Plasmide DNA purificatie

De verschillende plasmiden werden opgezuiverd met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Venlo, Nederland). De bacteriële suspensie werd eerst 3 min gecentrifugeerd met een Eppendorf 5415D (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) bij 13000 rpm, waarna het supernatans verwijderd werd. De bacteriële pellet werd vervolgens geresuspendeerd in 250 µl buffer P1 (bestaande uit 50 mM Tris-Cl (Tris(hydroxymethyl) aminomethaan hydrochloride); pH 8, 10 mM EDTA (ethyleen diamine tetra-acetaat) en 100 µg/ml Rnase A (ribonuclease A)). De bacteriën werden gelyseerd door additie van 250 µl buffer P2 (bestaande uit 1% SDS (sodium dodecyl sulfaat) en 200 mM NaOH (natriumhydroxide)), een reactie die geneutraliseerd werd door toevoegen van 350 µl buffer N3. Het mengsel werd gedurende 10 min gecentrifugeerd bij 13000 rpm waarna het plasmide bevattende supernatans naar een QIAprep Spin Column werd overgepipetteerd en vervolgens 1 min bij 13000 rpm werd gecentrifugeerd. De kolom werd gewassen met 750 µl Buffer PE door middel van centrifugatie (1 min, 13000 rpm). De rest werd verwijderd, gevolgd door 1 min centrifugatie om de residuele buffer te verwijderen. Uiteindelijk werd het plasmide DNA geëlueerd in 50 µl Buffer EB (bestaande uit 10mM Tris-Cl; pH 8,5) dat gedurende 1 min incubeerde en ten slotte 1 min centrifugeerde bij 13000 rpm. De concentratie van het bekomen plasmide DNA werd bepaald aan de hand van Nanodrop met de spectrofometer ND-1000 (Isogen Life Science, De Meern, Nederland).

22 5.3 Restrictie TRIP vector en Nef mutanten

De Nef mutanten aanwezig in de retrovirale vectoren werden door middel van restrictie overgebracht in een lentivirale TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector. De Nef mutanten werden geïsoleerd uit de retrovirale vectoren met behulp van de restrictie-enzymen BamHI en SalI. De TRIP vector werd opengeknipt met de restrictie-enzymen BamHI en XhoI.

5.3.1 Restrictie Nef mutanten

Reactiemengsel: 2 µg vector DNA, 5 µl 10x NE buffer 3 (New England Biolabs (NEB), Ipswich, UK), 1 µl BamHI (NEB), 1 µl SalI (NEB) en 0,5 µl BSA (Bovine Serum Albumine) (NEB). Ten slotte werd DNAse vrij H2O toegevoegd zodanig dat een totaal volume van 50 µl bereikt werd. Dit mengsel werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C (FIGUUR 8).

Figuur 8: Illustratie LZRS-Nef-IRES-EGFP vector. De restrictie-enzymen BamHI en SalI zijn weergegeven op de vector. De cijfers tussen haken geven de plaats van restrictie op de vector weer (in basenparen). Deze vector heeft een totale grootte van 12339 basenparen.

5.3.2 Restrictie TRIP vector

Reactiemengsel: 4 µg TRIP vector (321 ng/µl), 5 µl 10x NE buffer 3 (NEB), 1 µl BamHI (NEB), 1 µl XhoI (NEB), 0,5 µl BSA (NEB) en 30 µl DNAse vrij H2O met een totaal volume van 50 µl. Dit mengsel werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C (FIGUUR 9).

LZRS-NEF-IRES-EGFP

12339 bp

Nef

EGFP IRES BamH I (1940)

SalI (3944) SalI (6518)

23

Figuur 9: Illustratie TRIP-EF1α-EGFP-WPRE vector. De restrictie-enzymen BamHI, XhoI en NcoI zijn weergegeven op de vector die een totale grootte van 8866 bp bezit. De cijfers tussen haken geven de restrictieplaats op de vector weer. Figuur werd aangemaakt met Vector NTI Advance 10.

