FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
Aanmaak en optimalisatie van lentivirale constructen voor expressie van HIV Nef mutanten in cellijnen en dendritische cellen
Matthias UREEL
Promotor: Prof. Dr. Bruno Verhasselt
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
Aanmaak en optimalisatie van lentivirale constructen voor expressie van HIV Nef mutanten in cellijnen en dendritische cellen
Matthias UREEL
Promotor: Prof. Dr. Bruno Verhasselt
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
Deze pagina is niet beschikbaar omdat ze persoonsgegevens bevat.
Universiteitsbibliotheek Gent, 2021.
This page is not available because it contains personal information.
Ghent University, Library, 2021.
Dankwoord
Graag zou ik mijn promotor Prof. Dr. Bruno Verhasselt willen bedanken voor de inhoudelijke ondersteuning van dit werk. Ook ben ik hem dankbaar voor het vertrouwen dat hij in mij gesteld heeft door mij dit project toe te wijzen. De ervaring die ik heb opgedaan is een meerwaarde voor mijn opleiding.
Een speciaal dankwoord gaat uit naar mijn begeleider Pieter Meuwissen voor zijn geduld en zijn kritische kijk op mijn vorderingen. Onze samenwerking heeft me zowel persoonlijk als intellectueel veel bijgebracht.
Verder wens ik de mensen die gedurende twee jaar voor mij klaarstonden en de goede afloop van dit werk mede mogelijk maakten, te bedanken voor hun inspanningen. Ik dank iedereen van de vakgroep klinische biologie, microbiologie en immunologie voor hun praktisch advies en uitleg bij de verscheidene uitgevoerde experimenten.
Ten slotte wens ik mijn dank te uiten ten opzichte van mijn vriendin Margaux die altijd voor mij klaarstond. Haar hulp bij de grafische vormgeving betekende een belangrijke bijdrage aan dit project.
Ook mijn vrienden en familie, bij wie ik steeds een luisterend oor vond, wens ik te bedanken.
Inhoudstafel
1 ABSTRACT ... 1
2 AFKORTINGEN ... 2
3 FIGUREN... 5
4 INLEIDING ... 6
4.1 HIV ... 6
4.1.1 Ontstaan ... 6
4.1.2 Structuur ... 7
4.1.3 Replicatie ... 8
4.1.4 Virale proteïnen ... 9
4.1.4.1 Structurele eiwitten ... 9
4.1.4.2 Regulatoire eiwitten ... 10
4.1.4.3 Accessoire eiwitten ... 10
4.2 Nef ... 11
4.2.1 Algemeen ... 11
4.2.2 Downregulatie CD4, MHC-I en CXCR4 ... 13
4.2.2.1 CD4-downregulatie ... 13
4.2.2.2 CXCR4/CCR5-downregulatie ... 14
4.2.2.3 MHC-I-downregulatie ... 15
4.2.3 Verstoren van signaaltransductie cascades met nadruk op Pak2 interactie ... 15
4.3 Retro- en lentivirale vectoren ... 17
4.3.1 Retrovirale vectoren ... 17
4.3.2 Lentivirale vectoren ... 18
4.3.3 Vectoren in onderzoeksproject ... 19
4.4 Onderzoeksdoel ... 20
5 MATERIALEN EN METHODEN ... 21
5.1 Opgroeien Nef mutanten uit glycerolstock ... 21
5.2 Plasmide DNA purificatie ... 21
5.3 Restrictie TRIP vector en Nef mutanten ... 22
5.3.1 Restrictie Nef mutanten ... 22
5.3.2 Restrictie TRIP vector ... 22
5.4 Gelelektroforese ... 23
5.5 DNA purificatie ... 23
5.6 Ligatie Nef mutanten in TRIP vector ... 24
5.7 Transformatie in DH5α-competente cellen ... 24
5.8 Controle van de ligaties ... 25
5.8.1 Controlerestricties... 25
5.8.1.1 Restricties van de ligaties met BamHI, XhoI en NcoI ... 25
5.8.1.2 Restricties van de WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI ... 25
5.8.2 PCR Sequencing ... 26
5.8.2.1 Sequencing ... 26
5.8.2.2 Opzuiveren PCR producten ... 27
5.9 Celcultuur... 27
5.9.1 Cellen ontdooien ... 27
5.9.2 Celcultuur ... 28
5.9.3 Cellen tellen ... 28
5.10 Transductie ... 28
5.10.1 Retrovirale transductie ... 28
5.10.2 Lentivirale transductie ... 28
5.10.3 Flowcytometrie ... 28
5.11 Western Blotting ... 30
5.11.1 Aanmaak lysaat ... 30
5.11.2 Bepalen proteïne concentratie ... 31
5.11.2.1 Verdunningen en verdunningsreeks ... 31
5.11.2.2 Berekening concentratie aan de hand van lichtabsorptie ... 31
5.11.2.3 Concentraties herleiden ... 32
5.11.3 Proteïne elektroforese ... 33
5.11.4 Western Blot ... 33
5.11.4.1 Kleuring 1: Actine ... 34
5.11.4.2 Kleuring 2: Nef ... 34
5.12 Transfectie ... 35
5.12.1 Voorbereiding ... 35
5.12.2 Transfectie ... 35
5.13 Lentivirale transductie SupT1 cellen ... 36
6 RESULTATEN ... 37
6.1 Nef/Pak2 interactie heeft een invloed op CXCR4 downregulatie ... 37
6.2 Controlerestricties ... 38
6.2.1 Controlerestrictie ligaties met BamHI, XhoI en NcoI ... 38
6.2.2 Controlerestrictie WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI ... 39
6.3 PCR Sequencing bevestigt de aanwezigheid van Nef mutaties ... 40
6.4 Vergelijking retro- en lentivirale transductie ... 41
6.4.1 Retrovirale transductie vertoont een sterkere CD4 en MHC-I downregulatie ... 41
6.4.2 Bepaling Nef expressie ... 42
6.4.2.1 Actine kleuring ... 42
6.4.2.2 Nef kleuring ... 43
6.5 Transfectie ... 43
6.6 Nef/Pak2 interactie speelt een rol bij CXCR4 downregulatie ... 45
7 DISCUSSIE ... 50
8 REFERENTIES ... 54
1
1 Abstract
Nef is een accessoir eiwit van het humaan immuundeficiëntie virus (HIV) dat een belangrijke rol speelt bij het in stand houden van hoge virale titers en de ontwikkeling naar AIDS. Nef heeft een groot aantal functies die onder andere bijdragen tot immuunevasie en een verhoogde HIV infectiviteit.
Gezien het grote belang van dit eiwit voor in vivo infectie van HIV en progressie naar AIDS kan onderzoek naar dit eiwit meer duidelijkheid scheppen omtrent de pathogenese van AIDS, en in de toekomst eventueel dienen als doelwit voor antivirale middelen.
In dit project werd de interactie van Nef met het p21-activated kinase 2 (Pak2) onderzocht. Door het gebruik van Na-7 F191H, Na-7 F191R, Na-7 WT, SF2 F195A, SF2 F195I en SF2 WT Nef mutanten die specifiek de Nef/Pak2 interactie verstoren, kon de invloed van deze interactie op CD4, MHC-I en CXCR4 downregulatie nagegaan worden. Omdat voorgaande studies het vermoeden wekten dat de Nef/Pak2 interactie betrokken is bij CXCR4 downregulatie werd dit onderzocht via retrovirale transductie van CD4 CCR5 Jurkat cellen. Hierbij werd een patroon waargenomen waarbij de CXCR4 expressie afnam naarmate de interactiecapaciteit met Pak2 versterkte. Dit impliceert een rol van Pak2 bij CXCR4 downregulatie ten gevolge van Nef.
Verder werden van deze Nef mutanten lentivirale constructen aangemaakt zodanig dat toekomstig onderzoek op weinig of niet-delende cellen mogelijk wordt. Deze lentivirale constructen werden getest op CD4+ CD8+ SupT1 cellen waarbij geconcludeerd werd dat de Nef/Pak2 interactie geen rol speelt bij CD4 en MHC-I downregulatie maar wel bij CXCR4 downregulatie. Er werd een gelijkaardig patroon waargenomen als bij de reeds vermelde retrovirale transducties maar omdat de verschillen in CXCR4 downregulatie tussen de verschillende Nef mutanten zeer klein waren kon geen besluit getrokken worden uit deze waarneming. Verder onderzoek zal deze bevindingen moeten bevestigen of verwerpen.
Ten slotte werden retro- en lentivirale transducties met elkaar vergeleken. Hiervoor werden Jurkat cellen retro- en lentiviraal getransduceerd met Na-7 WT Nef en een controlevirus dat geen Nef tot expressie bracht. Uit dit experiment kon worden geconcludeerd dat de retroviraal getransduceerde cellen met Na-7 WT Nef een zeer sterke downregulatie van CD4 en MHC-I vertoonden ten opzichte van de lentiviraal getransduceerde cellen. Via Western Blotting werd echter aangetoond dat Nef met beide gen transfer methodes tot expressie kwam. Het verschil in downregulatie kan mogelijk te wijten zijn aan een lagere Nef expressie bij de lentivirale constructen.
