen van de verschillende metingen zijn vergeleken. De optimale instellingen waarbij het signaal het hoogste is en de componenten het meest gescheiden zijn is gekozen als optimale instelling.

De gevoeligheid (minimale detectie limiet) van de methode is bepaald door een verdunningsreeks te meten van de stockoplossing van het mengsel MN, NMN en 3MT met eindconcentraties van 10nmol/L, 2,5nmol/L, 1nmol/L, 0,33nmol/L en 0,1nmol/L. Vooraf is de cone van de MS goed schoon gemaakt om zo maximale ionisatie te krijgen. Het eluens is vers gemaakt. Het gebruikte eluens A is 100nM Ammoniumformate + ACN (1:1) op pH 4 gebracht met formic acid en eluens B is 100% ACN. Het injectie volume is 40 µl, hiervoor wordt een sample loop van 50µl en een sample syringe van 250µl gebruikt. De kolom temperatuur is ingesteld op 40°C. Een meting duurt 8 minuten, waarbij het eluens met een gradiënt van 0% naar 35% eluens A in 5 minuten over de kolom wordt gepompt. Vanaf 5,5 tot 8 minuten wordt 100% eluens B gepompt. Deze verdunningsreeks is meerder keren gemeten.

Nadat de instellingen voor de chromatografische scheiding van de componenten zijn geoptimaliseerd is een reproduceerbaarheidtest uitgevoerd. Een monster met een lage concentratie (1nmol/L) en een monster met een hogere concentratie (10nmol/L) worden beiden 10 keer geïnjecteerd. De drie interne standaarden (d3-metanefrine-HCL, α,β,β-d3-normetanefrine-HCL en α,α,β,β-d4-3-methoxytyramine-HCL) toegevoegd aan de waterige metanefrine oplossingen zijn hiervoor gebruikt. Het precieze oplossen van de interne standaarden is weergegeven in bijlage II. De gebruikte oplossing van de interne standaarden die aan het lage en hoge metanefrinen monster is toegevoegd heeft een concentratie van 10nmol/L. Na de metingen wordt de ratio berekend door van de gemeten pieken de oppervlakte van de metanefrinen pieken te delen door de piek oppervlakte van de bijbehorende interne standaard. Vervolgens wordt het gemiddelde, de standaarddeviatie en de variatie coëfficiënt berekend.

(23)

4.3 Monstervoorbewerking methode ontwikkeling

Tot nu toe zijn alleen waterige metanefrinen oplossingen gemeten. Plasma monsters mogen niet onvoorbewerkt geïnjecteerd worden in de UPLC-MS/MS. Dit is omdat in plasma te veel andere stoffen, zoals eiwitten, voorkomen die een verstopping van de kolom of op een andere manier voor vervuiling van het systeem kunnen veroorzaken.

Allereerst is als voorbewerking gekozen voor het opschonen van plasma door middel van een centrifuge micro filter units het materiaal een half uur af te draaien bij 16000 rpm. De filter unit zorgt ervoor dat grote moleculen zoals eiwitten worden tegen gehouden en uit het monster worden verwijderd. Deze methode leverde geen goede resultaten op en hiermee is dan ook niet verder getest.

Uit literatuur onderzoek bleek dat Oasis WCX SPE cartridges gebruikt kunnen worden als een geschikte monster bewerkingsmethode[12]_{. Verschillenden methoden voor het gebruik van}

deze cartridges zijn getest, hiervoor is eerst gebruik gemaakt van gespiked plasma met een hoge metanefrinen concentraties van 330nmol/L.

De cartridges moeten eerst geconditioneerd worden. Het conditioneren is getest met 1ml methanol gevolgd door 1ml 10nM ammoniumhydrogeenfosfaat pH 6,5. Daarna is 1ml 10nM ammoniumhydrogeenfosfaat vervangen door 1ml dest. Na het opbrengen van de monsters worden de cartridges gewassen met 1ml dest en 1 ml methanol. Verder is nog een extra wasstap met 1 ml 0,2% formic acid in ACN getest. Echter dit leverde niet het gewenste resultaat omdat een groot deel van de metanefrinen van de kolom worden gespoeld. Voor de elueer stap worden schone reageerbuizen onder de cartrigdes gezet waarin het eluaat met daarin de metanefrinen wordt opgevangen. De metanefrinen worden met behulp van 1ml 2% formic acid in ACN van de cartridges geëlueerd. Het beste resultaat wordt verkregen wanneer in 2 stappen met 500µl 2% formic acid in ACN wordt geëlueerd. Na de eluatie van de metanefrinen van de cartridges wordt het eluaat drooggedampt met behulp van N2 bij

60°C.