5.4 Gelelektroforese

Deze techniek stelt ons in staat DNA-fragmenten te scheiden op basis van hun basenpaarlengte. Het DNA, dat negatief geladen is, wordt aangetrokken door de positieve pool in een elektrisch aangelegd veld. Aangezien dit DNA verschillende lengtes heeft na restrictie zal elk fragment op een verschillende plaats in de gel eindigen.(63)

Er werd gebruik gemaakt van een 2% agarosegel bestaande uit 250 ml 1x TAE buffer (Tris-acetaat-EDTA) (Invitrogen, Merelbeke, België) en 5g agarose MP (Roche). Dit mengsel werd opgewarmd tot een heldere vloeibare substantie en vervolgens afgekoeld in een daarvoor voorzien bakje waarin zich een ‘kam’ bevond die ‘slots’ creeërde. De gel werd vervolgens in het PowerPac HC (Bio-Rad Labaratories, Hercules, USA) elektroforesetoestel geplaatst dat gevuld werd met een 0,5x TAE buffer.

De gel werd geladen met 2 referentieladders (Gene Ruler 1 Kbp DNA Ladder en Gene Ruler 100 bp DNA Ladder beide van Fermentas International Inc (Fermentas), Burlington, Canada), een ongeknipte controle, een controle en de restricties. Aan elk van bovenstaande werd 6x DNA Loading Dye (Fermentas) toegevoegd. Het toestel werd ingesteld op 1 uur 15 min, 160 V en 0,15 A. Ten slotte werden de restricties gevisualiseerd met behulp van een ethidiumbromide (EtBr) oplossing (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) en UV-licht analyse.

5.5 DNA purificatie

Na gelelektroforese werden de bandjes corresponderend met de gewenste basenpaarlengte uitgesneden en opgezuiverd met de Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA). De

24 5.6 Ligatie Nef mutanten in TRIP vector

De Nef mutanten bekomen na restricties van LZRS vectoren werden geligeerd in opengeknipte TRIP vectoren. Doordat SalI en XhoI overeenkomstige ‘sticky ends’ bevatten is deze ligatie mogelijk. In een eerste stap werd de TRIP vector gedefosforyleerd met de bedoeling autosluiting te voorkomen. We maakten hiervoor gebruik van het rAPid Alkaline Phosphatase (Roche) dat in staat is de eindstandige 5’ fosforyl groep te verwijderen van de vector fragmenten. De ligasen gebruiken deze fosfaatgroepen om overeenkomstige DNA fragmenten covalent te binden via een fosfodiëster binding. Doordat de 5’

fosfaatgroepen van de inserts behouden blijven, kan ligatie aan de vrije 3’ streng van de vector doorgaan. Omdat er stabiele basenpaar verbindingen ontstaan tussen de overgebleven ‘sticky ends’

kan het recombinant plasmide een circulaire structuur aannemen en behouden. Na transformatie wordt dit defect vervolgens hersteld door bacteriële enzymen. In theorie is autoligatie niet mogelijk omdat de

‘sticky ends’ niet overeenkomen maar in de praktijk gebeurt dit wel.

Aan de totale hoeveelheid TRIP vector (50 µl) werd 6 µl 10x rAPid Alkaline Phosphatase Buffer (Roche), 1 µl rAPid Alkaline Phosphatase (Roche) en 3 µl H2O toegevoegd met een eindvolume van 60 µl. Na vortexen werd dit mengsel gedurende 30 min geïncubeerd bij 37°C. Vervolgens werd het fosfatase geïnactiveerd door het mengsel gedurende 2 min in een Stuart Block Heater 200D (Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK) op 75°C te plaatsen.

Het DNA werd in een tweede stap opgezuiverd via de Promega Wizard Kit (zie punt 5.5).

Ten slotte werd de TRIP vector geligeerd met de Nef mutanten. Hiervoor werd telkens 50 ng TRIP vector en 37,5 ng insert gebruikt zodat er een verhouding insert/vector van 3/1 bekomen werd. Dit mengsel werd aangevuld met 2 µl 10x T4 DNA Ligase Reaction Buffer (NEB) en 2 µl 10x T4 DNA Ligase (NEB) dat reeds 1/10 verdund werd in H2O en dus een eindverhouding van 1/100 verkreeg. Het mengsel werd aangelengd met H20 tot een eindvolume van 20 µl. Als controle voor eventuele autosluiting werd 5 µl TRIP vector, 2 µl T4 DNA Ligase Reaction Buffer, 2 µl T4 DNA Ligase en 11 µl H2O gebruikt. De aangemaakte mengsels werden gedurende 40 min bij 4°C bewaard.

