• No results found

Stannous fluoride increases the protection offered by salivary  conditioning films against erosion


Chapter 6 



Salivary conditioning films (SCF) play an important role in protecting the enamel  surface  against  abrasion  and  erosion  by  providing  better  lubrication  and  the  formation of a barrier against diffusion of acidic components of beverages toward  and  of  Ca2+  and  PO43‐  ions  out  of  the  enamel  surface.  However,  the  physical  mechanism  behind  this  dual  protection  offered  by  SCFs  is  not  well  understood. 

Here,  we  use  a  SnF2  containing  mouthrinse  to  demonstrate  the  importance  of  structural  and  glycosylation  changes  in  SCFs,  as  induced  by  Sn2+  ions  in  the  protection  of  enamel  surfaces  against  erosion  and  abrasion.  Quartz  crystal  microbalance  with  dissipation  monitoring  (QCM‐D)  showed  that  SCFs  became  rigid  after  exposure  to  a  SnF2  containing  mouthrinse,  which  we  attributed  to  cross‐linking  of  adsorbed  proteins  by  Sn2+  ions.  During  renewed  exposure  to  saliva,  the  SnFtreated  SCF  recruited  more  salivary  proteins,  thereby  increasing  the  adsorbed  mass  and  degree  of  glycosylation  in  the  SCF,  as  determined  from  QCM‐D  and  X‐ray  photoelectron  spectroscopy,  respectively.  The  renewed  adsorbed film on a SnFtreated SCF provided a lower friction than when formed  on  an  untreated  SCF.  Moreover,  such  rigid,  more  heavily  glycosylated  and  lubricious  SCFs  yielded  a  lower  calcium  loss  during  exposure  to  a  citric  acid  solution  than  untreated  SCFs.  Therewith,  this  is  the  first  study  to  demonstrate  physical changes in SCFs due to Sn2+ adsorption that can be related to the control  of erosion and abrasion of enamel surfaces in vitro. 



Salivary  conditioning  films  (SCF)  cover  all  oral  surfaces  and  have  been  shown  to  reduce  enamel  abrasion  [1]  through  lubrication  as  well  as  to  prevent  enamel  erosion  by  acting  as  a  diffusion  barrier  for  acids  from  beverages  toward  and  of   Ca2+ and PO43‐ ions out of enamel surface [2, 3]. Glycosylated mucins in adsorbed  SCFs play an important role in preventing erosion [4] and are known to improve  lubrication [5, 6] This is supported by observations that xerostomic patients suffer  from  a  lower  secretion  of  mucins  and  have  an  increased  probability  of  enamel  demineralisation [7] .  


In  preventive  dentistry,  scientific  efforts  to  prevent  enamel  erosion  focus  on  identifying  optimal  fluoride  formulations.  Common  formulations  used  in  caries  prevention are based on sodium fluoride, but these have only limited effects on  erosion  [8‐10].  In  contrast,  solutions  of  stannous  fluoride  (SnF2),  titaniumtetrafluoride  (TiF4)  and  hydrofluoric  acid  (HF)  have  been  shown  to  be  effective  in  preventing  erosion  as  determined  in  vitro  and  in  situ  [11,  12].  

Moreover,  SnF2  has  been  described  as  the  “most  promising  erosion  protective  agent” on the market [13].  


The physical  changes in SCFs  after treatment with SnF2 solutions responsible for  the  protective  nature  of  SCF  against  erosion  and  abrasion  are  largely  unknown,  although glycosylation and structure of SCFs can be chemically (e.g. by toothpaste  and  mouthrinse  components)  [14]  and mechanically (e.g.  by toothbrushing)  [15] 

perturbed. Therefore, the aim of this study was to demonstrate the importance of  structural  and  glycosylation  changes  in  SCFs,  as  induced  by  Sn2+  ions  in  the  protection of enamel surfaces against erosion and abrasion.  


Chapter 6 


MATERIALS AND METHODS  Saliva collection  

Human whole saliva from 20 volunteers (10 male and 10 female) of both genders  was collected into ice‐cooled beakers after stimulation by chewing Parafilm® and  then  pooled,  centrifuged,  dialyzed,  and  lyophilized  for  storage.  Prior  to  lyophilization, phenylmethylsulfonylfluoride was added to a final concentration of  1 mM as a protease inhibitor in order to reduce protein breakdown and preserve  high‐molecular weight mucins. Note that recently it has been shown that freeze‐

thawing  does  not  alter  saliva  which  has  been  stored  at  ‐20oC  and  ‐80oC  for  a  period of 6 months [16]. For experiments, lyophilized saliva was reconstituted at  1.5 mg ml‐1 in buffer (50 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate, 1  mM  calcium  chloride,  pH  6.8).  This  reconstituted  human  whole  saliva  will  be  referred to as “saliva”. Volunteers gave their informed consent to saliva donation,  in agreement with the guidelines set out by the Medical Ethical Committee at the  University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands.   


Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring 

Kinetics  of  adsorption  of  salivary  proteins  and  structural  softness  of  adsorbed  SCFs  were  determined  using  a  QCM‐D  device,  model  Q‐sense  E4  (Q‐sense,  Gothenburg,  Sweden).  Gold  (Au)  plated  AT‐cut  quartz  crystals  with  a  sensitivity  constant of 17.7 ng cm‐2 for a 5 MHz sensor crystal, were used as substrata. The  Au‐plated crystals were cleaned 2 h prior to use by 10 min UV/ozone treatment,  followed by immersion into a 3:1:1 mixture of ultrapure water, NH3 and H2O2 at  70°C  for  10  min,  drying  with  N2  and  another  UV/ozone  treatment.  The  QCM‐D  chamber is disc‐shaped with a volume of approximately 40 l and a diameter of  11.1 mm with the inlet and outlet facing the crystal surface. The chamber was first  perfused with buffer by a peristaltic pump (Ismatec SA, Glattbrugg, Switzerland). 

When stable base lines for both frequency ∆f and dissipation ∆D were achieved,  saliva was introduced. Experiments were conducted at 20°C, at a flow rate of 50 

l  min‐1,  corresponding  with  a  shear  rate  of  3  s‐1.  Saliva  was  flown  through  the  QCM‐D chamber for 2 h to form a SCF, followed by 2 min exposure to buffer or   0.63% w/v of SnF2 containing mouthrinse (3M ESPE, Dental Products, Minnesota,  USA)  and  renewed  flow  of  saliva  was  initiated  for  2  h.  After  each  step,  a  buffer  rinse was applied for 10 min. The structural softness of the SCF was determined  by  their  ∆D3/∆f3  ratio  recorded  in  QCM‐D.  Higher  changes  in  ∆f3  toward  more  negative values were interpreted to indicate an increase in hydrated mass of the  SCF, while a higher ∆D3/∆f3 ratio indicated an increase in structural softness. 


Atomic force microscopy 

Friction  force,  surface  topography  and  repulsive  force  toward  a  colloidal  probe  AFM  [17]  were  measured  in  presence  of  buffer  with  an  AFM  (Nanoscope  IV  Dimensiontm  3100)  equipped  with  a  Dimension  Hybrid  XYZ  SPM  scanner  head  (Veeco, New York, USA) on the different adsorbed SCFs. To this end, rectangular,  tipless  cantilevers  (length  (l),  width  (w)  and  thickness  (t)  of  300,  35  and  1  μm,  respectively) with a stiffness of 0.05 N m‐1 were calibrated for their exact torsional  and normal stiffness using AFM Tune  IT v2.5 software [18]. The normal  stiffness  (Kn) was in the range of 0.01 to 0.04 N m‐1, while the torsional stiffness (Kt) was in  the range of 2 to 4 x 10‐9 N‐m rad‐1.  


Subsequently,  a  silica  particle  of  4.74  μm  diameter  (d)  (Bangs  laboratories,  Fishers,  IN,  USA)  was  glued  to  a  cantilever  with  an  epoxy  glue  (Pattex,  Brussels,  Belgium)  using  a  micromanipulator (Narishige  group,  Tokyo,  Japan)  to  prepare  a  colloidal probe. The deflection sensitivity (α) of the colloidal probe was recorded 

Chapter 6 


at  a  constant  compliance  with  bare  Au‐plated  crystal  in  buffer  to  calculate  the  applied normal force (Fn) using 


where  ∆Vn  is  the  voltage  output  from  the  AFM  photodiode  due  to  normal  deflection  of  the  colloidal  probe.  The  torsional  stiffness  and  geometrical  parameters of the colloidal probe were used to calculate the friction force (Ff) [18,  19]  according to   

   the  AFM  and  ΔVL  corresponds  to  the  voltage  output  from  the  AFM  photodiode  due to lateral deflection of the colloidal probe. Lateral deflection was observed at  a  scanning  angle  of  90  degrees over  a  scan  area  of  5 x  5  µm2 and at  a  scanning  frequency of 1 Hz. The scanning angle, distance and frequency were kept constant  throughout all friction force measurements.  