2
2 Afkortingen
A Ampère
AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
Amp Ampiciline
APC Allophycocyanine
AgPC Antigen Presenterende Cel
APOBEC3G Apolipoproteïne B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G
Bidi Tweemaal gedestilleerd water
Bp Basenpaar
BSA Bovine Serum Albumin
CCR5 Chemokine (C-C motif) Receptor 5
CD4 Cluster of Differentiation 4
CMV Cytomegalovirus
cPPT Central Polypurine Tract
CTL CD8+ Cytotoxische T-lymfocyten
CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) Receptor 4
ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate
DNA Desoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxynucleotide Triphosphate
DOTAP Dioleoyl-Trimethylammonium-Propane
ECL Enhanced Chemiluminescence
eGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
Env Enveloppe
Etbr Ethidiumbromide
EtOH Ethanol
FL Fluorescent Light
Gag Group specific Antigen
Gp Glycoproteïne
H2O Opgezuiverd water
HCl Zoutzuur
HEPES Hydroxyethyl-Piperazineethanesulfonic Acid
HIV Human Immunodeficiency Virus
HIV-1 Human Immunodeficiency Virus Type 1
HIV-2 Human Immunodeficiency Virus Type 2
HLA Human Leukocyte Antigen
HRP Horseradish Peroxidase
3
IRES Intern Ribosomal Entry Site
Kb Kilobasen
kDa Kilodalton
LTR Long Terminal Repeat
M Molair
MHC-I Major Histocompatibility Complex, class I
MQ MilliQ water
mRNA Messenger Ribonucleic Acid
Nef Negative Factor
ORF Open Reading Frame
Pak2 p21 Protein (Cdc42/Rac)-Activated Kinase 2
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PE Phycoërythrine
Pol Polymerase
PVDF Polyvinylidene Difluoride
Rev Regulator of expression of viral proteins
RNA Ribonucleic Acid
Rpm Rounds per minute
RRE Rev Responsive Element
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SH3 Src Homology 3 domain
SIN Self-inactivating
SIV Simian Immunodeficiency Virus
SupT1 Stanford University Pediatric T-Celline
SV40 Simian Virus 40
Tat Transcriptional activator
TCR T-cel Receptor
Th-cellen Thelper cellen
V Volt
Vav1 Vav1 guanine exchange factor
Vif Virion infectivity factor
Vpr Viral Protein R
Vpu Viral Protein U
Vpx Viral Protein X
VSV-G Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein
4
WT Wild Type
XGPRT Xanthine-Guanine Fosforibosyl Transferase
5
3 Figuren
FIGUUR 1 Schematische weergave van een HIV-1 virion FIGUUR 2 Overzicht virale replicatie
FIGUUR 3 Overzicht HIV-1 genoom gebaseerd op de HXB2 streng
FIGUUR 4 Nef functies die bijdragen tot een verhoogde HIV infectiviteit en replicatie FIGUUR 5 Omvorming retro- en lentivirale virussen tot vectoren
FIGUUR 6 Productie van lentivirale vectoren
FIGUUR 7 Voorstelling van de SIN lentivirale WT TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector FIGUUR 8 Illustratie LZRS-Nef-IRES-EGFP vector
FIGUUR 9 Illustratie TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector FIGUUR 10 Primer bindingsplaatsen
FIGUUR 11 FACScalibur Flow Cytometer (BD) FIGUUR 12 Grafiek verdunningsreeks
FIGUUR 13 CXCR4 downregulatie na retrovirale transductie met Na-7 en SF2 Nef mutanten FIGUUR 14 Controlerestricties ligaties met BamHI, XhoI en NcoI
FIGUUR 15 Controlerestricties WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI FIGUUR 16 PCR Sequencing Na-7 en SF2 Nef mutanten
FIGUUR 17 Vergelijking retro- en lentivirale transductie FIGUUR 18 Western Blot Actine kleuring
FIGUUR 19 Western Blot Nef kleuring
FIGUUR 20 Visualisatie transfecties met fluorescentiemicroscopie
FIGUUR 21 Weergave transfectie-efficiënties met behulp van flowcytometrie
FIGUUR 22 CD4 downregulatie na lentivirale transductie met Na-7 en SF2 Nef mutanten FIGUUR 23 MHC-I downregulatie na lentivirale transductie met Na-7 en SF2 Nef mutanten FIGUUR 24 CXCR4 downregulatie na lentivirale transductie met Na-7 en SF2 Nef mutanten
6
4 Inleiding
4.1 HIV
Het ‘Human Immunodeficiency Virus’ (HIV) veroorzaakt een chronische infectie van de immuuncellen in het menselijk lichaam. HIV-1 (HIV Type 1) en HIV-2 (HIV Type 2) zijn lentivirussen (lenti = traag) die behoren tot de familie van de retrovirussen. Een belangrijke eigenschap van deze lentivirussen is de mogelijkheid tot het infecteren van laag tot niet-delende cellen.
HIV-1 is het prototype van de lentivirussen en komt voor in Europa, de Verenigde Staten van Amerika, Centraal-Afrika en de meeste andere regio’s in de wereld. HIV-2 komt niet wereldwijd voor en beperkt zich hoofdzakelijk tot West-Afrika.(1) Het virus infecteert CD4+ cellen die vervolgens door het immuunsysteem aangevallen worden. Hierdoor ontstaat er een geleidelijke daling van het aantal CD4+ cellen met als gevolg een hogere gevoeligheid voor opportunistische infectieziekten zoals Kaposi sarcoma, Pneumocystis carinii Pneumonie (PCP) en cytomegalie. Het zijn deze ziekten die verantwoordelijk zijn voor het variabel klinisch beeld van de HIV infectie. Eenmaal het aantal circulerende CD4+ T-cellen onder de 200 cellen per microliter (µl) bloed is afgenomen spreekt men van het ‘Acquired Immunodeficiency Syndrome’ (AIDS). De patiënt sterft niet door het HIV virus maar wel van de opportunistische infecties die ontstaan door het falen van het immuunsysteem.(2) 4.1.1 Ontstaan
Tot op vandaag zijn er twee genetisch verschillende types van HIV geïdentificeerd, namelijk HIV-1 en HIV-2. Beide virussen zijn ontstaan na zoönotische overdrachten van ‘Simian Immunodeficiency Viruses’ (SIV) van Afrikaanse niet-humane primaten.(1;3;4;5;6;7;8) Er zijn verschillende theorieën die de overdracht van SIV naar de mensen trachten te verklaren. Men vermoedt onder andere dat deze overdracht via hematogene weg tijdens de jacht op chimpansees is opgetreden, of door het versnijden van vlees afkomstig van wilde apen (‘bush meat’).(6) Momenteel zijn er alleen bij de chimpansees en de gorilla’s SIV’s aangetoond die gelijkaardig zijn aan HIV-1.(8) Bovendien ontwikkelen de meerderheid van deze geïnfecteerde primaten geen ernstige immuundeficiëntie en dus ook geen AIDS zoals dit wel het geval is bij HIV-1.(9)
Fylogenetisch onderzoek heeft aangetoond dat HIV-1 en HIV-2 ontstaan zijn uit verschillende SIV stammen die bovendien afkomstig zijn uit verschillende regio’s in Afrika. Dit kan een verklaring zijn voor enkele verschillen in HIV-1 en HIV-2 pathogenese en transmissie.(5) Zo wordt HIV-2, in tegenstelling tot HIV-1, minder makkelijk overgedragen van persoon naar persoon en zorgt het voor een tragere evolutie naar AIDS.(10)
HIV-2 is voor de Westerse wereld het minst belangrijke type aangezien het voornamelijk voorkomt in West-Afrika. Men heeft aangetoond dat HIV-2 afkomstig is van SIVsm, een simian virus gevonden bij de wilde apensoort Sooty Mangabey (Cerocebus Atys). De natuurlijke habitat van deze apen komt overigens overeen met het epicentrum van de HIV-2 epidemie in West-Afrika.(3;7;8)
7 HIV-1 wordt verder onderverdeeld in 3 grote groepen: groep M (Major), groep N (Non-M/non-O) en groep O (Outlier). HIV-1 groep M is de belangrijkste oorzaak van HIV infectie over de hele wereld en de belangrijkste oorzaak van AIDS in de Westerse wereld. Onderzoek van HIV-1 en gerelateerde SIV’s heeft aangetoond dat drie onafhankelijke transmissies verantwoordelijk zijn voor hun ontstaan.