5.7 Transformatie in DH5α-competente cellen

De geligeerde plasmiden, waaronder de controle, werden opgegroeid in DH5α-competente cellen met als doel een grote hoeveelheid vector te bekomen. Hierbij werd er ook een controle met een ongeknipte WT TRIP vector toegevoegd dat het bewijs van een succesvolle transformatie moet leveren. Het Amp resistentiegen bevindt zich op de TRIP vectoren waardoor de bacteriën bij een gefaalde transformatie afsterven en geen kolonies vormen. De bevroren DH5α-competente cellen werden ontdooid waarna de volledige inhoud (100 µl) voorzichtig overgebracht werd naar een 13 ml polypropyleenbuis. Hieraan werd 10 µl ligaat of 2 µl controle toegevoegd, gemengd (niet geresuspendeerd) en vervolgens 45 min op ijs geplaatst. De bacteriën werden vervolgens 2 min in een warm waterbad (42°C) aan een hitteschok onderworpen zodanig dat hun poriën zich sluitten en de plasmides vast zaten in de bacteriën. De stalen werden onmiddelijk terug op ijs geplaatst en gemengd

25 met 700 µl S.O.C. medium (Invitrogen) dat rijk is aan voedingsstoffen zodat de bacteriën kunnen recuperen. De bacteriën groeidden gedurende 1 uur op 37°C in de schudder (225 rpm) vooraleer 150 µl uitgeplaat werd op LB Amp Agars. De bacteriën werden overnacht bewaard bij 37°C wat hen de kans gaf te groeien en kolonies te vormen. De volgende dag werden per conditie 5 kolonies geselecteerd en opgegroeid in 11 ml LB Amp medium.

De plasmiden werden ten slotte opgezuiverd uit de bacteriën (zie punt 5.2).

5.8 Controle van de ligaties

Om de ligatie te bevestigen werd de aanwezigheid van de Nef mutanten in de TRIP vectoren

aangetoond met een aantal controlerestricties. De restrictiefragmenten werden vervolgens gescheiden door middel van gelelektroforese waarna de aanwezigheid van Nef al dan niet bevestigd kon worden.

De Nef mutanten werden bovendien geanalyseerd met behulp van PCR Sequencing waarbij de aanwezigheid van de mutaties nagegaan werd.

5.8.1 Controlerestricties

5.8.1.1 Restricties van de ligaties met BamHI, XhoI en NcoI

De restrictie-enzymen, BamHI en XhoI, die gebruikt werden om de TRIP vector open te knippen voor ligatie met de Nef mutanten werden ook hier gebruikt. Op deze manier werden de Nef mutanten uit de TRIP vector geknipt en kon de aanwezigheid van Nef al dan niet bevestigd worden.

Reactiemengsel voor restrictie met BamHI en XhoI: 800 ng vector, 3 µl 10x NE Buffer 3 (NEB), 1 µl BamHI (NEB), 1µl XhoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.

De integriteit van de ‘backbone’ (de dragende TRIP vector) werd gecontroleerd via restrictie met het restrictie-enzym NcoI.

Reactiemengsel voor restrictie met NcoI: 800 ng vector, 3 µl 10x NE Buffer 4 (NEB), 1 µl NcoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.

Als controle werd 1 µl vector, 9 µl H20 en 2 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas) gebruikt.

5.8.1.2 Restricties van de WT TRIP vector met BamHI, XhoI en NcoI De WT TRIP vector werd gecontroleerd op mogelijke interne knipsites.

Reactiemengsel voor restrictie met BamHI en XhoI: 2 µl WT TRIP vector, 3 µl 10x NE Buffer 3 (NEB), 1 µl BamHI (NEB), 1 µl XhoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.

26 Reactiemengsel voor restrictie met NcoI: 2 µl WT TRIP vector, 3 µl 10x NE Buffer 4 (NEB), 1 µl NcoI (NEB), 0,3 µl BSA (NEB) en 5 µl 6x DNA Loading Dye (Fermentas). Dit werd aangelengd met H2O tot een totaal volume van 35 µl.