Het bewerken van het plasma voordat het over de cartridges gaat is ook op verschillende manieren getest. De cartridges leken soms “dicht te slaan” als het plasma wordt opgebracht. Het dicht slaan kan veroorzaakt worden door eiwit in het plasma. Daarom is getest of plasma onteiwitting betere resultaten geeft. Hiervoor is het plasma onteiwit met methanol of acetonitril of 4% fosforzuur. Echter bij lage metanefrinen waarden geeft dit geen betere resultaten. 500µl plasma is uiteindelijk 1:1 verdund met dest alvorens het op de cartrigdes wordt gebracht.

Nadat een methode voor de monster voorbewerking is opgezet is verder gekeken naar de recovery, zoals uitgelegd in hoofdstuk 3.4. Deze test is 2x uitgevoerd. Beide keren zijn de cartridges eerst geconditioneerd met 1 ml methanol en vervolgens met 1 ml dest. Na het conditioneren worden de monsters opgebracht (=1ml). Het wassen van de cartridges gebeurt met 1 ml dest gevolgd door 1 ml methanol. Elutie van de MN’s gebeurd met 2x 500µl 2% Formic acid in ACN. Het eluaat wordt opgevangen in een schone reageerbuis en drooggedampt met N2 bij 60°C. Na het droogdampen worden de MN’s opgelost in 200µl ACN.

(24)

Bij de eerste recovery test wordt monster 1 bereid door aan 500µl plasma, 500µl stock oplossing MN, NMN, 3MT + IS MN-d3, NMN-d3 en 3MT-d4 met een concentratie van 50nmol/L toe te voegen. Monster 2 wordt gemaakt door aan 500µl plasma, 500µl dest toe te voegen. Monster 2 wordt pas gespiked met 500µl van dezelfde stock oplossing MN’s + IS nadat de voorbewerking over de WCX cartridges is uitgevoerd. Monster 3 is een duplo van monster 1 en monster 4 is een duplo van monster 2. In figuur 15 is de werkwijze van de eerste recovery test weergegeven. Alle monsters zijn in triplo gemeten.

Figuur 15: Methode eerste recovery test.

Bij de tweede uitvoering van de recovery test is plasma eerst gespiked met de metanefrinen stock oplossing tot een concentratie van MN, NMN en 3MT van respectievelijk 20nmol/L. De interne standaarden zijn opgelost in een aparte waterige stockoplossing met een concentratie van 20nmol/L. Monster 1 is bereid door 500µl van het gespikte plasma te verdunnen met 500µl met de waterige stockoplossingen met IS. Voor monster 2 is 500µl plasma gebruikt zonder toegevoegde metanefrinen + 500µl van de waterige stockoplossing met IS. Het verschil in recovery test 2 ten opzichte van recovery test 1 is dat monster 2 voor de bewerking over de WCX cartridges IS bevat en dit is niet het geval in recovery test 1. Aan monster 2 wordt dezelfde hoeveelheid metanefrinen toegevoegd na het voorbewerken over

(25)

de WCX cartridges als waarmee het plasma van monster 1 gespiked is. In figuur 16 is de werkwijze van recovery test 2 weergegeven. Deze test bevat ook een duplo van monster 1 (monster 3) en een duplo van monster 2 (monster 4). De monsters zijn in triplo gemeten.

(26)

5. Resultaten

5.1 Tandem Massaspectrometer (MS/MS) methode ontwikkeling

De optimale parameter settings die in de instrument methode gebruikt worden voor de bepaling van metanefrinen zijn te vinden in de MS tune file: MN. In tabel 3 zijn deze parameter settings weergegeven.

Tabel 3: Parameter settings MS tune file: MN.