De HIV-1 groepen M en N zijn afkomstig van de Pan troglodytes troglodytes chimpansees uit respectievelijk Zuid-Oost Kameroen en Zuid-Centraal Kameroen. Deze apen zijn dragers van het simian virus SIVcpzPtt.(8;9;11) HIV-1 groep O gelijkaardige virussen zijn gevonden in wilde Westerse gorilla’s (Gorilla Gorilla), dragers van SIVgor, al vermoedt men dat het oorspronkelijke virus afkomstig is van een nog niet geïdentificeerde SIVcpz.(8;11)
4.1.2 Structuur
Een HIV virion wordt omgeven door een sferische enveloppe van 100-120 nanometer (nm) diameter die bestaat uit een dubbele lipidenlaag waarin de glycoproteïnen gp120 en gp41 verankerd zijn. Deze lipidenlaag is afkomstig van een geïnfecteerde cel en ontstaat na het loskomen van nieuw gevormde virionen van de celmembraan, een proces dat ‘budding’ genoemd wordt. Net onder deze enveloppe ligt de matrix bestaande uit p17 (matrix, MA) eiwitten. Nog dieper in het virus bevindt zich het nucleocapside dat omgeven wordt door een icosahedraal gevormde capside die opgebouwd is uit p24 (capsid, CA) eiwitten. Dit capside bevat twee identieke enkelstrengige ‘ribonucleic acid’ (RNA) moleculen van ongeveer 9,2 kb die gestabiliseerd worden door p7 (nucleocapside, NC) eiwitten die het nucleocapside vormen (FIGUUR 1). Ten slotte bevat het virus het eiwit p6, de drie enzymen reverse transcriptase (RT), integrase (IN) en protease (PR), en de accessoire eiwitten Nef, Vif en Vpr.(4;12;13) Deze eiwitten worden verder uitvoerig besproken.
Figuur 1: Schematische weergave van een HIV-1 virion. De belangrijkste virale eiwitten, de dubbele lipidenlaag en het RNA genoom worden weergegeven. Meer informatie vindt men terug in de tekst. Figuur uit Freed EO. HIV-1 Replication.
Somat Cell Mol Genet 2001 Nov;26(1-6):13-33
8 4.1.3 Replicatie
Eenmaal het virus het menselijk lichaam is geïnvadeerd gaat het op zoek naar doelwitcellen om te infecteren zodat het zijn overleving kan garanderen. De doelwitcellen van HIV zijn CD4+ cellen zoals Th (Thelper) cellen, monocyten, macrofagen en dendritische cellen. HIV-1 treedt de cel binnen via een interactie tussen gp120 van de enveloppe en de CD4 receptor van de cel. Deze interactie verandert de conformatie van het gp120 met als gevolg een verhoogde affiniteit voor de co-receptoren CXCR4 en/of CCR5 van de cel. Het virale gp120 interageert vervolgens met een van deze co-receptoren waardoor gp41 een conformationele verandering ondergaat. Uiteindelijk fuseert het virus met de celmembraan en treedt het nucleocapside de cel binnen.(14)
Virussen die de cel infecteren met behulp van de CCR5 co-receptor (R5 virussen) spelen een rol in de mucosale en intraveneuze transmissie van HIV infectie waarbij voornamelijk macrofagen en dendritische cellen geïnfecteerd worden. De belangrijke rol van de CCR5 co-receptor bij HIV transmissie kan aangetoond worden aan de hand van een 32-bp deletie in het CCR5 gen. Patiënten homozygoot voor deze mutatie vertonen bijna een volledige bescherming tegen HIV-1 infectie.
Virussen die gebruik maken van de CXCR4 receptor (X4 virussen) hebben een tropisme voor T-cellen en worden voornamelijk teruggevonden wanneer patiënten progressie naar AIDS vertonen.(14)
Het capside dat zich na virale fusie in het cytoplasma van de cel bevindt, wordt vervolgens door virale en cellulaire factoren afgebroken waardoor zijn inhoud vrijkomt in de cel. De volgende stap omvat de integratie van het virale genoom in het genoom van de gastheercel zodat het voor zijn verdere overleving gebruik kan maken van de mechanismen van de cel. Hiervoor wordt het enkelstrengig RNA van het virus omgezet naar dubbelstrengig proviraal DNA door het reverse transcriptase enzym, een RNA afhankelijk DNA polymerase, dat typisch aanwezig is bij retrovirussen. Het dubbelstrengig DNA wordt daaropvolgend geïntegreerd in het humane genoom door het enzym integrase. Deze geïntegreerde vorm van het virus wordt ‘provirus’ genoemd. Omdat het genetisch materiaal van het virus zich nu in het humane genoom bevindt zal dit bij activatie van de cel afgelezen worden tot viraal messenger RNA (mRNA) dat na eventuele splicing en translatie omgezet wordt tot virale proteïnen.
Sommige eiwitten worden aangemaakt als deel van een precursor polyproteïne dat door virale en cellulaire proteasen in kleinere functionele stukken geknipt wordt. Het gevormde mRNA en de functionele eiwitten vormen een nieuw infectieus virion dat via budding de cel verlaat met als doel nieuwe CD4+ cellen te infecteren (FIGUUR 2).(15)
9
Figuur 2: Overzicht virale replicatie. Na fusie van het HIV virion met de celmembraan wordt het virale RNA omgezet tot proviraal DNA door reverse transcriptie (RT) en in het cellulair genoom geïntegreerd door het enzym integrase. Na transcriptie en translatie worden nieuwe HIV virionen gevormd ter hoogte van de celmembraan die na budding de cel terug verlaten. Figuur afkomstig van Northwest Association for Biomedical Research (NWABR).1
4.1.4 Virale proteïnen
De virale proteïnen van HIV-1 kunnen onderverdeeld worden in structurele en niet-structurele eiwitten.
De structurele proteïnen Gag, Pol en Env zijn essentieel voor de virale replicatie. De niet-structurele proteïnen worden verder onderverdeeld in regulatoire (Rev en Tat) en accessoire proteïnen (Vif, Vpu, Vpr, Nef en Vpx).
4.1.4.1 Structurele eiwitten
Gag (Group specific antigen) codeert voor een precursor polyproteïne dat door het viraal protease in verschillende functionele eiwitten geknipt wordt. De belangrijkste eiwitten die hierbij ontstaan zijn p17 (MA, matrix), p24 (CA, capside), p7 (NC, nucleocapside) en p6. Laatstgenoemde is een viraal proteïne dat een rol speelt bij de budding van nieuwgevormde virionen, vermoedelijk via interactie met cellulaire factoren.(15)
Pol (Polymerase) codeert voor de enzymen integrase, reverse transcriptase en protease die eveneens uit een precursor polyproteïne geknipt worden door het virale protease.(15)
1http://www.nwabr.org/education/hivrequest.html
10 Env (Enveloppe) codeert ook voor een precursor polyproteïne maar dit wordt in tegenstelling tot Gag en Pol geknipt door een cellulair protease. De gevormde eiwitten zijn het oppervlakte glycoproteïne gp120 en het transmembranaire glycoproteïne gp41.(15)
4.1.4.2 Regulatoire eiwitten
Na integratie van het virale genoom in het humane genoom wordt er door de cel een basale hoeveelheid Nef, Rev en Tat geproduceerd.(16) Eenmaal voldoende Tat (Transcriptional activator) aanwezig is, bindt en begeleidt het een cellulair cycline naar de ‘Transactivation Response Region’
(TAR) van de ‘Long Terminal Repeat’ (LTR) promoter met als gevolg een verhoogde transcriptie activiteit en een elongatie van het HIV genoom.(15;17) Het Rev (Regulator of expression of viral proteins) eiwit bindt de niet-gesplitste en gedeeltelijk gesplitste virale RNA strengen op hun ‘Rev responsive element’ (RRE) waardoor nucleaire exit van deze transcripts kan optreden.(16)
4.1.4.3 Accessoire eiwitten
De accessoire eiwitten ten slotte zijn belangrijk voor in vivo infectie door de inhibitie van retrovirale restrictiefactoren. Deze restrictiefactoren functioneren als bescherming tegen HIV-1 en werden ontwikkeld door het individu als antwoord op infecties veroorzaakt door retrovirale virussen. De inhibitie van deze factoren geeft HIV de mogelijkheid zich te repliceren en te verspreiden in het geïnfecteerde individu. Deze eiwitten worden accessoir genoemd omdat ze niet nodig zijn voor virale replicatie in vitro.(15;18)
Vif (Virion infectivity factor) fungeert als een adaptor proteïne dat het cellulair APOBEC3G (Apolipoproteïne B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G), een cytidine deaminase, naar de afbraakmechanismen van de cel begeleidt. APOBEC3G is één van de retrovirale restrictiefactoren aanwezig in de cel dat bij de afwezigheid van Vif geïncorporeerd wordt in HIV virions en zo nieuw geïnfecteerde cellen binnentreedt. Daar zorgt het voor cytidine (C) naar uridine (U) mutaties in nieuw gevormde DNA minus transcripten tijdens reverse transcriptie. Hierdoor ontstaan er bij de vorming van dubbelstrengig DNA guanine (G) naar adenosine (A) mutaties in de DNA plus streng, een fenomeen die men G naar A hypermutatie noemt. Op deze manier kunnen er stopcodons (zoals TAA) ontstaan welke fataal zijn voor de virale replicatie.(18)
Vpr (Viral protein R) wordt geïncorporeerd in mature virions en is verantwoordelijk voor de activatie van provirale transcriptie, celcyclus arrest in de G2 fase, apoptose inductie en verbeterde reverse transcriptie.(19) Verder heeft Vpr een invloed op de introductie van het pre-integratiecomplex in de celkern. Studies met macrofagen suggereren dat deze functie een belangrijke rol speelt bij laag tot niet-delende cellen.(20) Hoe Vpr hier precies in slaagt is nog niet ten volle begrepen. Bovendien vermoedt men dat Vpr een nog onbekende restrictiefactor antagoneert.(18)
11 In HIV-2 en enkele SIVs is er een vijfde accessoir proteïne, Vpx, aanwezig; waarschijnlijk een genduplicaat van Vpr. Bij deze virussen faciliteert Vpx een infectie van de macrofagen en zorgt Vpr voor het celcyclus arrest in de G2 fase. Verder onderzoek is echter noodzakelijk om de functies van Vpr ten volle te begrijpen.(18)
Vpu (Viral protein U) is een membraaneiwit dat geproduceerd wordt op het einde van de virale levenscyclus en twee functies uitvoert, namelijk CD4 downregulatie en inhibitie van ‘tetherin’ (BST-2, CD317 of HM1.24).(19) Tetherin is een transmembranair eiwit dat nieuwgevormde virionen aan de celmembraan vasthecht zodanig dat deze de cel niet kunnen verlaten.(21)
Figuur 3: Overzicht HIV-1 genoom gebaseerd op de HXB2 streng. Elke rechthoek stelt een open reading frame voor waarbij de start- en stopposities van het gen vermeld worden. De grijze rechthoeken geven de gesplitste exonen van Tat en Rev weer. Figuur afkomstig uit http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/MAP/landmark.html
4.2 Nef
4.2.1 Algemeen
Het Nef eiwit is een 27-35 kilodalton (kDa), niet-structureel viraal proteïne dat belangrijk is voor het onderhouden van hoge virale titers en een versnelde progressie naar immuundeficiëntie.
