Voor het bepalen van de gevoeligheid van de methode zijn verdunningsreeksen van waterige metanefrinen oplossingen gemeten. De lage concentraties van waterige standaarden die gemeten zijn, worden nog niet gedetecteerd in plasma. De precieze limit of quantification (LOQ) kan bepaald worden via EP Evaluator m.b.v. een lineaire verdunning in plasma. Ook de uitgevoerde reproduceerbaarheids test is met waterige metanefrinen oplossingen. Deze test zou nog eens herhaald moeten worden maar dan met gespiked plasma om te controleren of dezelfde variatiecoëfficiënten ook hiervoor gelden.
De lage concentraties metanefrinen die normaal in plasma voorkomen zijn met behulp van de opgezette methode nog niet gedetecteerd. Bij een metanefrinen concentratie van 20nmol/L is de respons van de pieken hoog genoeg voor kwantificatie van de metanefrinen. De concentraties metanefrinen die normaal in plasma voorkomen zijn kleiner dan 0,33nmol/L. Als deze lage concentraties metanefrinen gemeten zouden worden, zou er in vergelijking met de respons wat gemeten wordt bij 20nmol/L maar een erg laag signaal overblijven. Dit signaal is niet hoog genoeg voor kwanitificatie. Uit de recovery bleek dat een vrij groot deel van de metanefrinen verloren gaat tijdens de monstervoorbewerking. De monster voorbewerkingsmethode met behulp van de Oasis WCX SPE cartridges moet daarom geoptimaliseerd worden zodat er zo min mogelijk verlies van de metanefrinen plaatsvindt tijdens het voorbewerkingsproces. De offline voorbewerking met behulp van weak cation exchange SPE is afgeleid van de online versie zoals in het UMC Groningen wordt gebruikt[10]. Echter is al uit eerder uitgevoerd onderzoek gebleken dat offline voorbewerking
van het plasma m.b.v SPE cartridges een slechtere recovery oplevert in vergelijking met online monster voorbewerking [14].
Offline SPE is geen ideale methode wanneer gebruik gemaakt wordt van een minder gevoelige detector[14]. Als de methode helemaal geoptimaliseerd is en de lage concentraties
welke normaal voorkomen in plasma nog steeds niet bepaald kunnen worden, is een gevoeligere detector noodzakelijk.
Voor het kwantificeren van metanefrinen in plasma moeten nog geschikte standaarden gemaakt worden om aan de hand van een ijklijn de concentraties af te lezen. Een ionsuppressie test en de test om het matrix effect te bepalen kunnen pas uitgevoerd worden wanneer de precieze voorbewerkingmethode van de monsters vast staat.
Wanneer de methode zo geoptimaliseerd is dat de lage concentraties in plasma bepaald kunnen worden, moet de methode nog worden gevalideerd. Hierbij moet onder andere de precisie, lineariteit en Limit of quantification(LOQ) bepaald worden. Ook moet een methode vergelijking uitgevoerd worden om de opgezette methode te vergelijken met de resultaten van een bestaande methode. Pas wanneer de resultaten van de methode valide zijn, mag de methode voor het bepalen van vrije metenafrinen in plasma in de praktijk in gebruik genomen worden.
Literatuurlijst
1. R.R.H. Nap, J.R. Meinardi, G.van den Berg, R.P.F.Dullaart, J.de Vries en B.H.R. Wolffenbuttel.
Langdurige controle aangewezen na chirurgische behandeling wegens een feochromocytoom. Ned Tijdschr Geneeskd. 2006 13 mei;150(19)
2. J.M. Pekelharing, J.H.M. Souverijn, H. Hooijkaas, J.M.H.M. Punt, L.C. Smeets. Handboek
medische laboratorium diagnostiek. 2009. Prelum, Houten. Blz 145-147
3. A. Kooy., R.K.J. Hoorn., Strategische diagnostiek van endocriene ziekten: een leidraad voor
de praktijk.(2004) Tweede druk. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten. Blz 57
4. Lenders JW, Pacak K, Walther MM, Linehan WM, Mannelli M, Friberg P, et al. Biochemical
diagnosis of pheochromocytoma:which test is best? JAMA 2002;287:1427–34.
5. Wilhelmina H.A. de Jong, Kendon S. Graham,2 Jan C. van der Molen, Thera P. Links, Michael R. Morris, H. Alec Ross, Elisabeth G.E. de Vries, and Ido P. Kema. Plasma Free
Metanephrine Measurement Using Automated Online Solid-Phase Extraction HPLC–Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry 53, No. 9, 2007
6. C.J.H. van de Velde, W.T.A. van der Graaf, J.H.J.M. van Krieken, C.A.M. Marijnen, J.B. Vermorken. Oncologie. (2011) achtste druk. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten. Blz 532
7. D.G. Gardner, D. Shoback. Greenspan's Basic & Clinical Endocrinology. (2007) 8e Editie.
McGraw-Hill
8. Morgane Suys. Prof. dr. Apr. S. De Saeger. Ontwikkeling van een analysemethode voor de
bepaling van cortisol in haar als biomarker voor chronische stress bij kinderen. Universiteit
Gent, Faculteit farmaceutische wetenschappen. Vakgroep Bioanalyse, laboratorium voor Bromatologie. Academiejaar 2010-2011.
9. University of Bristol. Mass Spectrometry
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/cid-fragmentation.html Geraadpleegd op 26-11-2012
10. Susan A. Lagerstedt, Dennis J. O’Kane, and Ravinder J. Singh. Measurement of Plasma
Free Metanephrine and Normetanephrine by Liquid Chromatography-Tandem Mass
Spectrometry for Diagnosis of Pheochromocytoma. Clinical Chemistry 50:3. 603-611 (2004)
11. Heather A Brown, Lisa J Calton, Donald P Cooper. Automated solid phase extraction of
plasma metanephrine, normetanephrine and 3-methoxytyramine for analysis by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Waters Corporation, Atlas Park, Manchester
UK. 2011
12. Gabler J, Yuan C, Woroniecki W, Liu H, Wang S (2012). A Sensitive and Interference-Free
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for Measuring Metanephrines in Plasma. J Chromatograph Separat Techniq S2:001.
13. Baars, B., van den Berg, J., Jansen, H., Schoenmakers, P., Tijssen, R., Vonk, N.,
Chromatografie in de praktijk, vloeistofchromatografie. Aanvulling 11, 2001. ten Hagen &
Stam b.v., Den Haag.
14. Luce, C. Marney, Thomas J. Laha, Geoffrey S. Baird, Petrie M. Rainey and Andrew N. Hoofnagle. Isopropanol Protein Precipitation for the Analysis of Plasma Free Metanephrines
by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry 54:10. 1729-1732
(2008)
15.Gert Hendriks. Presentatie: Aspecten van methode ontwikkeling LC-MS/MS bepalingen. PRA. Transforming clinical trials
16. Waters corporation. Powerpoint presentatie: SPE Troubleshooting and Optimization Applied to the Oasis® 2x4 Method. 2007
17. Waters. Oasis Sample Extraction Products
http://www.waters.com/waters/en_NL/Oasis-Sample-Extraction-Products/ nav.htm?cid= 513209&locale=en_NL Geraadpleegd op 06-03-2013