The  colloidal  probe  was  incrementally  loaded  and  unloaded  up  to  a  maximal  normal  force  of  32  nN  in  buffer.  At  each  normal  force,  10  friction  loops  were  recorded to yield the average friction force.  

Repulsive  force‐distance  curves  measured  in  the  contact  mode  between  a  colloidal probe and the films were obtained at a threshold force of 5 nN and at an  approach and retraction velocity of 10 µm s‐1. All surface topography imaging by 

colloidal probe was performed at 5 nN normal force, and the surface height was  calculated from these surface topography images.  


X‐ray photoelectron spectroscopy 

The  degree  of  glycosylation  of  the  adsorbed  salivary  films  was  determined  by  using XPS (S‐probe, Surface Science Instruments, Mountain View, CA, USA). Films  adsorbed  on  Au‐plated  quartz  crystals  as  removed  from  the  QCM‐D  chamber,  were  dried  in  the  pre‐vacuum  chamber  of  the  XPS,  and  then  subjected  to  a  vacuum of 10‐7 Pa. X‐rays (10 kV, 22 mA), at a spot size of 250  1000 m, were  produced using an aluminum anode. Scans of the overall spectrum in the binding  energy range of 1‐1100 eV were made at low resolution (pass energy 150 eV). The  area under each peak was used to yield elemental surface concentrations for C, O,  N,  Sn,  F  and  Au  after  correction  with  sensitivity  factors  provided  by  the  manufacturer.  The  O1S  peak  was  split  into  three  components,  i.e.  for  oxygen  involved  in  amide  groups  (C=O‐N;  531.3  eV),  carboxyl  groups  (C‐O‐H;  532.7  eV)  and oxygen arising from the Au‐plated quartz crystal. Accordingly, the fraction of  the  O1s  peak  at  532.7  eV  (%O532.7)  was  used  to  calculate  the  amount  of  oxygen  involved in glycosylated moieties (%Oglyco


%Oglyco =  %O532.7 * %Ototal                 (4)    

where %Ototal is the total percentage of oxygen. 


Ex vivo erosion study 

In this study, a 0.63% w/v SnF2 containing mouthrinse (3M PerioMed Oral Rinse,  3M  ESPE,  St  Paul,  MN,  USA)  was  used  and  results  compared  with  a  control  (water).  A  sintered  hydroxyapatite  (HAP)  disc  (Himed,  Old  Bethesda,  NY,  USA; 

Chapter 6 


batch  #100406)  was  placed  in  the  buccal  sulcus  of  the  lower  jaw  of  a  human  volunteer  in  close  proximity  to  the  first  molar  at  9.00  am.  Eating,  drinking,  brushing and smoking were not allowed from 1 h before insertion until removal of  the samples  from the oral cavity. After 1 h of wearing the disc,  volunteers were  asked  to  rinse  with  the  SnF2    containing  mouthrinse  or  water  for  2  min  and  the  HAP discs were left in the oral cavity for another 1 h. Subsequently, the discs were  removed  and  ex  vivo  exposed  for  2  min  to  3  ml  of  an  erosive  solution  (50  mM  citric acid, pH 3.0) under agitation (100 rpm) and afterwards rinsed with 2 ml of  demineralised  water.  Calcium  loss  into  the  acid  solution  was  measured  using  atomic  absorption  spectroscopy,  as  described  previously  [20].  Three  volunteers,  two males and one female, participated in this part of the study, after giving their  informed consent under the approval by the University Medical Center Groningen  Investigators Research Board (UMCG IRB #2008109). 



Salivary  proteins  adsorbed  to  Au‐plated  crystal  surfaces  within  seconds  after  exposure to saliva and the Δfdecreased within minutes to ‐90 Hz. Simultaneous  ΔDincreased  to  12  x  10‐6.  The  frequency  and  dissipation  remained  constant  during  120  min  of  saliva  flow  (see  Fig.  1).  A  15  min  rinse  with  buffer  yielded  a  slight desorption of loosely adsorbed salivary proteins, indicated by an increase in  Δf3  and  decrease  in  ΔD3.  Subsequent  buffer  exposure  caused  a  further  small  change  in  the  Δf3  and  the  ΔD(Fig.  1A),  whereas  2  min  of  exposure  to  a  SnF2  containing mouthrinse decreased Δf3 to ‐185 Hz and increased ΔDup to 45 x 10‐6  (Fig.  1B),  indicating  adsorption  and  of  SnF2.  Removal  of  the  mouthrinse  by  a  10  min  rinse  with  buffer  rinsing  increased  Δf3  to  ‐110  Hz  and  decreased  ΔDto       9 x 10‐6.  After renewed exposure of buffer treated SCFs to saliva for 120 min, only  a  small  decrease  in  Δf3  and  increase  in  ΔDwas  observed, whereas  SnF2  treated 

SCFs showed a much larger decrease in the Δf3 down to ‐145 Hz and much larger  increase in ΔDup to 18 x 10‐6 upon renewed salivary protein adsorption.  