Het gen dat codeert voor Nef ligt ter hoogte van het 3’ einde van het HIV-1 genoom waar het eerst herkend werd als een ‘Open Reading Frame’ en 3’ ORF genoemd werd. Men veronderstelde een belangrijke functie voor 3’ORF aangezien het gen in de meeste stammen van HIV-1, HIV-2 en SIV werd teruggevonden. Verder onderzoek suggereerde dat dit eiwit in staat was de HIV-1 replicatie te onderdrukken door inhibitie van de LTR regio van HIV-1 waardoor het Negative Factor (Nef) werd genoemd. Deze resultaten werden echter kort nadien in vraag gesteld nadat men de onderdrukkende werking van Nef niet kon aantonen.(22;23) Niet lang daarna werd duidelijk dat Nef een positief effect had op de pathogenese van HIV en SIV in tegenstelling tot de oorspronkelijk vastgestelde onderdrukkende werking.(5)
De interesse in Nef groeide na de observatie dat apen geïnfecteerd met een SIV virus met een gestoord Nef eiwit lage virale titers en geen evolutie naar immuundeficiëntie vertoonden.(24) De impact van Nef op de progressie van HIV-1 infectie bij mensen werd later aangetoond met de ‘Sydney Blood Bank Cohort’ (SBBC) studie. In deze studie werden 8 personen, geïnfecteerd door een
12 gemeenschappelijke donor na een bloed transfusie, gedurende tientallen jaren opgevolgd. Een aantal van deze mensen werden benoemd als ‘Slow Progressors’ (SP) omdat zij vele jaren na seroconversie asymptomatisch bleven maar uiteindelijk toch een afname van de CD4+ T-cellen en een licht gestegen virale titer vertoonden. Dit in tegenstelling tot een aantal andere individuen, de zogenaamde ‘Long Term Non Progressors’ (LTNP), die na meer dan 20 jaar nog steeds een normaal aantal CD4+ T-cellen en virale titers bevatten.(25) Deze personen waren geïnfecteerd met een infectieus virus dat als enige afwijking deleties ter hoogte van de LTR en het Nef gebied van het HIV genoom bevatte.(26) Nef speelt een belangrijke rol voor HIV omdat het een versnelde ontwikkeling naar AIDS veroorzaakt en HIV in staat stelt zijn infectiviteit optimaal te benutten in vivo.(24)
Nef fungeert als een adaptor eiwit door te interageren met verscheidene cellulaire factoren die vervolgens aanleiding geven tot een veranderde signaaltransductie en genexpressie.(27) Het bezit hiervoor enkele geconserveerde functionele domeinen die tijdens de evolutie bewaard zijn gebleven en teruggevonden worden bij HIV-1, HIV-2 en SIV Nefs. De verschillende functies van Nef zijn zowel structureel als genetisch van elkaar te onderscheiden waardoor verscheidene mutanten ontwikkeld konden worden voor onderzoek naar dit eiwit.(28)
Nef voert een groot aantal functies uit waarvoor het gebruik maakt van de eiwitten van de gastheercel.
De functies zijn heel divers en omvatten onder meer modulatie van de trafficking van membraaneiwitten, modulatie van signaaltransductie cascades en het verhogen van de virale infectiviteit en replicatie. In onderstaande figuur worden enkele belangrijke functies weergegeven (FIGUUR 5). In deze thesis wordt de nadruk gelegd op de downregulatie van de oppervlaktereceptoren CD4, ‘major histocompatibility complex, class I’ (MHC-I) en ‘chemokine (C- X-C motif) receptor 4’ (CXCR4). Daarnaast wordt dieper ingegaan op de invloed van Nef op de p21- protein (Cdc42/Rac) activated kinase 2 (Pak2) signaaltransductie cascades. Deze functies worden in 4.2.2 en 4.2.3 meer uitgebreid besproken.
13
Figuur 4: Nef functies die bijdragen tot een verhoogde HIV infectiviteit en replicatie. (A) Nef verhoogt de virale replicatie onder meer (B) door een toegenomen T-cel activatie. (C) Verder downreguleert Nef verscheidene oppervlaktereceptoren waaronder CD4, MHC-I en CXCR4. (D) Daarnaast verstoort Nef het corticaal actine netwerk zodanig dat HIV de cel makkelijker kan binnentreden.(29) (E) Het zorgt ook voor een toegenomen cholesterol incorporatie door nieuwgevormde virionen naar veteilandjes te begeleiden. (F) Ten slotte wordt de virale verspreiding van de virionen bevordert door onder meer een opregulatie van de ‘dendritic cell specific ICAM-3 grabbing non-integrin’ (DC-SIGN) receptor op dendritische cellen (30), de secretie van chemokines (31) en de inductie van cel tot cel verbindingen (32). Deze functies zorgen voor een toename van de HIV infectiviteit en een efficiënte virale replicatie. Figuur uit Arien KK, Verhasselt B. HIV Nef: role in pathogenesis and viral fitness. Curr HIV Res 2008 May;6(3):200-8.
4.2.2 Downregulatie CD4, MHC-I en CXCR4
Eén van de belangrijkste en best beschreven functies van HIV Nef en zijn meest verwante SIV stammen is de downregulatie van oppervlaktereceptoren. Nef downreguleert een groot aantal oppervlaktereceptoren waaronder CD4, MHC-I, MHC-II, CD28, CD8αβ, CXCR4 en CCR5. De meeste SIV en HIV-2 Nefs downreguleren ook CD3, in tegenstelling tot HIV-1 Nef.(19) In dit werk wordt dieper ingegaan op de invloed van Nef op CD4, MHC-I en CXCR4 downregulatie.
4.2.2.1 CD4-downregulatie
De CD4 oppervlaktereceptor op Th-cellen, thymocyten en macrofagen speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling en activatie van T-cellen. Door binding van een niet-specifiek domein van een ‘major histocompatibility complex, class II’ (MHC-II) receptor dat zich op een antigen presenterende cel (AgPC) bevindt, verstevigt het de interactie van de T-cel receptor (TCR) met de AgPC, en speelt het een rol bij de T-cel activatie.(33) Het is bovendien de belangrijkste receptor voor de lentivirussen omdat ze via deze receptor cellen infecteren en binnentreden. Naast Nef zijn ook Vpu en Env in staat CD4 van de celmembraan weg te houden wat het belang van deze functie aantoont.(34) Nef downreguleert CD4 door gebruik te maken van het clathrine afhankelijk endocytose mechanisme dat CD4 endocyteert en vervolgens naar de afbraakmechanismen van de cel begeleidt. Nef interageert
14 hiervoor met het adaptor proteïne complex 2 (AP-2). Deze interactie speelt overigens ook een rol bij de downregulatie van CD8αβ.(35)
Downregulatie van deze receptor door HIV en SIV Nef heeft meerdere doelen: Het virus vermijdt een toxische superinfectie van de cel, het verhoogt de infectiviteit van nieuwgevormde virionen, het beschermt de virale replicatie door bepaalde signaaltransductie pathways te onderdrukken en het zorgt vermoedelijk voor een gunstige T-cel activatiestatus.(36) Bovenstaande bevindingen en hypothesen vereisen verder onderzoek aangezien men een aantal van deze zaken in twijfel trekt.
