Nef/Pak2 interactie heeft een invloed op CXCR4 downregulatie

Omdat men vermoedt dat de Nef/Pak2 interactie een rol speelt bij CXCR4 downregulatie werden Jurkat CD4 CCR5 cellen retroviraal getransduceerd met Nef mutanten die een verschillende interactiecapaciteit met Pak2 bezitten. De Nef mutanten werden gedragen door de retrovirale LZRS-Nef-IRES-EGFP vector. De getransduceerde Jurkat cellen werden onderzocht naar hun CXCR4 expressie.

Figuur 13: CXCR4-downregulatie na retrovirale transductie met Na-7 en SF2 Nef mutanten. In bovenstaande plots wordt de CXCR4 expressie ten opzichte van eGFP weergegeven. Elk puntje stelt een cel voor en de cellen die eGFP positief zijn brengen Nef tot expressie. De grafiek onderaan geeft de relatieve CXCR4 expressie van de verschillende Nef mutanten weer. Deze werd berekend met volgende formule: (MFI_CXCR4eGFP⁺ - MFI_isotypeeGFP⁺)/(MFI_CXCR4eGFP^- - MFI_isotypeeGFP -)*100. De eGFP^-controle is een niet-getransduceerde Jurkat CD4 CCR5 cel; eGFP stelt de CXCR4 expressie van LZRS-IRES-EGFP (LIE) voor.

Uit bovenstaande figuur kan men vaststellen dat zowel de Na-7 als SF2 WT virussen een sterkere CXCR4 downregulatie vertonen dan de Nef mutanten die een lagere interactiecapaciteit met Pak2 bezitten. Na-7 F191R Nef en SF2 F195A Nef kunnen niet meer interageren met Pak2 en vertonen praktisch geen CXCR4 downregulatie. Na-7 F191H Nef en SF2 F195I Nef hebben een intermediaire interactiecapaciteit met Pak2 en vertonen een zwakkere CXCR4 downregulatie dan de WT Nefs maar

38 een sterkere downregulatie dan de Nef mutanten F191R en F191A. Het vermoeden dat Pak2 een rol speelt bij CXCR4 downregulatie wordt met deze resultaten versterkt.

6.2 Controlerestricties

Omdat het gebruik van lentivirale vectoren voordelen biedt bij onderzoek met laag actieve cellen werden van de gebruikte Nef mutanten lentivirale constructen aangemaakt. De eerste stap naar dit doel omvatte de restrictie van Nef mutanten uit retrovirale LZRS vectoren waarna deze geligeerd werden in een TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector. Deze plasmiden werden vervolgens gecontroleerd met enzymen. Aan de hand van het restrictiepatroon, bekomen met een of meerdere restrictie-enzymen, kon men de aanwezigheid van Nef al dan niet bevestigen. Van elke controlerestrictie wordt een deel van de resultaten weergegeven. Elke figuur is representatief voor de overige, niet weergegeven resultaten.

6.2.1 Controlerestrictie ligaties met BamHI, XhoI en NcoI

Uit onderstaande controlerestricties conludeert men dat ofwel de restricties ofwel de ligaties van de pTRIP-SF2 F195A clone 4 en pTRIP-SF2 F195I clone 1 mislukt zijn. Dit wordt op de figuur aangetoond met zwarte rechthoeken. Deze bevinding geldt ook voor de constructen Na-7 F191R clone 1, Na-7 F191R clone 2, SF2 F195A clone 2 en SF2 F195A clone 3 die hier niet weergegeven worden.

De restrictie met BamHI en XhoI toont één fragment van ongeveer 8000 bp en één fragment van ongeveer 500 bp (moeilijk zichtbaar op de figuur). Normaliter zou er een band van 2004 bp, overeenkomend met de grootte van het Nef-IRES-eGFP aanwezig moeten zijn. Dit kan mogelijks verklaard worden door de aanwezigheid van interne knipsites in de Nef mutanten of de TRIP vector (FIGUUR 14). De WT Trip vector wordt echter correct geknipt met BamHI en XhoI waardoor er vermoedelijk interne knipsites aanwezig zijn in de Nef mutanten (zie FIGUUR 15).

Ten slotte toont de restrictie met NcoI twee fragmenten van ongeveer 1200 bp en één fragment van ongeveer 4000 bp. Mogelijk bevindt er zich een vierde fragment ter hoogte van de 4000 bp regio die door superpositie niet waargenomen kan worden. De totale lengte van de aangemaakte pTRIP vectoren is namelijk 10112 bp. Volgens Vector NTI moeten er 2 fragmenten van 4209 en 6668 bp uitvallen. De verklaring voor deze resultaten is mogelijks de aanwezigheid van een extra knipplaats in ofwel de TRIP vector ofwel het Nef-IRES-eGFP insert (FIGUUR 14). Dit vermoeden wordt gesterkt door het feit dat de restrictie van de WT TRIP vector met NcoI een onverwacht patroon vertoont (zie FIGUUR 15). Het is mogelijk dat Vector NTI Advance 10 een niet-accurate sequentiemap bevat.

Recent werd namelijk aangetoond dat de TRIP vector een extra 973 bp sequentie na de 3’LTR bevat.

Dit heeft als gevolg dat de TRIP vector een kleine 1000 bp meer bevat dan de geanalyseerde vector waardoor er mogelijks restrictiesites gemist zijn. Deze vaststelling kan de onverwachte restrictiepatronen eventueel verklaren.

39

Figuur 14: Controlerestricties ligaties met BamHI, XhoI en NcoI. De restricties van de (FA) pTRIP SF2 F195A en (FI) pTRIP SF2 F195I mutanten worden weergegeven. De cijfers naast de restricties wijzen op de gebruikte klonen. (a) Als controle werd een ongeknipte vector gebruikt. De ligaties werden geknipt met de restrictie-enzymen (b) NcoI, en (c) BamHI en XhoI. Verder werd er een (1) 100 bp ladder en een (2) 1 Kb ladder gebruikt waarvan de basenpaarlengtes aan de rechterzijde van de figuur weergegeven worden (in basenparen). De zwarte rechthoeken wijzen op mislukte restricties.

6.2.2 Controlerestrictie WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI

Om mogelijke interne knipsites in de WT TRIP vector na te gaan werd de vector geknipt met dezelfde restrictie-enzymen als in punt 6.1.1.

Figuur 15: Controlerestricties WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI. (a) Er werd een ongeknipte WT TRIP vector als controle gebruikt. Naast de restrictie met (b) NcoI en de restrictie met (c) BamHI en XhoI werden twee ladders toegevoegd, namelijk een (1) 1 Kb ladder en een (2) 100 bp ladder. De blauwe cirkel toont een fragment met een basenpaar lengte van ongeveer 8000 bp en de groene cirkel toont een fragment van ongeveer 750 bp.

Men kan besluiten dat de WT TRIP vector correct geknipt wordt door BamHI en XhoI waarbij er twee fragmenten uitvallen van ongeveer 8000 bp en 750 bp. Dit komt overeen met de berekeningen in Vector NTI waar de fragmenten 8108 bp en 758 bp bedragen.

40 De restrictie met NcoI toont 3 uitvallende fragmenten van ongeveer 1200 bp, 1500 bp en 3000 bp.

Analyse met Vector NTI toonde echter 2 banden van 4657 bp en 4209 bp. Dit resultaat is mogelijks te verklaren door de aanwezigheid van een of twee extra interne knipsites in de WT TRIP vector.