Ter controle werd 2 µl WT TRIP vector, 8 µl H20 en 2 µl 6x Loading Dye (Fermentas) gebruikt.

Deze restricties werden gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd waarna gelelektroforese (1 uur 15 min, 0,3 A, 150 V) uitgevoerd werd met een 2% 250 ml agarosegel. De ladders Gene Ruler 1 Kbp DNA Ladder en Gene Ruler 100 bp DNA Ladder van Fermentas werden hierbij gebruikt. De gels werden gevisualiseerd met behulp van UV-analyse nadat ze 40 min in het Etbr bad incubeerden.

5.8.2 PCR Sequencing

5.8.2.1 Sequencing

De sequentie van de Nef mutanten werd bepaald volgens de Sanger methode. Hierbij wordt een DNA template geamplificeerd vanaf een primer met deoxynucleotiden (dNTP) en dideoxynucleotiden (ddNTP). Doordat deze ddNTP’s een -OH groep missen op C3 wordt er na inbouw geen fosfodiëster binding gevormd met een daaropvolgend dNTP. Hierdoor ontstaan er DNA fragmenten van verschillende groottes die door middel van gelelektroforese gescheiden kunnen worden. Doordat elke ddNTP gemerkt is met een verschillend fluorochroom kunnen deze na excitatie met een laser van elkaar onderscheiden worden en kan de sequentie bepaald worden.(64;65)

Voor dit experiment werd de Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems (ABI), Perkin Elmer, Foster City, USA) gebruikt waarbij 2,5 µl primer, 12 µl DNAse vrij H20, 3,5 µl 5x Big Dye Sequencing buffer en 1 µl Ready Reaction mix bij 1 µl van elke geligeerde Nef mutant, dat dienst doet als DNA template, gevoegd werd met een eindvolume van 20µl. De bindingsplaatsen van deze primers op de DNA template worden weergegeven in FIGUUR 10. De primersequenties worden weergegeven in TABEL 1. De primers werden aangekocht bij Eurogentec, Seraing, België.

Figuur 10: Primer bindingsplaatsen. (rood) De Nef Sense primer bindt aan de start van de Nef sequentie op het Nef gen.

(groen) De F8989 Sense primer en de (geel) SEQ Rev Antisense primer binden in het midden van de DNA template. (geel) De TRIP Rev Antisense primer ten slotte bindt ter hoogte van de TRIP vector net na de Nef sequentie. De DNA template komt overeen met de Nef mutanten die in de TRIP vectoren geligeerd zijn.

27

De Eppendorf Mastercycler Gradient PCR werd zodanig ingesteld dat er een initiële denaturatie optrad gedurende 6 min bij 96°C gevolgd door 30 cycli van 10 sec bij 96°C, 5 sec bij 50°C voor de

‘annealing’ van de primers en 4 min bij 60°C waarbij het Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) de keten verlengt. Na 30 cycli werd de PCR gestopt bij 4°C.

5.8.2.2 Opzuiveren PCR producten

Aan de PCR producten (20 µl) werd 2 µl natriumacetaat 3M (NaOAc) (ABI) en 50 µl 95% ethanol (EtOH) (VWR international, Leuven, België) toegevoegd waarna 30 min gecentrifugeerd werd in de Eppendorf 5415D bij 13000 rpm. Het supernatans werd verwijderd, gevolgd door 30 sec centrifugatie bij 13000 rpm om de resterende vloeistof te verwijderen. Vervolgens werd 250 µl 7O% ethanol toegevoegd dat 5 min gecentrifugeerd werd bij 13000 rpm. Het supernatans werd verwijderd en de stalen werden gedurende 2 min gedroogd in een heating blok (Bibby Scientific Limited) bij 95°C. Ten slotte werden de stalen geresuspendeerd in 25 µl Hi-Di-formamide (ABI) waarna deze exact 2 min in de heating blok geplaatst werden (95°C). De sequencing van de stalen gebeurde met de ABI 3130 XL Sequencer. De sequenties van de Nef mutanten werden geanalyseerd met BioEdit en vergeleken met de WT sequenties, bekomen na een zoekopdracht in de Los Alamos HIV Database.

