• No results found


Preparation of saliva and toothpaste slurry 

Human  whole  saliva  from  20  volunteers  of  both  genders  was  collected  into  ice‐

cooled  beakers  after  stimulation  by  chewing  Parafilm®  and  then  pooled,  centrifuged,  dialyzed,  and  lyophilized  for  storage.  Prior  to  lyophilization,  phenylmethylsulfonylfluoride  was  added  to  a  final  concentration  of  1  mM  as  a  protease  inhibitor  in  order  to  reduce  protein  breakdown  and  preserve  high‐

molecular  weight  mucins.  Note  that  recently  it  has  been  shown  that  freeze‐

thawing does not alter a saliva which has been stored at ‐80ºC for a period of 6  months [24]. For experiments, lyophilized saliva was reconstituted at 1.5 mg ml‐1  in buffer (50 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate, 1 mM calcium  chloride,  pH  6.8).  Thus  reconstituted  saliva  will  be  referred  to  as  “saliva”. 

Volunteers  gave  their  consent  to  saliva  donation,  in  agreement  with  the  Ethics  Committee at UMCG (approval no. M09.069162). 


Toothpastes used were selected on the basis of the absence or presence of SnF2  and NaF,  in  combination  with  either  SLS or NaHMP  as  a detergent  and  included  Crest  regular®  (NaF‐SLS),  Crest  vivid  white  night®  (NaF‐NaHMP),  Crest  gum  care®  (SnF2‐SLS) and Crest pro health® (SnF2‐NaHMP). Note that all pastes are aqueous  formulations  with  the  exception  of  Crest  pro  health®  which  is  a  non‐aqueous  formulation.  All  toothpastes  were  manufactured  by  Proctor  and  Gamble 

(Cincinnati‐USA)  and  obtained  commercially.  Throughout  this  study,  25%  w/v  toothpaste  slurries  in  buffer  were  used,  prepared  after  removal  of  abrasive  particles by centrifugation at 5000g, 10oC.  


Formation of adsorbed salivary protein films and QCM‐D 

The  kinetics  of  salivary  protein  adsorption  was  studied  using  a  QCM‐D  device,  model Q‐sense E4 (Q‐sense, Gothenburg, Sweden). Gold (Au) plated AT‐cut quartz  crystals  and  hydroxyapatite  (HAP)  coated  crystals,  with  a  sensitivity  constant  of  17.7  ng  cm‐2  for  a  5  MHz  sensor  crystal,  were  used  as  substratum.  Before  each  experiment,  the  Au  crystals  were  cleaned  by  10  min  UV/ozone  treatment,  followed by immersion into a 3:1:1 mixture of ultrapure water, NH3 and H2O2 at  70°C  for  10  min,  drying  with  N2  and  another  UV/ozone  treatment.  HAP  coated  crystals were rinsed in ethanol (100%) for 15 min, followed by drying with N2 and  an UV/ozone treatment. The QCM‐D flow chamber is disc shaped with a volume  of approximately 40 l and a diameter of 11.1 mm with the inlet and outlet facing  the  crystal  surface.  At  the  start  of  each  experiment,  the  crystal  sensor  was  incubated  in  adhesion  buffer  under  flow.  When  stable  base  lines  for  both  oscillating frequency, f and dissipation, D were achieved, saliva was introduced in  the  system  by  perfusion  from  the  inlet  to  the  outlet  reservoir  by  a  peristaltic  pump  (Ismatec  SA,  Glattbrugg,  Switzerland),  without  recirculation.  Experiments  were conducted at 20°C for 2 h at a flow rate of 50 l min‐1, corresponding with a  shear rate of approximately 3 s‐1. After primary film formation, a toothpaste slurry  or  buffer  control  was  passed  through  the  chamber  for  2  min  to  form  a  paste‐

treated  or  untreated  film,  followed  by  another  2  h  of  salivary  flow  to  form  a  secondary  adsorbed  film.  After  each  step,  the  chamber  was  treated  with  buffer  for  15  min  to  remove  un‐adsorbed  salivary  proteins  or  toothpaste  components. 

The  four  chambers  available  in  the  E4  unit  were  simultaneously  used  in  parallel 

Salivary film structure 


for  primary  salivary  protein  film  formation  and  subsequently,  salivary  protein  films on the different Au crystals were treated with different toothpaste slurries. 

HAP coated  crystals were included in some experiments to investigate a possible  influence of the substrate material on the primary salivary protein film structure. 

