• No results found

Insufficient  or  absence  of  lubrication  at  articulating  body  parts  results  in  pain,  irritation  and  discomfort,  e.g.  in  patients  with  Sjögren’s  syndrome  [1].  Restoring  biolubrication  in  patients  with  Sjögren’s  syndrome  is  important  as  prolonged  insufficient  lubrication  will  lead  to  persisting  dryness,  damage  of  tissues  and  bones  and  necessitate  intervention  using  artificial  lubricants  or  biomaterials  to  restore  function.  Although  Sjögren’s  syndrome  is  known  to  affect  0.5‐1%  of  the  total  population,  surprisingly  there  is  no  comprehensive  study  on  biolubrication  that  has  succeeded  in  the  development  of  effective  therapeutics  for  Sjögren’s  syndrome covering dry mouth, dry eyes and arthritis. Oral dryness can also occur  due to the excessive use of drugs and pharmaceutical products and is a common  problem in the elderly, who are often on multiple medication. In order to be able  to develop effective therapeutics for dryness at articulating body parts, we have  chosen  the  oral  cavity  as  a  model  for  understanding  the  mechanisms  of  biolubrication.  The  oral  model  was  used  to  investigate  the  importance  of  biolubrication  in  tactile  perception  in  vivo,  and  look  for  clues  enabling  the  development  of  biomimetic,  artificial  lubricants  that  can  alleviate  pain  and  discomfort  due  to  dryness  in  vivo.  We  have  used  various  surface  analytical  techniques  to  elucidate  the  molecular  mechanism  of  biolubrication  by  saliva,  including  quartz  crystal  microbalance  with  dissipation  monitoring  (QCM‐D),  colloidal probe atomic force microscopy (AFM), X‐ray photoelectron spectroscopy  (XPS), contact angle measurements and particulate microelectrophoresis. 

 

Oral cavity as a model for biolubrication 

One  of  the  major  disadvantages  in  biolubrication  research  is  the  limited  availability and difficult access to lubricating biofluids. Synovial fluid and tears are  known  for  their  lubricating  properties,  but  practically  it  is  impossible  to  collect  synovial  fluid  or  tears  in  quantities  (approximately  12  ml)  required  for 

General discussion 

143  biolubrication research. However, saliva can be collected from human volunteers  in  sufficiently  large  quantities  for  research  purposes,  while  moreover  the  oral  cavity  allows  certain  techniques,  like  contact  angle  measurements,  to  be  performed  in  volunteers  [2].  An  added  advantage  of  the  oral  cavity  is  the  possibility  to  collect  parotid,  submandibular  and  sublingual  saliva  separately,  yielding  the  opportunity  to  identify  the  role  of  individual  proteins  and  other  components in biolubrication.  

 

In  chapters  2,  3  and  4  we  demonstrated  in  vitro  that  the  use  of  oral  hygiene  products  influences the  structure and  composition  of salivary conditioning  films,  including  their  lubricating  properties  with  an  impact  on  in  vivo  perception. 

Lubrication  of  hard  surfaces  by  salivary  conditioning  films  adsorbed  from  the  saliva  produced  by  submandibular  and  sublingual  glands,  containing  predominantly glycosylated mucins, was better than of films adsorbed from saliva  excreted by the parotid glands. However, human whole saliva provided the best  lubrication, indicating that lubrication by the glycosylated mucins is optimised by  adsorption of proteins from other (parotid) glands. Similarly, glycosylated proteins  like  lubricins  and  ocular  mucins  in  synovial  fluid  and  tears,  respectively,  may  be  pivotal for effective biolubrication.  

 

Amongst  all  biofluids,  saliva  as  a  natural  boundary  lubricant  faces  the  hardest  challenge  because  of  the  high  contact  pressures  between  oral  hard  tissues. 

Synovial fluids lubricate cartilage surfaces articulating at a contact pressure of 7.5  MPa  [3].  Salivary  conditioning  films  lubricate  both  soft  and  hard  tissues.  Molar  surfaces can exert a contact pressure of 87 MPa [4], which is 10 times higher than  at  knee  joints.  Overall,  salivary  conditioning  films  can  provide  sustained  lubrication and prevent abrasion at high contact pressures.  