4.2.2.2 CXCR4/CCR5-downregulatie
Chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4) en chemokine (C-C motif) receptor 5 (CCR5) bestaan uit G-proteïne gekoppelde receptoren met 7 transmembranaire domeinen die na ligand binding signaaltransductie cascades opstarten met als gevolg een chemotactische respons. HIV maakt naast de primaire CD4 receptor gebruik van deze chemokinereceptoren om de cel binnen te treden. HIV stammen met een tropisme voor T-cellen gebruiken preferentieel CXCR4 om de cel binnen te treden (X4 stammen) en HIV stammen met een tropisme voor macrofagen gebruiken voornamelijk CCR5 (R5 stammen). HIV R5 stammen worden voornamelijk teruggevonden in asymptomatische individuen gedurende de initiële ziektestadia terwijl HIV X4 stammen hoofdzakelijk bij patiënten met vergevorderde ziektebeelden voorkomen. Sommige stammen zijn in staat beide receptoren te gebruiken.(37)
CXCR4 is aanwezig op een groot aantal cellen waaronder T-cellen, B-cellen, dendritische cellen en macrofagen. Het natuurlijk ligand van CXCR4 is de ‘stromal cell-derived-factor’ (SDF-1α) dat de chemotactische respons van deze cellen begeleidt en downregulatie van de CXCR4-receptor veroorzaakt. Deze downregulatie verloopt via het clathrine afhankelijk endocytose mechanisme van de cel.(37) Men heeft aangetoond dat de domeinen in CXCR4 belangrijk voor downregulatie door SDF- 1α niet gebruikt worden door HIV-1 Nef. Daarnaast heeft men vastgesteld dat Nef gebruik maakt van andere cellulaire pathways voor CXCR4 downregulatie dan CD4 downregulatie. Uit onderzoek blijkt dat het zure cluster motief (E66-E69), noodzakelijk voor PACS-1 interactie en het polyproline motief (P76xxP79, waarbij x een aminozuur naar keuze is), belangrijk voor binding met SH3 domeinen, een essentiële rol spelen bij CXCR4 downregulatie. Dit zijn dezelfde domeinen die Nef gebruikt voor MHC-I downregulatie waarbij het zure cluster motief de cytoplasmatische staart van MHC-I bindt.(38) Het doel van de downregulatie van deze belangrijke co-receptoren is het vermijden van superinfecties in de geïnfecteerde cellen.(39;40) Daarnaast kan de downregulatie van CXCR4 bijdragen tot inhibitie van T-cel migratie met als doel interactie met het immuunsysteem van de gastheer te vermijden.(41) Deze functie is sterk aanwezig bij SIV Nefs die CXCR4 niet als co-receptor gebruiken voor intrede in de cel. Op deze manier worden de fysiologische effecten van SDF-1α onderdrukt, waaronder T-cel migratie naar de lymfeknopen. HIV-1 en sommige HIV-2 Nefs vertonen een veel zwakkere CXCR4
15 downregulatie maar zijn nog steeds in staat de T-cel migratie te onderdrukken, vermoedelijk via manipulatie van intracellulaire pathways.(42)
4.2.2.3 MHC-I-downregulatie
Het ‘major histocompatibility complex’, ook wel ‘human leukocyte antigen complex’ (HLA) genoemd, is een glycoproteïne ter hoogte van de celmembraan van antigen presenterende cellen. Het presenteert antigenen aan circulerende T-cellen die vervolgens geactiveerd worden en de immuunrespons tegen dat antigen opstarten. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen MHC-I en MHC-II moleculen. MHC- I is aanwezig op bijna alle celtypes, presenteert antigenen die intracellulair repliceren en zorgt voor de activatie van CD8+ cytotoxische T-lymfocyten (CTL).(2)
Men heeft aangetoond dat in vitro geïnfecteerde cellen die HIV en SIV Nefs expresseren een gedaalde MHC-I oppervlakte expressie vertonen en minder gevoelig zijn voor lyse door cytotoxische T- lymfocyten.(43) MHC-I downregulatie zal de geïnfecteerde cellen echter niet volledig beschermen gezien de bijzonder sterke CTL respons tegen HIV antigenen.(44)
Nef zorgt specifiek voor een afname van de isotypes HLA-A en HLA-B, die beide endogene antigenen presenteren aan CTL’s. De isotypes HLA-C en HLA-E worden niet aangevallen door Nef omdat zij bescherming bieden tegen ‘natural killer’ (NK) cellen. Het mechanisme van deze downregulatie staat nog ter discussie. Men heeft aangetoond dat Nef MHC-I downreguleert via de samenstelling van een multikinase complex dat via een onbekend mechanisme voor een verhoogde endocytose van MHC-I zorgt.(45) Daarnaast heeft men ook een model voorgesteld waarbij Nef de staart van de MHC-I receptor gebruikt voor downregulatie.(46)
4.2.3 Verstoren van signaaltransductie cascades met nadruk op Pak2 interactie
Naast de downregulatie van verscheidene oppervlaktereceptoren verstoort Nef bepaalde intracellulaire transductie cascades met onder meer een verhoogde T-cel activatie, efficiënte virale replicatie en een toename van de HIV infectiviteit als gevolg.
Eén van de meest geconserveerde interacties van Nef is deze met Pak2, een serine/threonine kinase dat deel uitmaakt van de Pak-familie.(47) Pak2 wordt geactiveerd door Rac en Cdc42 GTPasen en speelt een rol bij de regulatie van vele cellulaire processen die onder meer betrekking hebben tot cytoskelet organisatie, celmotiliteit, transcriptie en apoptose.(48) Men heeft bovendien aangetoond dat Pak2 een rol speelt bij T-cel activatie waardoor men vermoedt dat het een belangrijk aandeel heeft in de geobserveerde effecten van Nef.
De Nef/Pak2 associatie vindt plaats in een multiproteïne complex waarvan de volledige samenstelling nog niet volledig opgehelderd is. Aangetoonde elementen van dit complex zijn Nef, Pak2, ‘ras-related C3 botulinum toxin substrate 1’ (Rac1) GTPase, ‘Vav1 guanine exchange factor’ (Vav1) en een onbekend substraat. De vorming van dit complex gaat gepaard met de autofosforylatie en bijgevolg
16 activatie van Pak2. De activatie van Pak2 door Nef is overigens ook afhankelijk van de incorporatie van dit complex in veteilandjes ter hoogte van de celmembraan.(49)
Belangrijke domeinen in het Nef eiwit voor deze interactie zijn het N-terminale myristoylatie domein, het SH3 bindend domein (het P76xxP79 motief) en de arginine residues R105 en R106 die sterk geconserveerd zijn in HIV en SIV Nef.(50) Men vermoedt dat Nef de guanine exchange factor Vav 1 recruteert en activeert waarna de GTPasen Rac en/of Cdc42 geactiveerd worden die op hun beurt Pak2 activeren. Nef zou hiervoor zijn SH3 bindend domein gebruiken.(49)
De fysiologische rol van de Nef/Pak2 interactie is onduidelijk doordat gemuteerde Nef eiwitten ook andere Nef functies verstoren en omdat de Nef/Pak2 interactie variabel en moeilijk te detecteren is.(51) Zo heeft men aangetoond dat mutaties in het SH3 bindend domein naast een verstoorde Pak2 activatie ook de MHC-I downregulatie en verhoging van de virion infectiviteit verstoren. Mutaties in de arginine residues zorgen ook voor een gestoorde Pak2 activatie maar zorgen daarnaast ook voor een gedaalde CD4 en MHC-I downregulatie, en een gestoorde verhoging van de HIV infectiviteit. Op deze manier kunnen geobserveerde effecten niet aan de Nef/Pak2 interactie verbonden worden, waardoor het belang van deze interactie nog steeds niet duidelijk is.(46) Recent heeft men echter aangetoond dat een hydrofoob bindingsvlak in het kerndomein van Nef een cruciale rol speelt voor Nef/Pak2 interactie.(52) Het aminozuur fenylalanine op plaats 191 in Na-7 Nef (53) en op plaats 195 in SF2 Nef (54) heeft een centrale positie in dit bindingsvlak en speelt een cruciale rol bij de Pak2-interactie.(52) Specifieke mutanten van dit aminozuur, welke elk een verschillend vermogen hebben om met Pak2 te interageren, maken het wel mogelijk om de relevantie van de Nef/Pak2 interactie voor verschillende Nef functies te bestuderen. Zo heeft men aangetoond dat de Na-7 Nef mutanten F191H en F191R respectievelijk een gedaalde en geen interactiecapaciteit met Pak2 bezitten.(53) De SF2 Nef mutanten F195I en F195A vertoonden na expressie een zeer lage Pak2 activiteit.(54) Deze mutanten verstoren Pak2 activatie en associatie door een gestoorde Vav1 mobilisatie naar de membraneuze veteilandjes.(54)
Onderzoek met verscheidene Nef allelen heeft aangetoond dat er een zeer variabele interactiecapaciteit met Pak2 bestaat. Verschillende studies toonden aan dat de Nef/Pak2 interactie geen belang heeft in het verhogen van de virale replicatie maar eerder een rol speelt bij de modulatie van HIV-1 transcriptie, cel overleving en actine organisatie.(50)
Onderzoek met deze nieuwe mutanten heeft aangetoond dat de Nef/Pak2 interactie geen invloed heeft op CD4 en MHC-I receptor downregulatie en eveneens geen belangrijke rol speelt bij T-cel activatie, apoptose en virale replicatie.(53) Daarnaast verstoort de Nef/Pak2 interactie de SDF-1α/CXCR4 gemedieerde chemotaxis door zijn invloed op het cytoskelet. Het zorgt namelijk voor een fosforylatie
17 van cofiline waardoor een gestoorde actine remodelling optreedt met als gevolg een gedaalde celmotiliteit.(50)
4.3 Retro- en lentivirale vectoren
Door middel van gentherapie tracht men genetisch materiaal in een cel te introduceren met als doel een ziekte te genezen of de progressie ervan te vertragen. Er bestaan verschillende manieren om genetisch materiaal in een cel te introduceren, elk met hun voor- en nadelen, maar men maakt meer en meer gebruik van virale vectoren. Men baseert zich hierbij op verschillende virussen waaronder retrovirussen, lentivirussen, adenovirussen en herpesvirussen die elk een andere virale biologie bezitten. Retrovirussen worden frequent gebruikt gezien de levenslange expressie van het transgen door integratie in het genoom van de gastcel. Om het risico op recombinatie tot een infectieus virus te beperken worden de regio’s die coderen voor virale eiwitten vervangen door een transgen naar keuze en worden de cis regulerende elementen nodig voor ‘packaging’ en integratie intact gelaten. De coderende genen worden, naast het transgen, in trans toegevoegd aan een producerende cellijn waarin de virale vectoren aangemaakt worden.(55)
Figuur 5: Omvorming retro- en lentivirale virussen tot vectoren. (Rood) De noodzakelijke cis regulerende regio’s worden behouden in de vectoren. (Groen) De resterende genen worden in trans via packaging vectoren aan de producerende cellijn toegevoegd (Blauw) waarbij de genen die niet noodzakelijk zijn verwijderd worden. Figuur uit Verma IM, Weitzman MD. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem 2005;74:711-38.