Data were acquired using QSoft 401 2.0.1. 


Voigt model fitting 

A Voigt model containing a  spring and dash‐pot was  fitted to the  frequency  (∆f)  and dissipation (∆D) shifts using Q‐Tools 3.0.6, in order to calculate the adsorbed  salivary protein film thickness,  its shear modulus (G) and viscosity (η). The Voigt  model parameters were derived from the response of the adsorbed film, in terms  of  frequency  (∆f)  and  dissipation  (∆D)  shifts  due  to  the  deformation  induced  by  the  oscillatory  shear  motion  of  the  sensor  surface,  in  a  similar  fashion  as  the  modulus  of  elasticity  is  derived  by  dividing  the  stress  response  to  an  induced  strain.  The  shear  modulus  (G)  and  viscosity  (η)  were  then  converted  into  a  characteristic  film  frequency  using  equation  1.  Note  that,  the  frequency  shift  is  the  change  in  frequency  of  the  crystal  due  to  adsorbed  salivary  protein  film,  whereas  the  characteristic  film  frequency  (fc  =  G/)  purely  quantifies  the  visco‐

elasticity  of  the  adsorbed  salivary  protein  film.  Fluid  viscosities  used  in  the  modeling  were  1.15  mPa  s  for  saliva,  2  mPa  s  for  NaF‐SLS,  SnF2‐SLS  and  SnF2‐ NaHMP and 3mPa s for NaF‐NaHMP containing toothpaste slurries, as measured  using  a  viscometer  (Brookfield  DV‐II+Pro‐USA),  at  50  rpm  and  20°C.  Saliva  and  toothpaste slurry densities were always assumed to be 1000 kg m‐3. During buffer  flow,  the  viscosity  and  density  of  water  were  employed,  i.e.  1  mPa  s  and        1000 kg m‐3, respectively. All overtones (3, 5, 7, 9, 11 and 13) were used for fitting  and  determining  the  hydrated  thickness  and  characteristic  frequency  of  the  adsorbed protein films.  

X‐ray photoelectron spectroscopy 

Chemical  compositions  and  dehydrated  layer  thicknesses  (nm)  of  the  adsorbed  salivary  protein  films  on  bovine  enamel  were  evaluated  using  XPS  (S‐Probe  spectrometer;  Surface  Science  Instruments,  Mountain  View,  CA,  USA),  while  Au  and  HAP  coated  crystals  were  included  in  some  experiments  to  investigate  a  possible  influence  of  the  substrate  material  on  the  primary  salivary  protein  film  composition and dehydrated thickness. Bovine enamel samples were prepared by  grinding  the  surface  with  abrasive  paper  (800  and  1200  grit  size),  and  polishing  with Al2O3 powder (particle diameter of 0.05 µm) in demineralized water. Crystals  with  primary  adsorbed  salivary  protein  films  were  removed  from  the  QCM  chamber,  and  immediately  subjected  to  XPS  measurements.  Adsorbed  salivary  protein films were formed on enamel surfaces and treated as described above for  QCM‐D.  


XPS  was  conducted  at  a  photoelectron  collection  angle  of  55  degrees with  the  sample  and  an  electron  flood  gun  setting  of  10  eV.  Elemental  surface  concentrations were calculated from overall scans in the binding energy range of  1‐1100 eV with a 1000 x 250 µm spot and pass energy of 150 eV accounting for  instrumental  sensitivity  factors.  The  dehydrated  layer  thickness  was  calculated  from an overlayer model, based on attenuation of the Ca2p electron count arising  from  the  enamel  surface  with  respect  to  N1s  electron  count  from  the  overlaying  adsorbed salivary protein film [25]. 


Statistical analysis 

Thicknesses  and  characteristic  film  frequencies  obtained  after  treatment  of  a  primary  film  and  after  secondary  film  formation  were  compared  with  those  of 

Salivary film structure 


primary films using a two tailed Student t‐test. p < 0.05 was taken as statistically  significant. All the experiments described were performed in triplicate. 



The QCM‐D output ratio ΔD/Δf was greater than 10‐7 in all experiments indicating  that the films studied were highly dissipative and supporting the application of the  Voigt  model.  Frequency  shift  and  dissipation  changes  after  2  h  primary  salivary  protein  adsorption  on  Au  coated  crystals  yielded  a  hydrated  film  thickness  and  characteristic  film  frequency  of  43.5  ±  0.1  nm  and  9.4  ±  0.1  MHz  with  no  significant  effects  of  treatment  with  a  buffer  (i.e.  untreated  films)  or  secondary  film formation, as shown in Figure 1 (left panel).  