Figure  1  Influence  of  SnF2  on  adsorbed  SCFs  and  adsorption  of  salivary  proteins  during renewed flow of saliva.  

Example  of  the  QCM‐D  response  to  salivary  protein  adsorption  on  Au‐plated  crystal  surfaces,  chemical  perturbation  and  continued  adsorption  of  salivary  proteins as a function of time, expressed as changes in third harmonic frequency  (∆f3, thick line) and dissipation (∆D3, thin line). Perturbation is due to exposure of  buffer  (A)  or  a  SnFcontaining  mouthrinse (B)The  QCM‐D  chamber  was  first  perfused with saliva, after which a buffer rinse was applied in all cases, followed 

Chapter 6 


by 2 min exposure by buffer or SnF2, intermediate buffer rinsing  for 15 min  and  continued perfusion of the chamber with saliva. 


The structural softness of the SCF after exposure to a SnF2 containing mouthrinse  decreased  as  compared  with  the  softness  after  buffer  treatment  (Fig.  2A).  After  renewed  adsorption  of  salivary  proteins,  differences  in  structural  softness  between  SCFs  treated  with  buffer  or  a  SnF2  containing  mouthrinse  disappeared  (Fig. 2A). Small amounts of Sn and F were measured in SCFs treated with the SnF2  containing mouthrinse, that were absent in SCFs exposed to buffer only (Table 1). 

Moreover, the degree of glycosylation in SCFs formed on the SCF treated with the  SnF2 containing mouthrinse was higher than in SCFs formed on SCFs treated with  buffer (see Fig. 2B).  


Au‐plated  crystal  surfaces  were  extremely  smooth  (Fig.  3A),  whereas  SCFs  were  characterized  by  adsorbed,  globular  structures  (Figs.  3B,  C).  Protein  globules  on  SCFs formed on buffer treated films were approximately 20 nm in height, with a  width of 500 nm, whereas the SCF formed after treatment with a SnF2 containing  mouthrinse  possessed  larger  protein  globules  with  a  height  and  width  of  38  nm  and  900  nm,  respectively  (see  Fig.  3D).  The  SCF  formed  after  treatment  with  a  SnF2 containing mouthrinse furthermore exerted repulsive forces to the colloidal  probe over longer separation distances than SCFs formed on a buffer treated SCF  (Fig. 3E).  


  Figure 2 Influence of SnFon structure and glycosylation of SCFs.   

(A)  structural  softness  of  SCFs  immediately  after  exposure  to  buffer  or  a  SnF2  containing mouthrinse and after renewed SCFs formation..  

(B) degree of glycosylation of SCFs formed on SCFs treated with buffer or a SnF2  containing mouthrinse.  

Error  bars  represent  the  standard  deviations  over  three  independent  experiments.  *Statistically  significant  (p  <  0.05,  two  tailed  Student  t‐test)  differences between buffer and SnF2 treatment. 

Chapter 6 


Table 1 Elemental composition on SCFs formed on SCF exposed to buffer or a SnF

containing  mouthrinse.  ±  indicates  standard  deviation  over  three  separate  experiments.  

62.9 ± 2.9  55.3 ± 0.3 


22.6 ± 2.0  23.1 ± 1.3 


14.3 ± 1.2  12.0 ± 0.4 

  force,  indicating  that  friction  was  independent  of  the  normal  force  applied  (Fig. 

4A).  In  contrast,  friction  forces  on  SCFs  formed  on  films  treated  with  a  SnF2  containing mouthrinse were lower corresponding with a coefficient of friction of  0.07.  

Ex  vivo  calcium  loss  after  citric  acid  exposure  in  HAP  discs  worn  in  human  volunteers  was  two‐fold  lower  when  in  vivo  SCFs  were  treated  with  a  SnF2  containing mouthrinse than with water (see Fig. 4B).  