Parameter Setting

Capillary (kV) 3.00

Cone (V) Verschillend per component:

Zie tabel 4

Extractor (V) 3.00

RF (V) 0.20

Source Temperatuur 140

Desolvation Temperatuur 400

Cone Gas Flow (L/Hr) 1000

Collision Gas Flow (mL/Min) 0.25

LM 1 Resolution 15.00

HM 1 Resolution 15.00

Ion Energie 1 0.50

MS Mode Entrance 50.00

MS mode Collision Energie 1.00

MS Mode Exit 30.00

MSMS Mode Entrance 1.00

MSMS Mode Collision Energie Verschillend per component: Zie tabel 4 MSMS Mode Exit 1.00 LM 2 Resolution 15.00 HM Resolution 15.00 Ion energie 2 1.00 Gain 1.00

(27)

Het optimale cone voltage en de optimale collision energie zijn per component verschillend. De chromatogrammen die verkregen zijn met de auto tune scans zijn weergegeven in figuur 17, 18 en 19.

Metanefrine

Figuur 17: Chromatogrammen auto tune scan, optimale cone voltage en collision energie voor metanefrine.

(28)

Normetanefrine

Figuur 18: Chromatogrammen auto tune scan, optimale cone voltage en collision energie voor normetanefrine.

(29)

3-Methoxytyramine

Figuur 19: Chromatogrammen auto tune scan, optimale cone voltage en collision energie voor 3-methoxytyramine.

(30)

Er is van metanefrine, normetanefrine en 3-methoxytyramine een ion spectrum gemaakt. Hierin is te zien welke product ionen gevormd worden na fragmentatie in de collision cell. In figuur 20 zijn deze ion spectra weergegeven.

Figuur 20: Ion spectra van metanefrine (A), Normetanefrine (B), en 3-Methoxytyramine (C).

Met behulp van de resultaten verkregen met de auto tune scans en de ion spectra zijn de optimale instellingen voor de MRM methode vastgesteld. In tabel 4 zijn de MRM instellingen voor de metanefrinen en de gedeutereerde interne standaarden (IS) weergegeven.

Tabel 4: MRM instellingen voor de metanefrinen en de gedeutereerde interne standaarden.

Component Precursor Massa (m/z) Product Massa (m/z) Cone Voltage Collision Energie MN 180.10 148.3 44 17 IS MN-d3 183.18 151.2 48 17 NMN 166.04 134.1 34 18 IS NMN-d3 169.11 137.0 38 15 3MT 151.04 119.1 40 14 IS 3MT-d4 155.17 122.9 52 14

(31)

5.2 Chromatografie methode ontwikkeling

Voor het optimaliseren van de eluens gradiënt zijn verschillende gradiënten getest. In figuur 21 t/m 25 zijn de chromatogrammen weergegeven waarbij gemeten is met verschillende gradiënten. In rood is weergegeven 3-methoxytyramine, in groen metanefrine en in blauw is normetanefrine.

Figuur 21: Chromatogram met MN, NMN en 3MT componenten voor het optimaliseren van de eluens gradiënt, waarbij als eluens A 100mM ammoniumformaat op pH 3 gebracht met formic acid is gebruikt en als eluens B 100% acetonitril (ACN).

(32)

Een gradiënt waarbij in 0 tot 5 minuten eluens A van 0% naar 35% gaat, zoals in figuur 25 is weergegeven, geeft de beste scheiding van de metanefrinen. Voor het verdere optimaliseren van de chromatografische scheiding van de componenten is van deze gradiënt gebruik gemaakt. De chromatogrammen die verkregen zijn tijdens het optimaliseren van de eluens pH zijn weergegeven in figuur 26 t/m 29.

pH 2,1

Figuur 26: Chromatogram met MN, NMN en 3MT componenten waarbij als eluens A 100mM Ammoniumformaat + ACN (1:1) met pH 2,1 is gebruikt.

(33)

pH 3

Figuur 27: Chromatogram met MN, NMN en 3MT componenten waarbij als eluens A 100mM Ammoniumformaat + ACN (1:1) met pH 3 is gebruikt.

pH 4

Figuur 28: Chromatogram met MN, NMN en 3MT componenten waarbij als eluens A 100mM Ammoniumformaat + ACN (1:1) met pH 4 is gebruikt.

pH 6,9

Figuur 29: Chromatogram met MN, NMN en 3MT componenten waarbij als eluens A 100mM Ammoniumformaat + ACN (1:1) met pH 6,9 is gebruikt.