Note  that  the  use  of  an  HAP  coated  crystal  yielded  a  similar  hydrated  thickness  (38.0  ±  5.0  nm)  and  characteristic  frequency  (7.0  ±  2.0  MHz)  for  the  primary  adsorbed protein film as did the use of a Au coated crystal (see Fig. 2). Treatment  with a NaF‐NaHMP toothpaste slurry caused a decrease in film thickness to 20.0  nm with respect to untreated films (see for an example Fig. 1, right panel), with a  minor  effect  on  characteristic  film  frequency  (7.5  MHz  after  treatment). 

Secondary adsorption of salivary proteins restored the hydrated film thickness to  41.0 nm and increased its characteristic frequency to 11.0 MHz.  

           Figure 1  Examples of the adsorption kinetics of salivary proteins over a period of  340 min, including primary film formation, untreated (left panel) or treated with  toothpaste  slurry  containing  NaF‐NaHMP  (right  panel)  and  secondary  film  formation.  

A and B: Frequencies and dissipation changes,  C and D: Changes in hydrated thickness,  E and F: Changes in characteristic frequency. 

Salivary film structure 

Figure  2  Thickness of  hydrated, adsorbed salivary  protein  films  on a gold  crystal  (Au)  and  a  hydroxyapatite  coated  crystal  (HAP)  and  on  gold  crystals  with  a  adsorbed salivary protein film after treatment with a toothpaste slurry, as well as  after  secondary  exposure  to  saliva  (top),  and  accompanying  changes  in  characteristic  frequencies  (bottom).  The  error  bars  indicate  the  standard  deviations  over  triplicate  measurements.  Statistically  significant  differences  (p<0.05) of treated and secondary films with respect to the properties of primary  films  are  indicated  by  (*),  while  significant  differences  of  secondary  films  with  respect to treated films are indicated by (#).  


Treatment  of  primary  adsorbed  films  with  toothpaste  slurries  on  Au  coated  crystals decreased the hydrated film thickness and this decrease was largest after 

Primary film Paste treated film Secondary film Characteristic Frequency (MHz)

* SnF2-NaHMP


Primary film Paste treated film Secondary film Characteristic Frequency (MHz)

* SnF2-NaHMP


NaF‐NaHMP and SnF2‐SLS containing slurries (thicknesses equal to 16.0 ± 3.8 and  21.2 ± 1.8 nm, respectively; Fig. 2). Secondary adsorption restored these hydrated  film  thicknesses  only  partially,  whereas  after  secondary  film  formation  following  treatment with SnF2‐NaHMP, a high secondary film thickness (48.1 ± 1.9 nm; Fig. 

2) exceeding the one of the primary film, was obtained. Treatment with a SnF2‐SLS  containing  toothpaste  slurry  immediately  increased  the  characteristic  film  frequency  to  25.4  ±  7.8  MHz,  but  none  of  the  other  toothpaste  slurries  significantly  altered  the  characteristic  film  frequency.  Secondary  salivary  protein  adsorption  on  primary  films  treated  with  SnF2‐SLS  or  SnF2–NaHMP  containing  slurries yielded a significant increase in the characteristic frequency to 61.6 ± 1.1  and 67.1 ± 0.7 MHz, respectively (Fig. 2).  


Carbon was the main element detected by XPS regardless of substrate material or  treatment. Calcium was detected as the major component of the enamel and HAP  surfaces,  while  nitrogen  was  indicative  of  adsorbed  protein  films  (Table  1).  XPS  analyses  clearly  indicated  incorporation  of  stannous  in  treated  primary  and  secondary  salivary  protein  films,  while  sodium  was  only  retained  immediately  after  treatment,  but  never  found  in  secondary  films.  Variations  in  the  observed %Ca and %N, yielded the dehydrated film thickness which amounted 2.4  nm for untreated primary adsorbed salivary protein films on enamel surfaces and  decreased strongest after exposure to a NaF‐NaHMP containing formulation (0.9  nm). Note, that the dehydrated thicknesses of adsorbed primary salivary protein  films on Au and HAP coated crystals, calculated on the basis of the attenuation of  the Au4f and Ca2p electron counts with respect to N1s electron counts (2.1 and 2.7  nm, respectively), were comparable to the dehydrated film thickness on enamel. 