5.9 Celcultuur

5.9.1 Cellen ontdooien

De Jurkat CD4 CCR5 cellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD), de CD4⁺ CD8⁺ SupT1 cellen (AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Bethesda) en de 293 TN WT cellen werden overgebracht in 1ml koud Iscove modified Dulbecco medium (IMDM) (Invitrogen) aangelengd met 10% FCS (Foetaal Kalf Serum) en 1% L-glutamine (Invitrogen). Dit geheel wordt IMDM complete genoemd. De cellen werden 1 min op ijs geplaatst waarna ze 3 maal een volumeverdubbeling met IMDM complete ondergingen telkens gevolgd door 1 min incubatie op ijs.

Ten slotte werd het 16 ml mengsel gecentrifugeerd (5 min; 1500 rpm; 4°C) en het supernatans verwijderd. De cellen werden gemengd met 10 ml warm IMDM complete en overgebracht in een

28 celcultuur fles (FP25) (BD), die bewaard werd bij 37°C en 7% CO2. De 293 TN WT cellen ondergingen 2 maal een volumeverdubbeling met een eindvolume van 8 ml.

5.9.2 Celcultuur

De Jurkat CD4 CCR5 cellen, de 293 TN WT cellen en de SupT1 cellen werden in kweek gehouden bij 37°C en 7% CO2 in IMDM complete.

5.9.3 Cellen tellen

Er werd steeds een ½ verdunning van de cellen met Trypan Blue 4% (Invitrogen) gemaakt zodanig dat dode cellen herkend konden worden. De cellen werden vervolgens geteld met een 0,1 mm diepe Bürker telkamer (0,0025 mm²) (Blau Brand, Wertheim, Duitsland).

5.10 Transductie

Er werd zowel een retro- als een lentivirale transductie van CD4 CCR5 Jurkat cellen uitgevoerd met als doel beide gen transfer methodes te vergelijken.

5.10.1 Retrovirale transductie

Allereerst werden 50000 CD4 CCR5 Jurkat cellen aangelengd met IMDM complete tot een volume van 100 µl. Vervolgens werd 4 µl DOTAP Liposomaal Transfectie Reagent (Roche) bij 100 µl retroviraal supernatans gevoegd en gedurende 10 min geïncubeerd op kamer temperatuur. Dit mengsel werd vervolgens aan de cellen toegevoegd en gedurende 90 min gespind bij 2300 rpm en 32°C. Het geheel werd overnacht bewaard in de incubator (37°C, 7% CO2).

5.10.2 Lentivirale transductie

Er werden 50000 Jurkat CD4 CCR5 cellen in een volume van 100 µl geïsoleerd in een well. Aan deze cellen werd 0,4 µl polybreen (4 mg/ml) toegevoegd zodanig dat er na additie van de virussen een eindconcentratie van 8 µg/ml, overeenkomend met een 1/500 verdunning, bekomen werd. Vervolgens werd 100 µl lentiviraal supernatans toegevoegd. De 96-well plaat werd overnacht in de incubator (37°C; 7% CO2) geplaatst.

Ten slotte werden zowel de retro- als de lentivirale transducties de daaropvolgende dag ververst door het medium te verwijderen en 200 µl warm IMDM complete toe te voegen. Hiervoor werd de 96-well plaat eerst gespind op 1500 rpm gedurende 5 min bij 4°C. De well plaat werd daaropvolgend opnieuw geïncubeerd bij 37°C en 7% CO2.

5.10.3 Flowcytometrie

Flowcytometrie is een techniek waarmee verschillende eigenschappen van cellen nagegaan kunnen worden. Er werd gebruik gemaakt van de FACScalibur Flow Cytometer (BD) die een 488 nm Argon en een 635 nm rode diode laserstraal uitzendt langs waar de cellen waarover men informatie wenst door gestuurd worden (FIGUUR 11). Afhankelijk van de grootte en de complexiteit van de cel wordt

29 de laserstraal gedevieerd (scattering) en opgevangen door verschillende detectoren waarbij het Forward-scattered light (FSC) informatie geeft over de grootte van de cel en het Side-scattered light (SSC) informatie geeft over de interne complexiteit van de cel. Op deze manier kunnen celpopulaties van elkaar onderscheiden worden en zelfs gescheiden worden, een proces dat ‘cell sorting’ noemt. Als men de cellen merkt met fluorochromen die geëxciteerd worden door de Argon of rode diode laser kan men andere aspecten van de cel onderzoeken zoals receptor downregulatie. Als men meerdere fluorochromen gebruikt moeten deze een voldoende verschillend emissiespectrum bezitten zodat het uitgezonden licht door verschillende ‘Fluorescent Light’ detectoren (FL-1, FL-2,..) opgevangen kan worden. In dit experiment werden de fluorochromen phycoërythrine (PE) en allophycocyanine (APC) gebruikt met een piek emissie van respectievelijk 570 nm en 660 nm. De analyse van de resultaten gebeurde met de CellQuest software (BD).