(34)

Er is gekeken naar de beste scheiding van de pieken, de mooiste vorm van de piek en de hoogte van de piek. Hieruit blijkt dat eluens A met een pH van 4 het beste resultaat geeft. Bij de volgende metingen is daarom voor eluens A 100mM Ammoniumformaat + ACN (1:1) met pH 4 gebruikt. In alle voorgaande metingen was de temperatuur van de kolom 30°C. Figuur 30 t/m 32 laat metingen zien van waterige mengsels van MN, NMN en 3MT waarbij de kolom temperatuur gevarieerd is.

35°C

Figuur 30: Chromatogram MN, NMN, 3MT verkregen met kolom temperatuur 35°C.

40°C

Figuur 31: Chromatogram MN, NMN, 3MT verkregen met kolom temperatuur 40°C.

45°C

(35)

De chromatogrammen welke verkregen zijn met variërende kolom temperaturen lijken vrij veel op elkaar. De metanefrinen componenten worden vrijwel op dezelfde manier gescheiden. De pieken welke gemeten zijn met een kolom temperatuur van 40°C geven in vergelijking met de andere geteste temperaturen een hoger respons.

De chromatogrammen van de verdunningsreeksen gemaakt met waterige oplossing van MN, NMN en 3MT zijn afgebeeld is figuur 33 t/m 37. In de chromatogrammen is in rood 3MT, in paarse MN en in groen de NMN piek. Bij de concentraties van 1nmol/L, 0,33nmol/L en 0,1nmol/L zijn ook de chromatogrammen van de afzonderlijke massakanalen van MN, NMN en 3MT weergegeven om de piekvorm per component beter te kunnen beoordelen.

10nmol/l

Figuur 33: Chromatogram metanefrinen mengsel 10nmol/L.

2,5 nmol/l

(36)

Figuur 35: Het chromatogram van een metanefrinen mengsel van 1nmol/L, daaronder zijn chromatogrammen massa kanaal MN, NMN en 3MT afzonderlijk weergegeven.

Figuur 36: Het chromatogram van een metanefrinen mengsel van 0,33nmol/L, daaronder zijn chromatogrammen massa kanaal MN, NMN en 3MT afzonderlijk weergegeven.

(37)

Figuur 37: Het chromatogram van een metanefrinen mengsel van 0,1nmol/L, daaronder zijn chromatogrammen massa kanaal MN, NMN en 3MT afzonderlijk weergegeven.

In de chromatogrammen van de metanefrinen mengsels met concentraties van 10nmol/L, 2,5nmol/L en 1nmol/L hebben de pieken een mooie vorm en is het signaal hoog genoeg voor kwantificatie. Bij een concentratie van 0,33nmo/L metanefrinen hebben de pieken al een iets minder mooie vorm. In chromatogram van het metenafrinen mengsel met een concentratie van 0,1nmol/L is de ruis goed te zien. De pieken komen nog boven de ruis uit en zijn te herkennen maar hebben geen hoog signaal en mooie vorm.

Bij de uitgevoerde reproduceerbaarheids test zijn een waterig metanefrinen mengsel met een concentratie van 10nmol/L en een met een concentratie van 1nmol/l beiden 10x achter elkaar gemeten. De gemeten area’s van de 3MT, NMN, MN en IS pieken zijn weergegeven in tabel 5 en 6.

Tabel 5: Reproduceerbaarheids test, gemeten area’s 10nmol/L mengsel metanefrinen en IS.

10nmol/L Area’s Meting 3MT 3MT-d4 NMN NMN-d3 MN MN-d3 1 232162 91812 84176 88210 143400 221633 2 216140 83618 80910 71526 147157 203348 3 222312 85882 78520 80801 144076 199083 4 232321 88813 81294 84034 139150 218236 5 246189 91962 83836 84137 137769 205645 6 242429 92671 80667 83972 137758 217078 7 227796 91027 79048 79058 136485 203105 8 237677 94766 81368 80903 133767 203250 9 230365 95157 70109 78559 140682 210693 10 247616 92597 79016 82258 135621 208147

(38)