Tactile perception in the oral cavity and consumer product design  

Naturally  built‐in  sensing  capabilities  within  our  fingers  and  tongue  can  differentiate  micro‐textures  that  cannot  be  perceived  by  our  eyes.  For  example,  we  can  differentiate  the  quality  of  paper  and  clothes  by  sliding  our  fingers  over  the  products,  sense  the  smoothness  by  sliding  the  tongue  after  brushing  over  a  tooth  surface  and  differentiate  between  texture  and  rheology  of  liquid  foods. 

Tactile  perception  is  attributed  to  interfacial  friction  which  is  known  to  be  controlled by surface roughness [5, 6]. Several interfacial parameters other than  roughness  can  also  influence  the  friction  and  hence,  trigger  tactile  perception. 

Revealing these parameters will be helpful in tuning interfacial friction generating  the  required  perception  in  many  consumer  products.  A  smooth  tooth  feeling  in  vivo as perceived after brushing is related to friction behaviour of chemically and  mechanically  perturbed  salivary  conditioning  films,  as  measured  by  colloidal  probe  atomic  force  microscopy  (chapters  3  and  4).  Note  that  the  relationship  between  the  physical  parameters  i.e.  roughness,  adhesion  and  repulsive  forces  and  friction  is  similar  to  the  relationship  demonstrated  in  classical  nanoscale  tribology, as also described in chapter 1. 

 

A brief guide into bio‐mimetic lubricants for boundary lubrication applications  Biolubricative  polymers  are  used  as  relatively  cheap  therapeutics  for  immediate  relief  in  patients  suffering  from  oral  dryness,  but  hamper  substantive  action. 

Natural  saliva  renews  existing  salivary  conditioning  films  and  films  perturbed  by  toothpaste  detergents  or  brushing.  Sodium  hexametaphosphate  (NaHMP)  influenced the architecture of salivary conditioning films and provided low friction,  due  to  a  combination  of  a  rigid  base  layer  and  extended  glycosylated  outer  surface  of  the  conditioning  film.  This  type  of  naturally  occurring  architecture  is  also  involved  in  providing  a  smooth  feeling  in  vivo  (chapter  3).  Therefore,  we 

General discussion 

145  suggest mimicking this type of lubricous  architecture in biomimetic lubricants to  assist in better biolubrication in the oral cavity.  

 

Some  biomimetic  lubricants,  like  polymethylmethacrylate  block  copolymers  and  polyzwitterionic brushes, provide very low coefficient of friction, i.e. 0.0004 [7, 8]. 

None  of  these  products  has  made  it  to  the  market,  however.  This  also  suggest  that  the coefficient of  friction of  the  biomimetic  lubricants  alone  is  not  the  only  criteria for application as artificial lubricants. The interaction between biomimetic  lubricants and the naturally occurring films from biofluids is important for their in  vivo  application,  which  is  generally  ignored  in  the  development  of  biomimetic  lubricants. In our opinion, a better strategy is to develop artificial lubricants that  work  together  with  an  existing  biolubrication  system  to  enhance  its  lubricating  capability rather than replacing the existing natural system.  

 

Structural softness, degree of glycosylation and coefficient of friction for salivary  conditioning  films  formed  ex  vivo  (chapter  3)  are  considered  as  a  reference  for  healthy  oral  condition,  as  shown  in  Figure  1.  In  case  of  dryness,  the  use  of  recombinant  supercharged  unfolded  proteins  (SUPs)  with  36  (K36)  and  72  (K72)  positive  charges  based  on  elastin‐like  polypeptides  and  cationic  stannous  ions  from  SnF2  containing  mouthrinses  (chapter  6)  can  improve  the  degree  of  glycosylation  and  reduce  the  coefficient  of  friction  in  salivary  conditioning  films. 