In  general,  secondary  film  formation  restored  the  dehydrated  thickness  of  the  adsorbed salivary protein film to much of its original values.  

Salivary film structure 



Figure  3  Relation  between  hydrated  (derived  from  QCM‐D  on  gold  crystals)  and  dehydrated  (derived  from  XPS  on  enamel)  thickness  of  salivary  protein  films,  immediately  after  treatment  with  different  toothpaste  slurries  (closed  symbols)  and  after  secondary  film  formation  (open  symbols).  Hydrated  and  dehydrated  thicknesses  of  the  adsorbed  primary  salivary  protein  films  on  gold  (Au)  and  hydroxyapatite (HAP) coated crystals are included for comparison. 





56.6  66.9   66.1      62.3  52.0  60.4 


53.1  59.9  59.3  44.5  60.2 




26.7  22.3  23.9  25.4  28.7  23.7 


28.2  25.1  27.0  34.2  27.2 


Salivary film structure 


QCM‐D  and  XPS  have  been  used  to  study  influences  of  different  fluoride‐

detergent  combinations  on  the  thickness  (hydrated  and  dehydrated)  and  visco‐

elastic  properties  of  adsorbed  salivary  protein  films.  Both  techniques  show  that  the underlying substrate material, i.e. enamel, HAP or Au, has little influence on  the  thickness  and  visco‐elastic  properties  of  primary  adsorbed  salivary  protein  films,  which  is  supported  by  a  comparative  QCM‐D  study  using  HAP  and  silica  substrates  [26].  Hence,  in  the  remainder  of  this  discussion,  we  will  assume  that  the  substrate  material  does  not  affect  the  conclusions  regarding  thickness  and  visco‐elastic  properties  of  the  adsorbed  salivary  protein  films.  Hydrated  film  thickness  decreased  depending  on  the  fluoride‐detergent  combination  applied,  but secondary film formation on treated films restored the film thickness to much  of  its  original  thickness.  This  restoration  in  film  thickness  was  also  seen  in  dehydrated  conditions,  as  obtained  by  XPS  although  there  was  no  direct  correspondence  between  hydrated  and  dehydrated  film  thicknesses,  as  can  be  seen  in  Figure  3.  Characteristic  frequencies  of  the  films  increased  immediately  after  treatment  with  a  SnF2‐SLS  containing  slurry  from  an  aqueous  formulation  due to an increase in the shear modulus, indicating cross‐linking in the film. When  SnFwas combined with NaHMP as a detergent in a non‐aqueous formulation, no  immediate  increase  in  characteristic  frequency  was  observed.  However,  secondary film formation on primary salivary protein films treated with SnF2 had  consistently  higher  characteristic  frequencies,  regardless  of  whether  applied  in  combination with SLS or NaHMP.  


Dehydrated film thicknesses decreased upon treatment of films, depending on the  toothpaste  slurry  applied  and  were  much  smaller  than  measured  in  a  hydrated  state  as  shown  in  Figure  3.  Difference  between  hydrated  and  dehydrated 

thicknesses  were  also  observed  by  Macakova  et  al.  [17]  using  QCM  and  surface  plasmon resonance, although their thicknesses were much smaller than measured  in the current study, likely because no protease inhibitor was reportedly added to  their saliva, which generally yields breakdown of high molecular weight proteins  at room temperature within 20 min. However, Figure 3 does indicate a pattern of  increasing  thickness  in  hydrated  and  dehydrated  state  of  secondary  salivary  protein film. The lack of a unique relationship between hydrated and dehydrated  thickness suggests structural differences between adsorbed salivary protein films  after  exposure  to  different  chemical  formulations  as  reflected  by  the  observed  differences  in  characteristic  frequencies  as  well.  HMP  from  an  aqueous  formulation  (NaF‐NaHMP  combination)  yielded  the  largest  reduction  in  film  thickness  (both  hydrated  and  dehydrated  ones).  In  a  non‐aqueous  formulation  (SnF2‐NaHMP  combination)  however,  HMP  causes  a  smaller  reduction  in  film  thickness probably because its availability in ionized form is not immediate, as it is  in an aqueous formulation. 


The  immediate  stiffening  of  the  paste  treated  film  after  application  of  SnF2‐SLS  must be attributed to cross‐linking of adsorbed proteins by divalent Sn2+‐cations. 