Tabel 6: Reproduceerbaarheids test, gemeten area’s 1nmol/L mengsel metanefrinen en IS. 1nmol/L Area’s Meting 3MT 3MT-d4 NMN NMN-d3 MN MN-d3 1 31380 118473 9745 94654 18842 263367 2 31321 108110 11550 88234 17647 249309 3 30636 94813 10647 82743 15752 244648 4 25876 95376 10672 84426 15742 234528 5 26098 90564 10585 80823 14739 229752 6 26698 89077 11558 85743 13517 213145 7 27363 100238 7714 73499 14949 225859 8 25626 91427 10416 70196 13856 219504 9 22804 83641 10815 83417 12207 201026 10 24855 87035 8858 68174 14541 212263

In tabel 5 en 6 is te zien dat verschillende area’s worden gemeten wanneer 10x achter elkaar hetzelfde monster is geïnjecteerd. Het berekenen van de concentraties bij deze analysemethode gebeurt niet aan de hand van de gemeten area’s MN, NMN en 3MT maar aan de hand van de ratio’s. De berekende ratio’s zijn weergegeven in tabel 7. De berekende gemiddelden (Gem), de standaarddeviaties (Stdv) en de variatiecoëfficiënten (VC) zijn ook weergegeven in deze tabel.

Tabel 7: Resultaten produceerbaarheidstest, berekende variatiecoëfficiënten aan de hand van de ratio’s. Meting Ratio’s 10nM 3MT/ 3MT-d4 NMN/ NMN-d3 MN/ MN-d3 1nM 3MT/ 3MT-d4 NMN/ NMN-d3 MN/ MN-d3 1 2,53 0,95 0,65 0,26 0,10 0,07 2 2,58 1,13 0,72 0,29 0,13 0,07 3 2,59 0,97 0,72 0,32 0,13 0,06 4 2,62 0,97 0,64 0,27 0,13 0,07 5 2,68 1,00 0,67 0,29 0,13 0,06 6 2,62 0,96 0,63 0,30 0,13 0,06 7 2,50 1,00 0,67 0,27 0,10 0,07 8 2,51 1,01 0,66 0,28 0,15 0,06 9 2,42 0,89 0,67 0,27 0,13 0,06 10 2,67 0,96 0,65 0,29 0,13 0,07 Gem 2,57 0,98 0,67 Gem 0,28 0,13 0,07 Stdv 0,08 0,06 0,03 Stdv 0,02 0,01 0,00 VC 3,16 6,18 4,75 VC 5,98 10,62 5,30

(39)

5.3 Monstervoorbewerking methode ontwikkeling

Plasma gespiked met MN, NMN en 3MT van 20nmol/L + IS is met behulp van een WCX cartridge voorbewerkt en gemeten met de opgezette UPLC-MS/MS methode. Het chromatogram na detectie is weergegeven in figuur 38. Bij deze metanefrinen concentratie is de respons van de pieken hoog genoeg voor kwantificatie van de metanefrinen.

Figuur 38: Chromatogram gespiked plasma (20nmol/L MN, NMN en 3MT) + IS.

De recovery test geeft aan of er tijdens de voorbewerking van het plasma een deel van de metanefrinen verloren gaat. In afbeelding 39 is een chromatogram weergegeven van monster 1 van recovery test 2. Hierbij is het plasma gespiked met MN, NMN en 3MT voorafgaand aan de voorbewerking over de WCX cartridge. In afbeelding 40 is een chromatogram weergegeven van monster 2 van recovery test 2. Hierbij is dezelfde concentratie MN, NMN en 3MT pas aan het monster toegevoegd is na voorbewerking over de WCX cartridges.

Figuur 39: Chromatogram monster 1 recovery test 2, plasma gespiked met MN, NMN en 3MT voorafgaand aan de voorbewerking over de WCX cartridge.

(40)

Figuur 40: Chromatogram monster 2 recovery test 2, waarbij MN, NMN en 3MT pas na de voorbewerking over de WCX cartridge zijn toegevoegd aan het monster.

De respons van de MN, NMN en 3MT pieken in het chromatogram in figuur 40 is veel hoger dan dat van de MN, NMN en 3MT pieken in het chromatogram in figuur 39. De interne standaarden zijn bij deze test op dezelfde manier voorbewerkt en geven ongeveer gelijke pieken in beide chromatogrammen.