However, the key‐parameters proposed did not match with the healthy reference  (Fig. 1), but only move to the healthy corner of the graph. Note that this can be  due to the use of reconstituted saliva from a number of individuals as a substitute  for  fresh  saliva  from  one  individual  where  some  of  the  mucins  might  be  lost  or  disintegrated  during  the  centrifugation  (chapter  3).  Nevertheless,  one  of  the  important leads here, is that there is a linear relationship between the degree of 

glycosylation  and  co‐efficient  of  friction.  Overall  this  research  work  has  set  a  pathway to provide better therapeutics for dry mouth that may be applicable for  dry eyes and arthritis too.  

 

Future research 

1. We have only studied lubrication of salivary conditioning films adsorbed from  saliva of healthy volunteers. In order to develop an effective therapeutic for  dry  mouth  syndrome,  we  should  extend  this  study  to  salivary  conditioning  films  adsorbed  from  saliva  of  dry  mouth  patients.  Furthermore,  lubrication  effects of the artificial salivas available on the market need to be investigated. 

2. In  vitro  friction  force  and  in  vivo  smooth  mouth  feeling  have  only  been  evaluated  for  a  small  number  oral  products  and  it  would  be  of  interest  to  include  food  products  and  beverages  as  well.  Astringent  feelings  after  consuming  tea  and  wine  are  well  known,  but  it  is  not  clear  whether  biolubrication by salivary conditioning films is involved in astringency.  

3. The  entire  thesis  might  be  extended  to  evaluate  mechanisms  of  biolubrication  at  diseased  knee  joints,  despite  the  difficulties  of  obtaining  a  sufficient amount of synovial fluid.  

4. Inclusion  of  the  Tribochemist,  an  instrument  combining  infrared  spectroscopy  and  microtribometry  to  provide  real‐time  molecular  and  structural  analysis  of  lubricating  films  during  friction,  will  help  to  reveal  molecular events during friction.  

General discussion 

147 

        

Figure  1  Degree  of  glycosylation  (%Oglyco;  closed  symbols),  structural  softness  (open symbols) and co‐efficient of friction (CoF) for salivary conditioning film (SCF)  formed  from  fresh  whole  saliva  (whole  saliva  P2),  salivary  conditioning  films  formed from reconstituted saliva (R‐SCF), R‐SCF with cationic recombinants with  72 (K72) and 36 (K36) charges, and R‐SCF with stannous cations from a stannous  fluoride  (SnF2)  containing  mouthrinse.  SCF  formed  ex  vivo  from  a  donor  (whole  saliva‐P2)  is  assumed  to  possess  properties  for  optimum  natural  biolubrication  condition (healthy state?). CoF is determined from the slope of friction force and  the normal force (applied upto 35 nN). Note that all the SCFs were sheared over  an area of 5 µm x 5 µm.  

REFERENCES 

1.  Bowman SJ (2010) Sjögren's syndrome. Medicine 38:105‐108.  

2.   Vissink  A,  De  Jong  HP,  Busscher  HJ,  Arends  J,  's‐Gravenmade  EJ  (1986)  Wetting  properties  of  human  saliva  and  saliva  substitutes.  J  Dent  Res  65:1121‐1124. 

3.   Morrell  KC,  Hodge  WA,  Krebs DE,  Mann  RW  (2005) Corroboration  of  in  vivo  cartilage  pressures  with  implications  for  synovial  joint  tribology  and  osteoarthritis causation. P Natl Acad Sci USA 102:14819‐14824. 

4.   Dejak  B,  Mlotkowski  A,  Romanowicz  M  (2003)  Finite  element  analysis  of  stresses in molars during clenching and mastication. J Prosthet Dent 90:591‐

597.  

5.   Mate  CM,  Carpick  RW  (2011)  Materials  science:  A  sense  for  touch.  Nature  480:189‐190.  

6.   Jones  CS,  Billington  RW,  Pearson  GJ  (2004)  The  in  vivo  perception  of  roughness of restorations. Br Dent J 196:42‐47.  

7.   Raviv U et al. (2003) Lubrication by charged polymers. Nature 425:163‐165.  

8.   Chen  M,  Briscoe  WH,  Armes  SP,  Klein  J  (2009)  Lubrication  at  physiological  pressures by polyzwitterionic brushes. Science 323:1698‐1701.  