Monovalent  Na+‐cations  are  not  able  to  cross‐link,  explaining  the  absence  of  stiffening  after  NaF‐detergent  combinations.  The  cross‐linking  by  Sn 2+‐cations  is  confirmed by the stiffening of secondary films formed after treatment with both  SnF2‐SLS  and  SnF2‐NaHMP  combinations,  since  intermediate  buffer  rinsing  will  further  increase  ionization  of  stannous  after  treatment  with  the  non‐aqueous  SnF2‐NaHMP  combination.  Thus  Sn2+‐cations  becoming  slowly  available  may  diffuse from the treated primary film and cross‐link the adsorbed proteins in the  secondary  film  to  increase  its  characteristic  frequency.  XPS  indeed  not  only  indicated stannous in treated primary films but also in secondary films, as shown 

Salivary film structure 


in Table 1. Also detachment of adhering oral bacteria from salivary protein films  induced by exposure to a non‐aqueous SnF2‐NaHMP toothpaste slurry continued  for  much  longer  time  intervals  than  the  actual  slurry  exposure  time  indicating  a  slower  release  [27]  ,  whereas  detachment  stimulated  by  SLS  containing  slurries  was confined to the duration of exposure. This attests to the fact that both SnF2  and NaHMP can be absorbed in salivary protein films, and slowly ionize to exert  their cross‐linking and detergent actions. Cross‐linking of the salivary protein films  will  decrease  their  porosity  and  therewith  their  ion‐permeability  [7],  which  may  reduce enamel demineralization and explain the role of SnF2 in erosion protection,  as observed by Wiegand et al [15].  


In summary, the influence of fluoride‐detergent combination on the thickness and  characteristic frequency of salivary protein films is dependent on the aqueous or  non‐aqueous  paste  formulation.  SnF2  in  a  non‐aqueous  formulation  has  a  prolonged cross‐linking action compared with the immediate cross‐linking action  by SnF2 in an aqueous formulation. Strong detergent effects of NaHMP could only  be observed in the aqueous formulation.  



This  study  was  funded  by  the  UMCG,  Groningen,  The  Netherlands.  Purchase  of  QCM‐D  apparatus  was  made  possible  by  grant  no.  91107008  from  ZonMW,  The  Netherlands. The authors thank Brandon Peterson for helpful discussions. 


1.   Lendenmann U, Grogan JJ, Oppenheim FG (2000) Saliva and dental pellicle‐a  review. Adv Dent Res 14:22‐28. 

2.   Schipper  RG,  Silletti  E,  Vinyerhoeds  MH  (2007)  Saliva  as  research  material: 

Biochemical,  physicochemical  and  practical  aspects.  Arch  Oral  Bio.  52:1114‐


3.   Van nieuw AA, Bolscher  JG, Veerman EC  (2004)  Salivary proteins: protective  and diagnostic value in cariology? Caries Res 38:247‐253. 

4.   Hannig M, Herzog S, Willigeroth SF, Zimehl R (2001) Atomic force microscopy  study of salivary pellicles formed on enamel and glass in vivo. Colloid Polymer  Sci 279:479‐483. 

5.   Bongaerts  JHH,  Rossetti  D,  Stokes  JR  (2007)  The  lubricating  properties  of  human whole saliva. Tribology Lett. 27:277‐287. 

6.   Berg ICH, Rutland MW, Arnebrant T (2003) Lubricating properties of the initial  salivary pellicle ‐ an AFM Study. Biofouling  19:365‐369. 

7.   Hannig  M, Hess NJ, Hoth‐hannig W, De Vrese  M (2003) Influence of salivary  pellicle formation time on enamel demineralization‐an in situ pilot study. Clin  Oral Investig 7:158‐161. 

8.   Wetton  S,  Hughes  J,  West  N,  Addy  M  (2006)  Exposure  time  of  enamel  and  dentine  to  saliva  for  protection  against  erosion:  A  study  in  vitro.  Caries  Res  40:213‐217. 

9.   Joiner  A,  Schwarz  A,  Philpotts  CJ,  Cox  TF,  Huber  K,  Hannig  M  (2008)  The  protective  nature  of  pellicle  towards  toothpaste  abrasion  on  enamel  and  dentine. J Dent 36:360‐368. 

10.  Van  der  Mei  HC,  White  DJ,  Kamminga‐rasker  HJ,  Knight  J,  Baig  AA,  Smit  J  (2002) Influence of dentifrices and dietary components in saliva on wettability  of pellicle‐coated enamel in vitro and in vivo. Eur J Oral Sc 110:434‐438. 