De gemeten area’s van de metanefrinen en IS van recovery test 1 zijn weergegeven in tabel 8. In deze tabel zijn de duplo’s weergegeven in dezelfde kleur en is elk monster in triplo gemeten.

Tabel 8 : Recovery test 1, gemeten area’s metanefrinen en IS.

De gemeten area’s van de metanefrinen componenten van monster 1 en 3 zijn duidelijk lager dan die van monster 2 en 4. De recovery in procenten zou per component berekend kunnen worden door de respons (area) van M1 te delen door M2 en dit te vermenigvuldigen met 100. In tabel 9 is op deze manier de recovery berekend.

(41)

Tabel 9: Recovery berekend aan de hand van de respons van de metanefrinen pieken van recovery test 1. Recovery MN Recovery NMN Recovery 3MT (gem M1/ gem M2)*100 70,3% 21,2% 86,0% duplo (gem M3/ gem M4)*100 61,0% 22,9% 75,5%

In tabel 8 is echter te zien dat de respons steeds verschillend is wanneer het zelfde monster 3x achter elkaar wordt gemeten. Hierdoor zijn de berekende recovery’s in tabel 9 niet betrouwbaar. De duplo’s van de berekende recovery’s zijn ook niet gelijk. Vooral de recovery van de NMN is erg laag.

Het berekenen van de concentratie met deze methode gebeurd aan de hand van de ratio’s. De berekende ratio’s zijn weergegeven in tabel 10.

Tabel 10: Berekende ratio’s 3MT, NMN en MN van recovery test 1.

In tabel 10 is te zien dat wanneer de ratio’s berekend zijn het verschil in respons per component grotendeels gecompenseerd wordt door de IS.

De gemeten area’s van de metanefrinen en IS van recovery test 2 zijn weergegeven in tabel 11. In deze tabel zijn de duplo’s weergegeven in dezelfde kleur en is elk monster in triplo gemeten.

(42)

Tabel 11: Recovery test 2, gemeten area’s metanefrinen en IS.

Bij recovery test 2 zijn de gemeten area’s van MN, NMN en 3MT van monster 1 en 3 ook duidelijk lager dan die van monster 2 en 4. Maar aan de hand van de respons van de metanefrinen pieken kan ook hier geen betrouwbare recovery worden berekend.

(43)

6. Conclusie

De verwachting was dat bij de opgegeven massa’s de optimale parameter setting van de MS/MS gevonden zouden worden. Deze massa’s van de precursor en product ionen die in de literatuur worden vermeld zijn voor MN 180 m/z  148 m/z, NMN 166 m/z  134 en voor 3MT 151 m/z  119 m/z.[5]_{De optimale parameter settings van de MS/MS zijn vastgesteld.}

De verwachte massa’s zijn teruggevonden tijdens het opzetten van de MRM methode, hierbij is gebruik gemaakt van positieve elektrospray ionisatie. MN, NMN en 3MT kunnen met de opgezette MRM methode worden gedetecteerd.

Verwacht werd dat met behulp van een Acquity UPLC BEH amide kolom de metanefrinen in het plasma monster gedeeltelijk gescheiden konden worden. Als met een gradiënt van 0 naar 5 minuten 0% A naar 35% A, voor Eluens A: 100mmol/l ammoniumformate + ACN (1:1) pH 4 en Eluens B: 100% acetronetrile wordt gebruikt en de kolom temperatuur 40°C is komen de MN en de NMN componenten gescheiden van elkaar de MS binnen, de 3MT piek coëlueert gedeeltelijk met de MN piek. Een volledige scheiding van de metanefrinen op de kolom is niet noodzakelijk omdat de componenten op massa worden gedetecteerd.

De methode zoals hier opgezet kan niet voorbewerkte waterige metanefrinen mengsels tot 0,1nmol/L gedetecteren. Hogere concentraties zoals 0,33nmol/l geven betere resultaten, mooie pieken die gekwantificeerd zouden kunnen worden. De pieken van de 0,1nmol/L metanefrinen kunnen nog wel herkend worden maar hebben geen hoge respons of mooie piekvorm daardoor zijn deze niet nauwkeurig te integreren en dus minder nauwkeurig te kwantificeren. De berekende variatiecoëfficiënten in bij de reproduceerbaarheids test liggen hoger bij de lage concentraties. Variatiecoëfficiënten van 10% bij deze concentraties en techniek zijn aanvaardbaar. Alleen de NMN bij een concentratie van 1nmol/L valt hier net buiten.