4.3.1 Retrovirale vectoren
Voor de aanmaak van het vector construct vervangt men de structurele genen met het gewenste transgen. Hierbij worden het packaging signaal, de virale LTR’s en de omgevende sequenties noodzakelijk voor reverse transcriptie en integrase behouden. Op deze manier wordt het transgen geïntroduceerd in het cellulair genoom van de gastcel. In plaats van de virale LTRs kan ook een CMV/LTR hybride promotor gebruikt worden die een hogere transcriptieactiviteit bevat.(56)
18 De packaging constructen met de genen Gag, Pol en Env worden in trans in de cel geïntroduceerd op afzonderlijke constructen zodanig dat de kans op het ontstaan van een replicatie competent virus door recombinatie verkleint. Daarnaast bevatten deze constructen constitutieve promoteren zoals de promotor van het cytomegalovirus (CMV) die een hogere virusproductie toelaten.(55) Men maakt ook gebruik van ‘self-inactivating’ (SIN) vectoren zodat de kans op recombinatie met endogene defectieve retrovirussen gereduceerd wordt. Door een deletie ter hoogte van de U3 regio in 3’ LTR gaan de virale enhancer en promotor verloren. Na reverse transcriptie bevindt deze deletie zich ook ter hoogte van de 5’ LTR resulterend in een transcriptionele inactivatie van het provirus waardoor de expressie enkel bepaald wordt door de interne promotor (bijvoorbeeld CMV).(57)
4.3.2 Lentivirale vectoren
Lentivirussen bevatten naast de Pol, Gag en Env genen ook 4 accessoire (Vif, Vpr, Vpu en Nef) en 2 regulatoire genen (Rev en Tat). Net zoals de retrovirussen zorgen ze voor een langdurige en stabiele genexpressie. Lentivirussen kunnen in tegenstelling tot retrovirussen niet- of traag delende, gedifferentieerde cellen zoals AgPC’s, monocyten en neuronen infecteren, een eigenschap waarvan men gebruik maakt voor gen transfer in somatisch weefsel. Het verschil bevindt zich in de herkenning van het pre-integratiecomplex door het cellulaire nucleaire import mechanisme dat het nucleocapside van het virus naar de celkern begeleidt. Retrovirussen kunnen de celkern pas binnentreden na mitose van de cel.(58)
In FIGUUR 6 wordt het principe van de aanmaak van lentivirale constructen weergegeven. De ontwikkeling van het vector construct is enerzijds analoog aan de retrovirussen waarbij de virale LTR’s en het packaging signaal behouden blijven. Daarnaast worden echter ook de RRE en cPPT (central Polypurine Tract) sequenties behouden. De RRE sequentie blijft behouden voor de nucleaire export van niet-gesplitste virale RNA strengen. Net als bij de retrovirussen kan een CMV/LTR hybride promotor gebruikt worden die onafhankelijk is van Tat expressie en een verhoogde vector productie veroorzaakt.(55) De wegname van de accessoire genen heeft geen invloed op de replicatie en transductie van het virus in vitro.(59)
In de loop van de jaren werden de vector en packaging constructen verbeterd:
- Het Tat gen werd vervangen door constitutieve promotors zoals de CMV-promotor.(60)
- Het gebruik van SIN-vectoren vermijdt recombinatie met endogene defectieve retrovirussen en de mogelijke activatie van een oncogen volgend op integratie.(60)
- Het gebruik van de cPPT in cis zorgt voor een verbeterde translocatie van het pre-integratie complex naar de nucleus met als gevolg een efficiëntere transductie.(60)
19 - ‘Pseudotyping’ van de enveloppe met bijvoorbeeld ‘Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein’
(VSV-G) zorgt voor een groter tropisme van de lentivirale vectoren. Het VSV-G interageert met een lipide in de celmembraan waardoor alle cellen getransduceerd kunnen worden. Bovendien verkleint de kans op het ontstaan van een wild type (WT) virus. Op eenzelfde manier kan het tropisme ook beperkt worden tot een specifiek celtype.(60)
- Het gebruik van het ‘Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element’ (WPRE) afkomstig van het Woodchuck hepatitis virus stabiliseert het vector mRNA, verhoogt translatie en verbetert zo de expressie van het transgen.(60)
Figuur 6: Productie van lentivirale vectoren. De packaging constructen en het vector construct worden samen getransfecteerd in een producerende cellijn (hier: HEK 293T cellen). Na productie van het virus wordt het viraal supernatans geoogst en gebruikt voor transductie van cellen. Zie tekst voor uitleg omtrent de samenstelling van de constructen. Figuur uit Howarth JL, Lee YB, Uney JB. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS- UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biol Toxicol 2010 Feb;26(1):1-20.
4.3.3 Vectoren in onderzoeksproject
De Nef mutanten die gebruikt worden voor de aanmaak van lentivirale vectoren worden uit een retrovirale LZRS-Nef-IRES-EGFP vector geknipt en in een lentivirale TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector (8866 bp) geligeerd (zie ook Methodologie) (FIGUUR 7). Er bestaan verschillende methodes om meerdere genen tot expressie te brengen in een vector waaronder het gebruik van een ‘intern ribosomal entry site’ (IRES), zoals in dit experiment. De ribosomen herkennen en binden deze IRES en kunnen zo de translatie starten. Het wordt in een bicistronische vector tussen twee genen geplaatst zodat er bij transcriptie 1 transcript wordt gevormd en bij translatie twee eiwitten worden gevormd. In dit experiment zijn dat Nef en ‘enhanced green fluorescent protein’ (eGFP) zodat aan de hand van de expressie van eGFP de aanwezigheid van Nef vastgesteld kan worden.(61)
20
Figuur 7: Voorstelling van de SIN lentivirale WT TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector plasmide. Dit plasmide bevat naast bovenvermelde elementen een EF1α promoter, een pUC replication origin, een SV40 promotor-enhancer en een xanthine- guanine fosforibosyl transferase (XGPRT). De pUC replication origin is een DNA sequentie waar de plasmide replicatie gestart wordt. De vector heeft een SV40 promotor enhancer die de activiteit van de promoter verhoogt en de expressie van XGPRT verzorgt. XGPRT is een enzym dat xanthine omzet naar xanthine monofosfaat (XMP) en vervolgens naar guanine monofosfaat (GMP). De producer cellen worden gekweekt in een xanthine rijk medium waardoor alleen de cellen die dit enzym tot expressie brengen overleven.(62) Figuur aangemaakt met VectorNTI Advance 10.