Salivary film structure 


11.  Duckworth RM (2006) The Teeth and Their Environment, Karger 19:29‐64  12.  Van  der  Mei  HC,  Engels  E,  De  Vries  J,  Busscher  HJ  (2008)  Effects  of  amine 

fluoride on biofilm growth and salivary pellicles. Caries Res 42:19‐27. 

13.  Busscher  HJ,  White  DJ,  Van  Der  Mei  HC,  Baig  AA,  Kozak  KM  (2002)  Hexametaphosphate  effects  on  tooth  surface  conditioning  film  chemistry‐in  vitro and in vivo studies. J Clin Dent 13:38‐43. 

14.  Vassilakos N, Arnebrant T, Glantz PO (1993) An in vitro study of salivary film  formation at solid‐liquid interfaces. Scand J Dent Res 101:133‐137. 

15.  Wiegand A, Bichsel D, Magalhaes AC, Becker K, Attin T (2009) Effect of sodium,  amine and stannous fluoride at the same concentration and different pH on  in vitro erosion. J Dent 37:591‐595. 

16.  Terezhalmy G, Chaves E,  Bsoul S, Baker R, He  T  (2007) Clinical evaluation of  the  stain  removal  efficacy  of  a  novel  stannous  fluoride  and  sodium  hexametaphosphate dentifrice. Am J Dent 20:53‐58. 

17.  Macakova  L,  Yakubov  GE,  Plunkett  MA,  Stokes  JR  (2010)  Influence  of  ionic  strength changes on the structure of pre‐adsorbed salivary films. A response  of a natural multi‐component layer. Colloids Surf B 77:31‐39. 

18.  Scheideler  L,  Rupp  F,  Wendel  HP,  Sathe  S,  Geis‐Gerstorfer  J  (2007)  Photocoupling  of  fibronectin  to  titanium  surfaces  influences  keratinocyte  adhesion, pellicle formation and thrombogenicity. Dent Mater 23:469‐478. 

19.  Voinova  MV,  Rodahl  M,  Jonson  M,  Kasemo  B  (1999)  Viscoelastic  acoustic  response  of  layered  polymer  films  at  fluid‐solid  interfaces:  Continuum  mechanics approach. Physica Scripta 59:391‐396. 

20.  Hook F, Kasemo  B,  Nylander  T,  Fant  C,  Sott K,  Elwing  H (2001)  Variations  in  coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp‐1 protein  film  during  adsorption  and  cross‐linking:  A  quartz  crystal  microbalance  with 

dissipation  monitoring,  ellipsometry,  and  surface  plasmon  resonance  study. 

Anal Chem 73:5796‐57804. 

21.  Liu  GM,  Zhang  GZ  (2008)  Periodic  swelling  and  collapse  of  polyelectrolyte  brushes driven by chemical oscillation. J Phys Chem B 112:10137‐10141. 

22.  Richert  L,  Boulmedais  F,  Lavalle  P,  Mutterer  J,  Ferreux  E,  Decher  G  (2004)  Improvement  of  stability  and  cell  adhesion  properties  of  polyelectrolyte  multilayer films by chemical cross‐linking. Biomacromolecules 5:284‐294. 

23.  Lubarsky  GV,  Davidson  MR,  Bradley  RH  (2007)  Hydration‐dehydration  of  adsorbed  protein  films  studied  by  AFM  and  QCM‐D.  Biosens  Bioelectron  22:1275‐1281. 

24.  Schipper  R,  Loof  A,  De  Groot  J,  Harthoorn  L,  Dransfield  E,  Van  Heerde  W  (2007)  SELDI‐TOF‐MS  of  saliva:  Methodology  and  pre‐treatment  effects.  J  Chromatogr B: Anal Technol Biomed Life Sci 847:45‐53. 

25.  Andrade  JD  (1985)  Surface  and  Interfacial  Aspects  of  Biomedical  Polymers. 

Plenum Press,105.  

26.    Santos  O,  Lindh  L,  Halthur  T,  Arnebrant  T  (2010)  Adsorption  from  saliva  to  silica  and  hydroxyapatite  surfaces  and  elution  of  salivary  films  by  SDS  and  Delmopinol. Biofouling 26:697‐710. 

27.  Busscher  HJ,  White  DJ,  ATema‐Smit  J,  Van  Der  Mei  HC  (2007)  Efficacy  and  mechanisms of non‐antibacterial, chemical plaque control by dentifrices ‐ An  in vitro study. J Dent 35:294‐301. 


Chapter 3 

Role of structure and glycosylation of adsorbed protein films in