Vergelijking retro- en lentivirale transductie

6.4.1 Retrovirale transductie vertoont een sterkere CD4 en MHC-I downregulatie

Omdat lentivirale constructen aangemaakt worden voor toekomstig gebruik is het interessant om de lentivirale transductie te vergelijken met de retrovirale. Hiervoor werden Jurkat CD4 CCR5 cellen getransduceerd met reeds bestaande retro- en lentivirale constructen. De retrovirale constructen LZRS-IRES-EGFP (pLZRS-LIE) en LZRS-Na-7 WT-LZRS-IRES-EGFP (pLZRS-Na-7), en de lentivirale constructen TRIP-EF1α-Na-7 WT-IRES-NGFR-WPRE (pTRIP-Na-7) en TRIP-EF1α-IRES-NGFR-WPRE (pTRIP-LINK) werden hiervoor gebruikt. Deze constructen bestonden reeds en werden niet zelf aangemaakt. De getransduceerde cellen werden vervolgens gekleurd met CD4-PE en HLA-A,B,C-PE antilichamen waarna de cellen geanalyseerd werden met behulp van flowcytometrie.

Figuur 17: Vergelijking retro- en lentivirale transductie. De retroviraal (pLZRS-LIE en pLZRS-Na-7) en lentiviraal (pTRIP-LINK en pTRIP-Na-7) getransduceerde cellen werden vergeleken op basis van hun CD4 en MHC-I downregulatie.

De LZRS vectoren bevatten eGFP als merker en de TRIP vectoren bevatten NGFR. De retrovirale constructen tonen een zeer sterke downregulatie van CD4 terwijl dit bij de lentivirale constructen moeilijk is aan te tonen. De MHC-I downregulatie door retrovirale constructen is minder sterk dan de CD4 downregulatie maar veel meer uitgesproken dan bij de lentivirale constructen. pLZRS-LIE toont geen downregulatie van CD4 en MHC-I zoals verwacht, aangezien het fungeert als een controle construct en geen Nef tot expressie brengt. Het lentivirale construct pTRIP-Na-7 vertoont weinig verschil met het pTRIP-LINK construct dat geen Nef tot expressie brengt.

Uit deze resultaten kan men vaststellen dat de retroviraal getransduceerde cellen een duidelijke downregulatie van CD4 en MHC-I vertonen waarbij de downregulatie van CD4 sterker is dan deze van MHC-I. De lentiviraal getransduceerde cellen vertonen een zeer hoge transductie-efficiëntie waardoor het moeilijker is besluiten te trekken omtrent de downregulatie van de oppervlaktereceptoren.

Door het horizontale verloop kunnen we echter vaststellen dat er een zwakkere downregulatie optreedt

42 dan bij de retroviraal getransduceerde cellen. Bovendien vertoont pTRIP Na-7 een sterke gelijkenis met de pTRIP-LINK analyses waardoor men zich de vraag kan stellen of Nef wel tot expressie komt.

Deze resultaten zijn mogelijk te verklaren door pseudotransductie waardoor de waargenomen NGFR expressie niet afkomstig is van geïntegreerde vectoren maar van passief overgedragen NGFR eiwit.

6.4.2 Bepaling Nef expressie

De retro- en lentiviraal getransduceerde cellen vertoonden een sterk verschil in CD4 en MHC-I downregulatie. Omdat het pTRIP-Na-7 construct weinig verschil met het pTRIP-LINK construct aantoonde, werd de expressie van Nef nagegaan via Western Blotting. De Nef expressie werd hiervoor vergeleken met actine (42 kDa), een controle eiwit dat continue tot expressie wordt gebracht in de cel.

Actine werd aangekleurd met een muis anti-actine monoklonaal antilichaam en gevisualiseerd door middel van een geit anti-muis IgG antilichaam (1/10000 verdunning) gemerkt met HRP. Het Nef eiwit werd aangekleurd met een anti-Nef monoklonaal muis antilichaam EH-1 en gevisualiseerd met zowel een 1/1000 en een 1/500 verdunning van het ECL anti-muis IgG antilichaam gemerkt met HRP. Via een chemiluminescentie reactie na additie van luminol en peroxidase konden de eiwitten gevisualiseerd worden op een fotografische film.

6.4.2.1 Actine kleuring

De actine kleuring werd blootgesteld aan de fotografische film gedurende 30 sec, 1 min en 5 min. De actine expressie was zichtbaar vanaf 30 sec (niet weergegeven) tussen de 38 en 49 kilodalton (kDa) banden. In onderstaande figuur wordt de actine expressie na 5 min weergegeven. De actine expressie is vergelijkbaar bij alle constructen al ziet men een lichter bandje bij pLZRS-LIE.(FIGUUR 18)

Figuur 18: Western Blot Actine kleuring. Voor de detectie van het actine eiwit werd gebruik gemaakt van een muis anti-actine monoklonaal antilichaam dat op zijn beurt gebonden werd met een HRP gelinkt geit anti-muis IgG antilichaam (1/10000 verdunning). De visualisatie gebeurde met een ECL Western Blotting Analysis system met 5 min blootstellingstijd aan de fotografische film. Het actine eiwit is zichtbaar ter hoogte van de 42 kDa regio, weergegeven door zwarte expressie bandjes. De moleculaire gewichtsmerker wordt weergegeven aan de rechterzijde van de figuur in kDa.