4.4 Onderzoeksdoel
Voorgaande experimenten hebben aangetoond dat de Nef/Pak2 interactie belangrijk is voor het uitvoeren van verschillende Nef functies (zie Inleiding). Er waren bovendien indicaties dat Pak2 interactie belangrijk is voor CXCR4 downregulatie. Door het gebruik van specifieke Nef mutanten die een gestoorde Nef/Pak2 interactie veroorzaken, kan de CXCR4 downregulatie onderzocht worden. In een eerste stap wordt Nef tot expressie gebracht door middel van retrovirale vectoren. Naar de toekomst toe is het echter ook interessant om de Nef/Pak2 interactie te onderzoeken in andere celtypes waarbij ook andere Nef functies onderzocht kunnen worden. Dendritische cellen bijvoorbeeld zijn weinig actieve cellen die zeer inefficiënt getransduceerd worden door retrovirussen. Het gebruik van lentivirale vectoren kan hier een oplossing bieden. Het tweede deel van mijn thesis is daarom gericht op de aanmaak van lentivirale constructen die Nef expresseren. Er wordt hiervoor gebruik gemaakt van Nef mutanten die specifiek gemuteerd zijn in een interactievlak dat belangrijk is voor Pak2 interactie.
Amp resistance
XGPRT EGFP
LTR
LTRdeltaU3 polyl deleted
packaging signal 5' splice site gag start site Rev response element
cPPT CTS
SV40 polyA signal and intron SV40 promoter-enhancer
EF1alpha
pUC replication origin
21
5 Materialen en methoden
5.1 Opgroeien Nef mutanten uit glycerolstock Volgende plasmiden werden gebruikt in deze thesis:
- LZRS-Na-7 WT-IRES-EGFP - LZRS-Na-7 F191R-IRES-EGFP - LZRS-Na-7 F191H-IRES-EGFP - LZRS-SF2 WT-IRES-EGFP - LZRS-SF2 F195A-IRES-EGFP - LZRS-SF2 F195I-IRES-EGFP
- TRIP-EF1α-EGFP-WPRE (lentivirale dragende vector)
Na kort ontdooien van de gewenste plasmiden uit de glycerolstock werd 5 µl van elk plasmide uitgesmeerd op een met ampiciline (Amp) gesupplementeerde Difco LB Lennox Agar plaat (Beckton Dickinson (BD) Biosciences, Erembodegem, België). Na een overnachting bij 37°C werd er van de gevormde kolonies één geselecteerd en in 11 ml LB Broth Amp medium (Roche Diagnostics, Bazel, Zwitserland) overgebracht. Dit medium werd op zijn beurt overnacht bewaard in een schudtafel (225 rpm) bij 37°C.
5.2 Plasmide DNA purificatie
De verschillende plasmiden werden opgezuiverd met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Venlo, Nederland). De bacteriële suspensie werd eerst 3 min gecentrifugeerd met een Eppendorf 5415D (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) bij 13000 rpm, waarna het supernatans verwijderd werd. De bacteriële pellet werd vervolgens geresuspendeerd in 250 µl buffer P1 (bestaande uit 50 mM Tris-Cl (Tris(hydroxymethyl) aminomethaan hydrochloride); pH 8, 10 mM EDTA (ethyleen diamine tetra-acetaat) en 100 µg/ml Rnase A (ribonuclease A)). De bacteriën werden gelyseerd door additie van 250 µl buffer P2 (bestaande uit 1% SDS (sodium dodecyl sulfaat) en 200 mM NaOH (natriumhydroxide)), een reactie die geneutraliseerd werd door toevoegen van 350 µl buffer N3. Het mengsel werd gedurende 10 min gecentrifugeerd bij 13000 rpm waarna het plasmide bevattende supernatans naar een QIAprep Spin Column werd overgepipetteerd en vervolgens 1 min bij 13000 rpm werd gecentrifugeerd. De kolom werd gewassen met 750 µl Buffer PE door middel van centrifugatie (1 min, 13000 rpm). De rest werd verwijderd, gevolgd door 1 min centrifugatie om de residuele buffer te verwijderen. Uiteindelijk werd het plasmide DNA geëlueerd in 50 µl Buffer EB (bestaande uit 10mM Tris-Cl; pH 8,5) dat gedurende 1 min incubeerde en ten slotte 1 min centrifugeerde bij 13000 rpm. De concentratie van het bekomen plasmide DNA werd bepaald aan de hand van Nanodrop met de spectrofometer ND-1000 (Isogen Life Science, De Meern, Nederland).
22 5.3 Restrictie TRIP vector en Nef mutanten
De Nef mutanten aanwezig in de retrovirale vectoren werden door middel van restrictie overgebracht in een lentivirale TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector. De Nef mutanten werden geïsoleerd uit de retrovirale vectoren met behulp van de restrictie-enzymen BamHI en SalI. De TRIP vector werd opengeknipt met de restrictie-enzymen BamHI en XhoI.
5.3.1 Restrictie Nef mutanten
Reactiemengsel: 2 µg vector DNA, 5 µl 10x NE buffer 3 (New England Biolabs (NEB), Ipswich, UK), 1 µl BamHI (NEB), 1 µl SalI (NEB) en 0,5 µl BSA (Bovine Serum Albumine) (NEB). Ten slotte werd DNAse vrij H2O toegevoegd zodanig dat een totaal volume van 50 µl bereikt werd. Dit mengsel werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C (FIGUUR 8).
Figuur 8: Illustratie LZRS-Nef-IRES-EGFP vector. De restrictie-enzymen BamHI en SalI zijn weergegeven op de vector. De cijfers tussen haken geven de plaats van restrictie op de vector weer (in basenparen). Deze vector heeft een totale grootte van 12339 basenparen.
5.3.2 Restrictie TRIP vector
Reactiemengsel: 4 µg TRIP vector (321 ng/µl), 5 µl 10x NE buffer 3 (NEB), 1 µl BamHI (NEB), 1 µl XhoI (NEB), 0,5 µl BSA (NEB) en 30 µl DNAse vrij H2O met een totaal volume van 50 µl. Dit mengsel werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C (FIGUUR 9).
LZRS-NEF-IRES-EGFP
12339 bp
Nef
EGFP IRES BamH I (1940)
SalI (3944) SalI (6518)
23
Figuur 9: Illustratie TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector. De restrictie-enzymen BamHI, XhoI en NcoI zijn weergegeven op de vector die een totale grootte van 8866 bp bezit. De cijfers tussen haken geven de restrictieplaats op de vector weer. Figuur werd aangemaakt met Vector NTI Advance 10.
5.4 Gelelektroforese
Deze techniek stelt ons in staat DNA-fragmenten te scheiden op basis van hun basenpaarlengte. Het DNA, dat negatief geladen is, wordt aangetrokken door de positieve pool in een elektrisch aangelegd veld. Aangezien dit DNA verschillende lengtes heeft na restrictie zal elk fragment op een verschillende plaats in de gel eindigen.(63)
Er werd gebruik gemaakt van een 2% agarosegel bestaande uit 250 ml 1x TAE buffer (Tris-acetaat- EDTA) (Invitrogen, Merelbeke, België) en 5g agarose MP (Roche). Dit mengsel werd opgewarmd tot een heldere vloeibare substantie en vervolgens afgekoeld in een daarvoor voorzien bakje waarin zich een ‘kam’ bevond die ‘slots’ creeërde. De gel werd vervolgens in het PowerPac HC (Bio-Rad Labaratories, Hercules, USA) elektroforesetoestel geplaatst dat gevuld werd met een 0,5x TAE buffer.
De gel werd geladen met 2 referentieladders (Gene Ruler 1 Kbp DNA Ladder en Gene Ruler 100 bp DNA Ladder beide van Fermentas International Inc (Fermentas), Burlington, Canada), een ongeknipte controle, een controle en de restricties. Aan elk van bovenstaande werd 6x DNA Loading Dye (Fermentas) toegevoegd. Het toestel werd ingesteld op 1 uur 15 min, 160 V en 0,15 A. Ten slotte werden de restricties gevisualiseerd met behulp van een ethidiumbromide (EtBr) oplossing (Sigma- Aldrich, St. Louis, USA) en UV-licht analyse.
5.5 DNA purificatie
Na gelelektroforese werden de bandjes corresponderend met de gewenste basenpaarlengte uitgesneden en opgezuiverd met de Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA). De concentratie werd bepaald met behulp van Nanodrop.