Figure 3 Surface topography (5 µm x 5 µm) and repulsive forces of SCFs exposed  to buffer or SnFusing colloidal probe AFM. 

(A) bare Au‐plated QCM crystal   

(B) SCF formed on SCF treated with buffer  

(C) SCF formed on SCF treated with a SnFcontaining mouthrinse 

(D)  height  as  a  function  of  the  globular  structures  found  on  the  different  SCFs.   

Black line, SCF treated with buffer, brown line, SCF treated with SnFand orange  line, Au‐plated quartz crystal.  

(E)  example  of  the  repulsive  force  as  a  function  of  separation  distance  between  the colloidal probe and the different SCFs.  

Chapter 6 



Figure 4 Lubrication and erosion protection provided SCFs exposed to buffer or a  SnF2

(A) friction force as a function of increasing (closed symbols) and decreasing (open  symbols)  normal  forces  on  SCFs  formed  on  SCFs  treated  with  buffer  or  a  SnF2  containing  mouthrinse.    Error  bars  represent  standard  deviation  over  9  experiments.  

(B) ex vivo calcium loss due to citric acid exposure of HAP discs, worn by human  volunteers  after  use  of  a  SnF2  containing  mouthrinse  or  control  (water).    Error  bars  represent  standard  deviations  over  three  experiments  in  each  volunteer. 

Experiments in each volunteer were done in triplicate.  

*Statistically  significant  (p  <  0.05,  two  tailed  Student  t‐test)  differences  in  properties of the buffer with respect to SnF2



Abrasion  and  erosion  are  mechanical  and  chemical  wear  phenomena  that  eventually result in loss of enamel and dentin. This study shows that treatment of  SCFs  with  a  SnF2  containing  mouthrinse  caused  the  SCF  to  become  more  rigid,  while furthermore SnF2 treated films recruited more glycosylated salivary proteins  during  renewed  exposure  to  saliva,  giving  rise  to  long  range  repulsion  of  a  colloidal  probe  and  reduced  friction.  Reduced  friction  will  be  responsible  for  protection  of  the  enamel  surface  against  abrasion,  while  it  was  experimentally  determined that SCFs formed on SnF2 treated films were better protected against  erosion than in absence of SnF2 treatment. 


Glycosylated,  high‐molecular  weight  mucins  adsorb  in  loops  and  trains  to  a  surface,  while  smaller  proteins,  like  proline‐rich  proteins,  histatins,  lysozymes,  amylases  may  be  found  underneath  these  loops  and  between  the  trains,  as  illustrated  in  Fig.  5A.    Here  we  suggest  a  model  for  the  interaction  of  Sn2+  ions  with SCFs and the continued interaction of such films with salivary proteins. Sn2+ 

ions  cause  cross‐linking  of  negatively  charged  proteins,  including  adsorbed  glycosylated mucins, yielding a rigid base layer (see in Fig. 5B). Not all Sn2+ will be  involved in cross‐linking, yielding an initially less negatively charged outer surface  of  the  film,  that  interacts  with  glycosylated  mucins  during  renewed  exposure  to  saliva and recruits them to form a soft outer surface of the final film (see Fig. 5C). 

This results in an increased hydrated mass, as determined by QCM‐D with a higher  degree  of  glycosylation  in  the  SCF,  as  determined  by  XPS.  A  higher  degree  of  glycosylation  in  the  SCF  reduces  friction  [5,  6],  while  increased  rigidity  adds  stability in the SCF to withstand higher normal and shear forces. Also, SCFs with 

Chapter 6 


more  hydration  mass  and  higher  glycosylation  may  decrease  the  interaction  between  citric  acid  and  the  HAP surface  through  increased  diffusion  time  [2,  3]. 

Although  it  is  known  that  glycosylated  mucins  can  provide  protection  against  demineralisation  after  exposure  to  citric  acid  [4],  our  results  are  the  first  to  demonstrate  that  this  protection  is  due  to  a  combination  of  structural  and  compositional features of the SCF.  



Figure  5  Architecture  of  SCFs  after  exposure  to  SnFand  renewed  adhesion  of  salivary proteins.  

(A) adsorbed SCF, showing glycosylated mucins adsorbed in loops and trains over  a  layer  of  adsorbed,  densely  packed  low‐molecular  weight  proteins,  including  proline‐rich proteins, histatins and lysozymes.  

(B) SCFs after adsorption of SnF2. The Sn2+ ions diffuse into the SCFs and cross‐link  negatively  charged,  glycosylated  mucins,  causing  collapse  of  the  glycosylated  structure.   