Figuur 11: FACScalibur Flow Cytometer (BD). De flowcytometer bevat een Argon laser en een Rode diode laser die hun stralen uitzenden op een stroom cellen (flow cell). Informatie omtrent de grootte en complexiteit van de cellen wordt opgevangen met de detectoren FSC en SSC. Geëmiteerde lichtstralen door de fluorochromen worden opgevangen door de detectoren FL1 tot FL4. Figuur afkomstig van de BD Biosciences website².

Om de expressie van Nef in beeld te brengen werden de oppervlaktereceptoren CD4, MHC-I en CXCR4 aangekleurd met specifieke fluorochroom gemerkte antilichamen. Om de getransduceerde cellen van de niet-getransduceerde cellen te onderscheiden werden de merkers eGFP en ‘Neuron Growth Factor Receptor’ (NGFR of CD271) gevisualiseerd. Deze merkers komen niet voor op niet-getransduceerde T-cellen waardoor het onderscheid tussen beide celgroepen kan gemaakt worden.

Voor elke conditie werden 50000 lentiviraal getransduceerde cellen in een polystereen buisje (Facs tube) gebracht. Er werd 2 ml Washing Buffer bestaande uit ‘Phosphate Buffered Saline’ (PBS) (Lonza, Verviers, België), 1% ‘Bovine Serum Albumine Fraction’ (BSA) (Roche) en 0,1% natriumazide

2 http://www.bdbiosciences.com/instruments/facscalibur/features/index.jsp

30 (NaN3) (Merck, Darmstadt, Duitsland) toegevoegd en vervolgens gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 4°C en 1500 rpm. Het supernatans werd verwijderd en de antilichamen (2 µl) werden toegevoegd. De antilichamen CD4-PE (BD Pharmingen, Erembodegem, België), HLA-A,B,C-PE (BD Pharmingen), CXCR4-PE (BD Pharmingen) en CD271-APC (BD Pharmingen) werden gebruikt. De stalen werden vervolgens 30 min in een donkere ruimte bewaard waarna de overtollige kleurstof weggewassen werd met 2 ml Washing Buffer dat opnieuw verwijderd werd na centrifugatie (1500 rpm, 4°C, 5 min). Ter controle werd ook een ongekleurd staal WT Jurkat CD4 CCR5 cellen toegevoegd.

Uiteindelijk werden de gekleurde cellen geanalyseerd. Voor elke meting werd 4 µl propidium iodide (PI) (BD) toegevoegd zodanig dat de dode cellen gevisualiseerd konden worden.

5.11 Western Blotting

Western Blotting is een techniek om de expressie van specifieke eiwitten aan te tonen door middel van antilichaam kleuringen. In een eerste stap worden de cellen gelyseerd waardoor eiwitten vrijkomen.

Deze eiwitten worden gescheiden op basis van hun grootte met een Bis-Tris gel. Vervolgens worden de eiwitten ‘geblot’ en gefixeerd op een nitrocellulose of een polyvinylidene difluoride (PVDF) membraan. De eiwitten worden aangekleurd met specifieke antilichamen die via een chemiluminescente reactie gevisualiseerd kunnen worden. Aan de hand van de intensiteit en de locatie van de aangekleurde eiwitten kan informatie bekomen worden over het moleculair gewicht en de relatieve hoeveelheden.(64)