TRIP EF1alpha SEQ
8866 bp
Amp resistance XGPRT
EGFP LT R
LT RdeltaU3 polyl deleted packaging signal 5' splice site
gag start site
Rev response element
cPPT CTS SV40 polyA signal and intron
SV40 promoter-enhancer EF1alpha
pUC replication origin
Bam H I (2455)
Xho I (3213) Nco I (2474) Nco I (6683)
24 5.6 Ligatie Nef mutanten in TRIP vector
De Nef mutanten bekomen na restricties van LZRS vectoren werden geligeerd in opengeknipte TRIP vectoren. Doordat SalI en XhoI overeenkomstige ‘sticky ends’ bevatten is deze ligatie mogelijk. In een eerste stap werd de TRIP vector gedefosforyleerd met de bedoeling autosluiting te voorkomen. We maakten hiervoor gebruik van het rAPid Alkaline Phosphatase (Roche) dat in staat is de eindstandige 5’ fosforyl groep te verwijderen van de vector fragmenten. De ligasen gebruiken deze fosfaatgroepen om overeenkomstige DNA fragmenten covalent te binden via een fosfodiëster binding. Doordat de 5’
fosfaatgroepen van de inserts behouden blijven, kan ligatie aan de vrije 3’ streng van de vector doorgaan. Omdat er stabiele basenpaar verbindingen ontstaan tussen de overgebleven ‘sticky ends’
kan het recombinant plasmide een circulaire structuur aannemen en behouden. Na transformatie wordt dit defect vervolgens hersteld door bacteriële enzymen. In theorie is autoligatie niet mogelijk omdat de
‘sticky ends’ niet overeenkomen maar in de praktijk gebeurt dit wel.
Aan de totale hoeveelheid TRIP vector (50 µl) werd 6 µl 10x rAPid Alkaline Phosphatase Buffer (Roche), 1 µl rAPid Alkaline Phosphatase (Roche) en 3 µl H2O toegevoegd met een eindvolume van 60 µl. Na vortexen werd dit mengsel gedurende 30 min geïncubeerd bij 37°C. Vervolgens werd het fosfatase geïnactiveerd door het mengsel gedurende 2 min in een Stuart Block Heater 200D (Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK) op 75°C te plaatsen.
Het DNA werd in een tweede stap opgezuiverd via de Promega Wizard Kit (zie punt 5.5).
Ten slotte werd de TRIP vector geligeerd met de Nef mutanten. Hiervoor werd telkens 50 ng TRIP vector en 37,5 ng insert gebruikt zodat er een verhouding insert/vector van 3/1 bekomen werd. Dit mengsel werd aangevuld met 2 µl 10x T4 DNA Ligase Reaction Buffer (NEB) en 2 µl 10x T4 DNA Ligase (NEB) dat reeds 1/10 verdund werd in H2O en dus een eindverhouding van 1/100 verkreeg. Het mengsel werd aangelengd met H20 tot een eindvolume van 20 µl. Als controle voor eventuele autosluiting werd 5 µl TRIP vector, 2 µl T4 DNA Ligase Reaction Buffer, 2 µl T4 DNA Ligase en 11 µl H2O gebruikt. De aangemaakte mengsels werden gedurende 40 min bij 4°C bewaard.
5.7 Transformatie in DH5α-competente cellen
De geligeerde plasmiden, waaronder de controle, werden opgegroeid in DH5α-competente cellen met als doel een grote hoeveelheid vector te bekomen. Hierbij werd er ook een controle met een ongeknipte WT TRIP vector toegevoegd dat het bewijs van een succesvolle transformatie moet leveren. Het Amp resistentiegen bevindt zich op de TRIP vectoren waardoor de bacteriën bij een gefaalde transformatie afsterven en geen kolonies vormen. De bevroren DH5α-competente cellen werden ontdooid waarna de volledige inhoud (100 µl) voorzichtig overgebracht werd naar een 13 ml polypropyleenbuis. Hieraan werd 10 µl ligaat of 2 µl controle toegevoegd, gemengd (niet geresuspendeerd) en vervolgens 45 min op ijs geplaatst. De bacteriën werden vervolgens 2 min in een warm waterbad (42°C) aan een hitteschok onderworpen zodanig dat hun poriën zich sluitten en de plasmides vast zaten in de bacteriën. De stalen werden onmiddelijk terug op ijs geplaatst en gemengd
25 met 700 µl S.O.C. medium (Invitrogen) dat rijk is aan voedingsstoffen zodat de bacteriën kunnen recuperen. De bacteriën groeidden gedurende 1 uur op 37°C in de schudder (225 rpm) vooraleer 150 µl uitgeplaat werd op LB Amp Agars. De bacteriën werden overnacht bewaard bij 37°C wat hen de kans gaf te groeien en kolonies te vormen. De volgende dag werden per conditie 5 kolonies geselecteerd en opgegroeid in 11 ml LB Amp medium.
De plasmiden werden ten slotte opgezuiverd uit de bacteriën (zie punt 5.2).
5.8 Controle van de ligaties
Om de ligatie te bevestigen werd de aanwezigheid van de Nef mutanten in de TRIP vectoren
aangetoond met een aantal controlerestricties. De restrictiefragmenten werden vervolgens gescheiden door middel van gelelektroforese waarna de aanwezigheid van Nef al dan niet bevestigd kon worden.
De Nef mutanten werden bovendien geanalyseerd met behulp van PCR Sequencing waarbij de aanwezigheid van de mutaties nagegaan werd.
5.8.1 Controlerestricties
5.8.1.1 Restricties van de ligaties met BamHI, XhoI en NcoI
De restrictie-enzymen, BamHI en XhoI, die gebruikt werden om de TRIP vector open te knippen voor ligatie met de Nef mutanten werden ook hier gebruikt. Op deze manier werden de Nef mutanten uit de TRIP vector geknipt en kon de aanwezigheid van Nef al dan niet bevestigd worden.
Reactiemengsel voor restrictie met BamHI en XhoI: 800 ng vector, 3 µl 10x NE Buffer 3 (NEB), 1 µl BamHI (NEB), 1µl XhoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.
De integriteit van de ‘backbone’ (de dragende TRIP vector) werd gecontroleerd via restrictie met het restrictie-enzym NcoI.
Reactiemengsel voor restrictie met NcoI: 800 ng vector, 3 µl 10x NE Buffer 4 (NEB), 1 µl NcoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.
Als controle werd 1 µl vector, 9 µl H20 en 2 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas) gebruikt.
5.8.1.2 Restricties van de WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI De WT TRIP vector werd gecontroleerd op mogelijke interne knipsites.
Reactiemengsel voor restrictie met BamHI en XhoI: 2 µl WT TRIP vector, 3 µl 10x NE Buffer 3 (NEB), 1 µl BamHI (NEB), 1 µl XhoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.
26 Reactiemengsel voor restrictie met NcoI: 2 µl WT TRIP vector, 3 µl 10x NE Buffer 4 (NEB), 1 µl NcoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.
Ter controle werd 2 µl WT TRIP vector, 8 µl H20 en 2 µl 6x Loading Dye (Fermentas) gebruikt.
Deze restricties werden gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd waarna gelelektroforese (1 uur 15 min, 0,3 A, 150 V) uitgevoerd werd met een 2% 250 ml agarosegel. De ladders Gene Ruler 1 Kbp DNA Ladder en Gene Ruler 100 bp DNA Ladder van Fermentas werden hierbij gebruikt. De gels werden gevisualiseerd met behulp van UV-analyse nadat ze 40 min in het Etbr bad incubeerden.
5.8.2 PCR Sequencing
5.8.2.1 Sequencing
De sequentie van de Nef mutanten werd bepaald volgens de Sanger methode. Hierbij wordt een DNA template geamplificeerd vanaf een primer met deoxynucleotiden (dNTP) en dideoxynucleotiden (ddNTP). Doordat deze ddNTP’s een -OH groep missen op C3 wordt er na inbouw geen fosfodiëster binding gevormd met een daaropvolgend dNTP. Hierdoor ontstaan er DNA fragmenten van verschillende groottes die door middel van gelelektroforese gescheiden kunnen worden. Doordat elke ddNTP gemerkt is met een verschillend fluorochroom kunnen deze na excitatie met een laser van elkaar onderscheiden worden en kan de sequentie bepaald worden.(64;65)
Voor dit experiment werd de Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems (ABI), Perkin Elmer, Foster City, USA) gebruikt waarbij 2,5 µl primer, 12 µl DNAse vrij H20, 3,5 µl 5x Big Dye Sequencing buffer en 1 µl Ready Reaction mix bij 1 µl van elke geligeerde Nef mutant, dat dienst doet als DNA template, gevoegd werd met een eindvolume van 20µl. De bindingsplaatsen van deze primers op de DNA template worden weergegeven in FIGUUR 10. De primersequenties worden weergegeven in TABEL 1. De primers werden aangekocht bij Eurogentec, Seraing, België.
Figuur 10: Primer bindingsplaatsen. (rood) De Nef Sense primer bindt aan de start van de Nef sequentie op het Nef gen.
(groen) De F8989 Sense primer en de (geel) SEQ Rev Antisense primer binden in het midden van de DNA template. (geel) De TRIP Rev Antisense primer ten slotte bindt ter hoogte van de TRIP vector net na de Nef sequentie. De DNA template komt overeen met de Nef mutanten die in de TRIP vectoren geligeerd zijn.