43 6.4.2.2 Nef kleuring

Nef expressie werd reeds waargenomen na 5 min blootstellingstijd (niet weergegeven) net onder de 28 kDa band waardoor het gedecteerde Nef vermoedelijk een moleculaire massa van 27 kDa bevat.

Zowel het retrovirale pLZRS-Na-7 construct en het pTRIP-Na-7 construct vertonen Nef expressie, terwijl de constructen pTRIP-LINK en pLZRS-LIE zoals verwacht geen Nef expressie vertonen.

Figuur 19: Western Blot Nef kleuring. Het Nef eiwit werd gedetecteerd met het anti-Nef monoklonaal muis antilichaam EH-1 (AIDS Research and Reference Reagent Program) (1/1000 verdund) dat op zijn beurt gebonden werd door het ECL anti-muis IgG antilichaam. Na 30 min blootstelling aan de fotografische film werd bovenstaand beeld bekomen met behulp van een ECL Western Blotting Analysis system. De banden ter hoogte van 42 kDa zijn de voorgaande actine kleuringen die nog zichtbaar zijn. Ter hoogte van de 28 kDa band is Nef aangekleurd bij de constructen pTRIP-Na-7 en pLZRS-Na-7. De constructen pLZRS-LIE en pTRIP-LINK zijn controlevirussen die geen Nef tot expressie brengen. Nef kleuring met het anti-Nef monoklonaal muis antilichaam EH-1 (1/500 verdund) gaf hetzelfde resultaat. De moleculaire gewichtsmerker wordt weergegeven aan de rechterzijde van de figuur in kDa.

Men kan hieruit besluiten dat de lentiviraal getransduceerde cellen met pTRIP-Na-7 een duidelijke Nef expressie vertonen. De verschillen in CD4 en MHC-I downregulatie kunnen mogelijks verklaard worden door een lagere Nef expressie bij lentiviraal getransduceerde cellen.

6.5 Transfectie

Door middel van controlerestricties en PCR sequencing werd aangetoond dat de aangemaakte plasmiden de gewenste Nef mutanten bevatten. In een volgende stap werden van deze mutanten lentivirale constructen aangemaakt. Om een niet-infectieus lentiviraal construct samen te stellen, zijn de structurele eiwitten Env, Gag en Pol nodig. Verbeterde nucleaire exit en transcriptie werd bekomen via additie van Rev en Tat (zie Inleiding). Het packaging construct pMDG-L zorgt voor de expressie van Env en het p8.91 construct expresseert Gag, Pol, Rev en Tat.(59) Deze vectoren werden samen met de aangemaakte TRIP vectoren door middel van een Calcium Phosphate transfectie in 293 TN cellen gebracht.

Doordat pTRIP eGFP tot expressie brengt kan de aanwezigheid van deze vector in de 293TN cellen aangetoond worden. Na 48 uur werden de transfecties in beeld gebracht met behulp van

44 fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie. Met eerstgenoemde kunnen de transfectie-efficiënties geschat worden (FIGUUR 20). De exacte transfectie-efficiënties werden berekend met flowcytometrie (FIGUUR 23). De transfectie-efficiënties waren in het algemeen laag waarbij de Na-7 F191H mutant de hoogste transfectie-efficiëntie (41,5%) behaalde en de SF2 F195A mutant de laagste (19,3%). Deze resultaten leveren het bewijs van een geslaagde transfectie.

Figuur 20: Visualisatie transfecties met fluorescentiemicroscopie. Deze afbeelding werd 48 uur na een Calcium Phosphate transfectie van 293TN cellen genomen met een fluorescentiemicroscoop. (groen) De cellen die getransfecteerd werden expresseren eGFP dat gevisualiseerd wordt met de fluorescentiemicroscoop. EGFP wordt geëxiteerd door een 488 nm laser en emiteert licht met een emissie maximum van 509 nm waardoor er een groene kleur ontstaat. (zwart) Cellen die niet getransfecteerd zijn bevatten geen eGFP waardoor deze niet aangetoond kunnen worden met de fluorescentiemicroscoop.

Op het zicht kan men ook een schatting maken van de transfectie-efficiënties waarbij F191H waarschijnlijk een hoge transfectie-efficiëntie heeft en F191R en F195A vermoedelijk een lage. Alle Nef mutanten werden tot expressie gebracht van de TRIP-EF1α-Nef-IRES-NGFR-WPRE vector.

45

Figuur 21: Weergave transfectie-efficiënties met behulp van flowcytometrie. De getransfecteerde cellen werden door middel van flowcytometrie geanalyseerd waarbij de eGFP expressie van de cellen nagegaan werd. EGFP⁺ cellen zijn getransfecteerde cellen aangezien niet-getransfecteerde cellen geen eGFP tot expressie brengen. Elk puntje stelt een cel voor en de transfectie-efficiënties werden met volgende formule berekend: (aantal eGFP⁺ cellen)/(totaal aantal geanalyseerde cellen).