Verwacht werd dat met behulp van Oasis WCX SPE cartridges de plasma monsters voldoende voorgezuiverd en geconcentreerd konden worden voor het bepalen van de metanefrinen in plasma[12]_{. Hoge concentraties metanefrinen (20nmol/L) zijn gedetecteerd nadat het plasma}

voorbewerkt was met behulp van de Oasis WCX SPE cartridges. Hierbij zijn mooie pieken verkregen welke gekwantificeerd zouden kunnen worden. Uit de recovery test blijkt echter dat een groot deel van de metanefrinen verloren gaat tijdens het voorbewerkingsproces van het plasma. Hierdoor kunnen de lage concentraties in plasma niet gedetecteerd worden.

(44)

7. Discussie/aanbeveling

Voor het bepalen van de gevoeligheid van de methode zijn verdunningsreeksen van waterige metanefrinen oplossingen gemeten. De lage concentraties van waterige standaarden die gemeten zijn, worden nog niet gedetecteerd in plasma. De precieze limit of quantification (LOQ) kan bepaald worden via EP Evaluator m.b.v. een lineaire verdunning in plasma. Ook de uitgevoerde reproduceerbaarheids test is met waterige metanefrinen oplossingen. Deze test zou nog eens herhaald moeten worden maar dan met gespiked plasma om te controleren of dezelfde variatiecoëfficiënten ook hiervoor gelden.

De lage concentraties metanefrinen die normaal in plasma voorkomen zijn met behulp van de opgezette methode nog niet gedetecteerd. Bij een metanefrinen concentratie van 20nmol/L is de respons van de pieken hoog genoeg voor kwantificatie van de metanefrinen. De concentraties metanefrinen die normaal in plasma voorkomen zijn kleiner dan 0,33nmol/L. Als deze lage concentraties metanefrinen gemeten zouden worden, zou er in vergelijking met de respons wat gemeten wordt bij 20nmol/L maar een erg laag signaal overblijven. Dit signaal is niet hoog genoeg voor kwanitificatie. Uit de recovery bleek dat een vrij groot deel van de metanefrinen verloren gaat tijdens de monstervoorbewerking. De monster voorbewerkingsmethode met behulp van de Oasis WCX SPE cartridges moet daarom geoptimaliseerd worden zodat er zo min mogelijk verlies van de metanefrinen plaatsvindt tijdens het voorbewerkingsproces. De offline voorbewerking met behulp van weak cation exchange SPE is afgeleid van de online versie zoals in het UMC Groningen wordt gebruikt[10]_{. Echter is al uit eerder uitgevoerd onderzoek gebleken dat offline voorbewerking}

van het plasma m.b.v SPE cartridges een slechtere recovery oplevert in vergelijking met online monster voorbewerking [14]_.

Offline SPE is geen ideale methode wanneer gebruik gemaakt wordt van een minder gevoelige detector[14]_{. Als de methode helemaal geoptimaliseerd is en de lage concentraties}

welke normaal voorkomen in plasma nog steeds niet bepaald kunnen worden, is een gevoeligere detector noodzakelijk.

Voor het kwantificeren van metanefrinen in plasma moeten nog geschikte standaarden gemaakt worden om aan de hand van een ijklijn de concentraties af te lezen. Een ionsuppressie test en de test om het matrix effect te bepalen kunnen pas uitgevoerd worden wanneer de precieze voorbewerkingmethode van de monsters vast staat.

Wanneer de methode zo geoptimaliseerd is dat de lage concentraties in plasma bepaald kunnen worden, moet de methode nog worden gevalideerd. Hierbij moet onder andere de precisie, lineariteit en Limit of quantification(LOQ) bepaald worden. Ook moet een methode vergelijking uitgevoerd worden om de opgezette methode te vergelijken met de resultaten van een bestaande methode. Pas wanneer de resultaten van de methode valide zijn, mag de methode voor het bepalen van vrije metenafrinen in plasma in de praktijk in gebruik genomen worden.