5.11.1 Aanmaak lysaat

Van zowel de retro- als de lentiviraal getransduceerde cellen werden proteïnelysaten gemaakt. De cellen werden 5 min gecentrifugeerd bij 4°C en 15000 rpm, het supernatans werd verwijderd en de cellen werden geresuspendeerd in 4 ml PBS (Lonza), gevolgd door 5 min centrifugatie bij 4°C en 15000 rpm. Na wegname van het supernatans werd er 225 µl 1x Laemmli buffer, bestaande uit 50 ml Tris-HCL buffer (pH 6,8; 0,125 M) (Merck), 10 ml glycerol (Merck), 2,3g SDS en 40 ml steriel water, toegevoegd aan de cellen. Glycerol zorgt voor een verhoogde viscositeit. SDS is een detergent dat de eiwitten een negatieve lading bezorgt en denatureert naar de primaire structuur zodat ze migreren op basis van polypeptide grootte.(64)

Gezien de hoge viscositeit van de vloeistof werd deze gedurende 10 sec gesonificeerd met het sonificatietoestel Labsonic 1510 (B. Brauer, Melsungen, Germany). Sonificatie veroorzaakt inter- en intramoleculaire breuken met als gevolg een daling van de viscositeit. Het mengsel werd ten slotte 10 min gecentrifugeerd (13000 rpm) en het supernatans werd bewaard.

31 5.11.2 Bepalen proteïne concentratie

Om de verschillende condities met elkaar te kunnen vergelijken moet er eenzelfde hoeveelheid eiwit geanalyseerd worden. De concentraties van de stalen werden bepaald met behulp van een verdunningsreeks en lichtabsorptie. Hieruit werd een standaardcurve berekend vanwaar de concentraties van de andere stalen afgeleid konden worden. In een laatste stap werden de concentraties van de verschillende stalen gelijk gemaakt door verdunning met 1x Laemmli buffer.

5.11.2.1 Verdunningen en verdunningsreeks

De aangemaakte proteïnelysaten werden eerst ½ verdund: 25 µl lysaat + 25 µl MilliQ (gefilterd en gezuiverd water) (MQ). De verdunningsreeks omvatte 8 condities bestaande uit verschillende hoeveelheden BSA (1,38 mg/ml) en MQ (TABEL 2).

Tabel 2:

5.11.2.2 Berekening concentratie aan de hand van lichtabsorptie

Aan elk staal werd 250 µl reagens A’ (Bio-Rad) bestaande uit 20 µl DC reagens S (Bio-Rad) en 1 ml Reagens A (Bio-Rad) toegevoegd. Verder werd er aan elk staal 2 ml DC reagens B (Bio-Rad) toegevoegd, gevolgd door 15 min incubatie. Uiteindelijk werden de absorbanties gemeten bij 750 nm met de spectrofometer DU 640B (Beckman Coulter, Brea, USA) (TABEL 3). Aan de hand van deze resultaten werd een standaardcurve opgesteld (FIGUUR 12). De vergelijking van deze standaardcurve werd vervolgens gebruikt om de concentraties van de proteïnelysaten te berekenen (TABEL 4).

Volgende formule werd hiervoor gebruikt: (Absorbantie + 0,019)/0,372.

Tabel 3:

32

Figuur 12: Grafiek verdunningsreeks. Met de resultaten uit tabel 2 werd bovenstaande figuur met vergelijking y=0,372x-0,019 aangemaakt in Excel. Aan de hand van deze grafiek konden de concentraties van de verschillende stalen berekend concentratie bevatte. Dit werd berekend met de formule V2=V1xC1/C2 waarbij het gewenste eindvolume 22,5 µl (V1), de gewenste concentratie 0,368 mg/ml (C1) en de berekende concentraties (C2) gebruikt werden. De hoeveelheid Laemmli buffer die moest worden toegevoegd werd berekend

Figuur 12: Grafiek verdunningsreeks. Met de resultaten uit tabel 2 werd bovenstaande figuur met vergelijking y=0,372x-0,019 aangemaakt in Excel. Aan de hand van deze grafiek konden de concentraties van de verschillende stalen berekend concentratie bevatte. Dit werd berekend met de formule V2=V1xC1/C2 waarbij het gewenste eindvolume 22,5 µl (V1), de gewenste concentratie 0,368 mg/ml (C1) en de berekende concentraties (C2) gebruikt werden. De hoeveelheid Laemmli buffer die moest worden toegevoegd werd berekend

In document Aanmaak en optimalisatie van lentivirale constructen voor expressie van HIV Nef mutanten in cellijnen en dendritische cellen (pagina 29-0)