               

Summary  

                                         

Insufficient  biolubrication  represents  a  major  healthcare  burden  that  is  facing  greater  pressure  and  impact  on  the  quality  of  life  with  increasing  age  and  life  expectancy.  Insufficient  biolubrication  can  yield  severe  discomfort,  and  rather  frequently occurs in the elderly, in patients using drugs or subjected to head‐neck  radiotherapy and in patients with Sjögren’s syndrome, a syndrome which includes  dryness of the mouth impeding proper speech and mastication, dry and irritated  eyes,  vaginal  dryness  and,  in  its  secondary  form,  excessive  friction  and  wear  of  articulating  cartilage surfaces  in  hips  and  knees.  Currently, our  understanding  of  biolubrication  is  insufficient  to  design  effective  therapeutics  to  restore  biolubrication in the elderly and diseased.  

First,  we  decided  to  select  a  model  system  for  our  biolubrication  research.  As  described in chapter 1, we selected the oral cavity as a model system, mainly due  to  its  ease  of  accessibility  and  availability  of  its  lubricating  fluid,  i.e.  saliva. 

Adsorbed salivary conditioning films (SCFs) in the oral cavity are known to provide  boundary  lubrication,  which  can  be  permanently  hampered  due  to  disease  but  also temporarily perturbed by the use of oral hygiene products. Using the simple  daily dynamics of perturbation of SCFs, we have tried to provide a comprehensive  analysis of biolubrication in the oral cavity at a molecular level and to identify the  role of SCFs in lubrication and oral tactile perception. Influences of chemical and  mechanical  perturbation  of  SCFs  on  biolubrication  were  analyzed  and  effects  of  recombinant  proteins  adsorbed  into  adsorbed  SCFs  on  biolubrication  were  determined to provide a clue to improve current saliva substitutes. 

 

SCFs  are  formed  on  all  oral  surfaces  exposed  to  saliva  and  protect  the  oral  surfaces  against  its  often  hostile  environment.  Oral  hygiene  products,  including  toothpastes,  are  mainly  designed  for  biofilm  control,  but  their  detergents  and  other  active  ingredients  also  affect  the  general  properties  of  adsorbed  SCFs.  In 

Summary 

151  chapter 2, the kinetics of SCF formation, its hydrated thickness and visco‐elasticity  are  determined  using  a  Quartz  Crystal  Microbalance  with  Dissipation  (QCM‐D). 

Two  hour  old  in  vitro  adsorbed  SCFs  were  43.5  nm  thick  and  its  characteristic  frequency was 9.4 MHz, whereas the dehydrated thickness, measured using X‐ray  photoelectron  spectroscopy,  was  2.4  nm.  Treatment  with  toothpaste  slurries  decreased  the  film  thickness  depending  on  fluoride‐detergent  combination  involved.  Secondary  exposure  to  saliva  replenished  the  perturbed  SCFs  and  increased the film thickness to much of its original thickness, although no relation  existed between hydrated and dehydrated film thicknesses indicating differences  in film structure. Treatment with SnF2‐SLS containing toothpaste slurries yielded a  strong, immediate two‐fold increase in characteristic film frequency with respect  to  untreated  films,  indicating  cross‐linking  in  adsorbed  salivary‐protein‐films  by  Sn2+ that was  absent when SLS  was replaced by  NaHMP.  Secondary exposure to  saliva of SCFs treated with SnF2 caused a strong six‐fold increase in characteristic  frequency  compared  with  primary  salivary‐protein‐films,  regardless  whether  SLS  or NaHMP was the detergent. This suggests that ionized stannous, is not directly  available for cross‐linking in combination with highly negatively charged NaHMP,  but becomes slowly available after initial treatment to cause cross‐linking during  secondary exposure to saliva.  