(C)  SCFs  with  adsorbed  Sn2+  ions  and  after  renewed  adsorption  of  salivary  proteins. Reduced electrostatic repulsion due to the presence of Sn2+ ions residing  on  the  SCF  allow  recruitment  of  additional  glycosylated  mucins  to  form  a  soft  mucinous layer over a rigid, cross‐linked SCF. 


In summary, we show that Sn2+ triggers the structure in SCF formed after renewed  flow of saliva over SnFtreated SCF into a rigid base layer and enhanced hydrated  mass  due  to  recruitment  of  glycosylated  mucins  over  this  rigid  base  layer.  The  synergy  between  the  rigidity  and  hydrated  overlayer  with  glycosylated  mucins  provides lubrication stability to improve abrasion resistance as well as a stronger  diffusion barrier to citric acids to improve protection against erosion in the SCF.   

Chapter 6 



1. Joiner  A,  Schwarz  A,  Philpotts  CJ,  Cox  TF,  Huber  K,  Hannig  M  (2008)  The  protective  nature  of  pellicle  towards  toothpaste  abrasion  on  enamel  and  dentine. J Dent 36:360‐368  

2. Amaechi BT, Higham SM, Edgar WM, Milosevic A (1999) Thickness of acquired  salivary  pellicle  as  a  determinant  of  the  sites  of  dental  erosion.  J    Dent    Res  78:1821‐1828.  

3. Hannig  M,  Balz  M  (1999)  Influence  of  in  vivo  formed  salivary  pellicle  on  enamel erosion. Caries Res 33:372‐379.  

4. Amerongen  AVN,  Oderkerk  CH,  Driessen  AA  (1987)  Role  of  mucins  from  human  whole  saliva  in  the  protection  of  tooth  enamel  against  demineralization in vitro. Caries Res 21:297‐309.  

5. Coles  JM,  Chang  DP,  Zauscher  S  (2010)  Molecular  mechanisms  of  aqueous  boundary lubrication by mucinous glycoproteins. Curr Opin Colloid In 15:406‐


6. Berg ICH, Rutland MW, Arnebrant T (2003) Lubricating properties of the initial  salivary pellicle ‐ an AFM Study. Biofouling 19:365‐369.  

7. Mariotti A (2007) Xerostomia; in S.J. Enna, David B. Bylund (eds): XPharm: The  Comprehensive Pharmacology Reference. New York, Elsevier, pp 1‐4.  

8. Attin  T,  Zirkel  C,  Hellwig  E  (1998)  Brushing  abrasion  of  eroded  dentin  after  application of sodium fluoride solutions. Caries Res 32:344‐350.  

9. Lussi  A,  Jaeggi  T,  Zero  D  (2004)  The  role  of  diet  in  the  aetiology  of  dental  erosion. Caries Res 38:34‐44.  

10. Lussi  A,  Megert  B,  Eggenberger  D,  Jaeggi  T  (2008)  Impact  of  different  toothpastes on the prevention of erosion. Caries Res 42:62‐67.  

11. Hove  LH,  Holme  B,  Young  A,  Tveit  AB  (2008)  The  protective  effect  of  TiF4,  SnF2 and NaF against erosion‐like lesions in situ. Caries Res 42:68‐72.  

12. Hjortsjö  GC,  Jonski  PS,  Saxegaard  TE,  Young  A  (2009)  The  effects  of  acidic  fluoride solutions on early enamel erosion in vivo. Caries Res 43:126‐131.  

13. Huysmans  MC.  et  al.  (2011)  Reduction  of  erosive  wear  in  situ  by  stannous  fluoride‐containing toothpaste. Caries Res 45:518‐523.  

14. Veeregowda DH, van der Mei HC, Busscher HJ, Sharma PK (2011) Influence of  fluoride‐detergent  combinations  on  the  visco‐elasticity  of  adsorbed  salivary  protein films. Eur J Oral Sci 119:21‐26.  

15. Veeregowda  DH,  Van  der  Mei  HC,  De  Vries  J,  Rutland  M,  Valle‐Delgado  J,  Sharma  P,  Busscher  HJ  (2012)  Boundary  lubrication  by  brushed  salivary 

15. Veeregowda  DH,  Van  der  Mei  HC,  De  Vries  J,  Rutland  M,  Valle‐Delgado  J,  Sharma  P,  Busscher  HJ  (2012)  Boundary  lubrication  by  brushed  salivary