(45)

Literatuurlijst

1. R.R.H. Nap, J.R. Meinardi, G.van den Berg, R.P.F.Dullaart, J.de Vries en B.H.R. Wolffenbuttel.

Langdurige controle aangewezen na chirurgische behandeling wegens een feochromocytoom. Ned Tijdschr Geneeskd. 2006 13 mei;150(19)

2. J.M. Pekelharing, J.H.M. Souverijn, H. Hooijkaas, J.M.H.M. Punt, L.C. Smeets. Handboek

medische laboratorium diagnostiek. 2009. Prelum, Houten. Blz 145-147

3. A. Kooy., R.K.J. Hoorn., Strategische diagnostiek van endocriene ziekten: een leidraad voor

de praktijk.(2004) Tweede druk. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten. Blz 57

4. Lenders JW, Pacak K, Walther MM, Linehan WM, Mannelli M, Friberg P, et al. Biochemical

diagnosis of pheochromocytoma:which test is best? JAMA 2002;287:1427–34.

5. Wilhelmina H.A. de Jong, Kendon S. Graham,2 Jan C. van der Molen, Thera P. Links, Michael R. Morris, H. Alec Ross, Elisabeth G.E. de Vries, and Ido P. Kema. Plasma Free

Metanephrine Measurement Using Automated Online Solid-Phase Extraction HPLC–Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry 53, No. 9, 2007

6. C.J.H. van de Velde, W.T.A. van der Graaf, J.H.J.M. van Krieken, C.A.M. Marijnen, J.B. Vermorken. Oncologie. (2011) achtste druk. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten. Blz 532

7. D.G. Gardner, D. Shoback. Greenspan's Basic & Clinical Endocrinology. (2007) 8e_Editie.

McGraw-Hill

8. Morgane Suys. Prof. dr. Apr. S. De Saeger. Ontwikkeling van een analysemethode voor de

bepaling van cortisol in haar als biomarker voor chronische stress bij kinderen. Universiteit

Gent, Faculteit farmaceutische wetenschappen. Vakgroep Bioanalyse, laboratorium voor Bromatologie. Academiejaar 2010-2011.

9. University of Bristol. Mass Spectrometry

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/cid-fragmentation.html Geraadpleegd op 26-11-2012

10. Susan A. Lagerstedt, Dennis J. O’Kane, and Ravinder J. Singh. Measurement of Plasma

Free Metanephrine and Normetanephrine by Liquid Chromatography-Tandem Mass

Spectrometry for Diagnosis of Pheochromocytoma. Clinical Chemistry 50:3. 603-611 (2004)

11. Heather A Brown, Lisa J Calton, Donald P Cooper. Automated solid phase extraction of

plasma metanephrine, normetanephrine and 3-methoxytyramine for analysis by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Waters Corporation, Atlas Park, Manchester

UK. 2011

12. Gabler J, Yuan C, Woroniecki W, Liu H, Wang S (2012). A Sensitive and Interference-Free

Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for Measuring Metanephrines in Plasma. J Chromatograph Separat Techniq S2:001.

(46)

13. Baars, B., van den Berg, J., Jansen, H., Schoenmakers, P., Tijssen, R., Vonk, N.,

Chromatografie in de praktijk, vloeistofchromatografie. Aanvulling 11, 2001. ten Hagen &

Stam b.v., Den Haag.

14. Luce, C. Marney, Thomas J. Laha, Geoffrey S. Baird, Petrie M. Rainey and Andrew N. Hoofnagle. Isopropanol Protein Precipitation for the Analysis of Plasma Free Metanephrines

by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry 54:10. 1729-1732

(2008)

15.Gert Hendriks. Presentatie: Aspecten van methode ontwikkeling LC-MS/MS bepalingen. PRA. Transforming clinical trials

16. Waters corporation. Powerpoint presentatie: SPE Troubleshooting and Optimization Applied to the Oasis® 2x4 Method. 2007

17. Waters. Oasis Sample Extraction Products

http://www.waters.com/waters/en_NL/Oasis-Sample-Extraction-Products/ nav.htm?cid= 513209&locale=en_NL Geraadpleegd op 06-03-2013