 

Detergents  like  SLS  and  NaHMP  in  toothpastes  not  only  influence  the  structure  and composition of the SCFs, but also affect the lubrication by SCFs and sensory  perception in the volunteers, as determined in chapter 3. Using different surface  analytical  techniques  like  atomic  force  microscopy  (AFM),  QCM‐D,  X‐ray  photoelectron  spectroscopy  (XPS)  and  contact  angle  measurements  we  demonstrated  that  adsorbed  SCFs  in  vitro  are  more  lubricious  when  their  hydrophilicity and  degree  of glycosylation  increases, meanwhile  decreasing their 

structural  softness.  High‐molecular‐weight,  glycosylated  proteins  adsorbing  in  loops and trains, are described as necessary scaffolds impeding removal of water  during  loading  of  articulating  surfaces.  Comparing  in  vitro  and  in  vivo  water  contact angles measured intra‐orally, the sensory‐perception in human volunteers  could  be  related  with  structural  softness  and  glycosylation  of  adsorbed  protein  films on tooth surfaces.  

 

Lubrication by SCFs and sensory perception in volunteers are not only affected by  detergents, but also by the different modes of mechanical brushing, as shown in  chapter  4.  Boundary  lubrication  by  SCFs  was  influenced  by  different  modes  of  tooth  brushing,  which  corresponds  to  changes  in  SCFs  roughness,  dehydrated  layer  thickness  and  degree  of  glycosylation.  Coefficient  of  frictions  (COFs)  on  16  hours old SCFs after manual, rotary‐oscillatory and sonically‐driven brushing were  measured using colloidal probe AFM. AFM was also used to assess the roughness  of  SCFs  prior  to  and  after  brushing.  Dehydrated  layer  thicknesses  and  glycosylation of the SCFs were determined using XPS. Mouthfeel after manual and  rotary‐oscillatory  and  sonically‐driven  brushing  was  evaluated  employing  a  split‐

mouth  design.  Compared  with  unbrushed  and  manually  or  sonically‐driven  brushed SCFs, powered rotary‐oscillatory brushing lead to deglycosylation of the  SCF,  loss  of  thickness  and  a  rougher  protein  film.  Concurrently,  due  to  deglycosylation  and  its  increased  roughness,  the  COF  of  a  powered  rotary‐

oscillatory  brushed  SCF  increased  strongly  by  a  factor  of  ten  with  respect  to  an  unbrushed  SCF.  Volunteers  reported  a  slightly  preferred  mouthfeel  after  sonic‐

brushing as compared to powered rotating‐oscillating brushing. Overall, powered  rotary‐oscillatory  brushing  can  deglycosylate  a  SCF,  leading  to  a  rougher  protein  film  as  compared  with  manual  and  sonic‐brushing,  therefore  decreasing  the 

Summary 

153  lubricative  function  of  the  SCF.  This  is  consistent  with  clinical  mouthfeel  evaluation after different modes of brushing.  

 

We  have  shown  that  biolubrication  is  influenced  by  the  structure  and  glycosylation  of  adsorbed  protein  films,  providing  an  important  clue  to  design  effective  therapeutics  to  restore  biolubrication  in  patients  with  insufficient  biolubrication.  In  chapter  5,  we  apply  recombinant  supercharged  unfolded  proteins (SUPs) with 36 (K36) and 72 (K72) positive charges based on elastin‐like  polypeptides  to  improve  lubrication  of  adsorbed  SCF.  Adsorbed  K36  and  K72  interact with glycosylated mucins in SCFs to form a rigid film, which increases with  the  number  of  positive  charges.  Renewed  exposure  to  saliva  after  adsorption  of  cationic SUPs recruits additional negatively charged glycosylated mucins to create  a  soft,  hydrated  film,  especially  when  K72  is  involved.  These  hydrated  and  rigid  films improve lubrication and maintain their structural integrity upon high contact  pressures.  Current generations of  artificial  salivas  are inadequate  to  restore oral  lubrication on a lasting basis. Therefore, cationic SUPs represent a potential novel  therapeutic modality to restore lubrication when availability of naturally occurring  proteins is reduced.  

 

In  healthy  persons,  adsorbed  SCFs  are  known  for  protecting  the  tooth  surfaces  against  abrasion  and  also  erosion.  The  structure  and  glycosylation  of  the  SCFs  influencing the lubrication behaviour or abrasion resistance can be also expected  to influence the erosion protection by the SCFs.  As shown in chapter 6, we use a  SnF2  containing  mouthrinse  to  demonstrate  the  importance  of  structural  and  glycosylation changes in SCFs, as induced by Sn2+ ions in the protection of enamel  surfaces  against  erosion  and  abrasion.  QCM‐D  showed  that  SCFs  became  rigid  after  exposure  to  a  SnF2  containing  mouthrinse,  which  we  attributed  to  cross‐

linking of adsorbed proteins by Sn2+ ions. During renewed exposure to saliva, the  SnF2  treated  SCF  recruited  more  salivary  proteins,  thereby  increasing  the  adsorbed mass and degree of glycosylation in the SCF, as determined from QCM‐D  and XPS, respectively. The renewed adsorbed film on a SnF2 treated SCF provided  a  lower  friction  than  when  formed  on  an  untreated  SCF.  Moreover,  such  rigid,  more heavily glycosylated and lubricious SCFs yielded a lower calcium loss during  exposure to a citric acid solution than untreated SCFs. Therewith, this is the first  study to demonstrate physical changes in SCFs due to Sn2+ adsorption that can be  related to the control of erosion and abrasion of enamel surfaces in vitro.  

 

In  chapter  7,  we  emphasize  the  advantages  of  using  the  oral  cavity  as  a  model  system  for  biolubrication  studies.  Also,  we  highlight  the  role  of  biolubrication  in  tactile  perception  which  can  be  of  benefit  for  consumer  based  design  of  oral  health care products. In the end, we provide details regarding naturally occurring  SCFs  lubricous  architectures  which  can  be  important  for  biomimetic  lubrication  research  to  develop  artificial  lubricants  that  can  provide  better  wetting  of  oral  surfaces,  reducing  the  sensation  of  pain  due  to  oral  dryness  and  improving  the  oral function like chewing, swallowing and speech.  

 

Samenvatting 

                                         

Onvoldoende biolubricatie (natuurlijke smering) is een vervelend ziektebeeld, die  qua  impact  op  de  kwaliteit  van  leven  toeneemt  met  toenemende  leeftijd  en  levensverwachting. Onvoldoende biolubricatie kan leiden tot ernstig ongemak en  komt  frequent  voor  bij  ouderen,  patiënten  die  medicijnen  gebruiken  of  zijn  blootgesteld  aan  radiotherapie  in  het  hoofd‐hals  gebied,  of  patiënten  met  Sjögren’s  syndroom.  Sjögren’s  syndroom  is  een  ziekte  waarbij  droogheid  van  de  mond spraak‐ en kauwproblemen veroorzaakt  en wordt mede gekenmerkt door  droogheid en irritatie van de ogen, vagina en, in zijn secundaire vorm, overmatige  wrijving in en slijtage van gewrichtsoppervlakken in de heupen en knieën. Op dit  moment is onze kennis wat betreft biolubricatie onvoldoende om een effectieve  therapie te kunnen ontwikkelen om biolubricatie in ouderen en zieken voldoende  te kunnen herstellen.  

Bij aanvang van dit onderzoek hebben we allereerst een geschikt model systeem  gekozen om biolubricatie te bestuderen. De mondholte is als model gekozen zoals  beschreven  in  hoofdstuk  1,  voornamelijk  vanwege  de  toegankelijkheid  en  beschikbaarheid  van  de  vloeistof  die  hierin  voor  lubricatie  zorgt,  namelijk  het  speeksel. Het is bekend dat geadsorbeerde speeksellagen (SCFs) in de mondholte  zorgen voor smering, welke permanent verstoord kan worden door ziekte, maar  dagelijks  ook  tijdelijk  verstoord  wordt  door  het  gebruik  van  verschillende  mondverzorgingsproducten.  Door  gebruik  te  maken  van  de  simpele  dagelijkse  dynamiek van verstoringen van de SCFs hebben we een analyse gemaakt van de 

Bij aanvang van dit onderzoek hebben we allereerst een geschikt model systeem  gekozen om biolubricatie te bestuderen. De mondholte is als model gekozen zoals  beschreven  in  hoofdstuk  1,  voornamelijk  vanwege  de  toegankelijkheid  en  beschikbaarheid  van  de  vloeistof  die  hierin  voor  lubricatie  zorgt,  namelijk  het  speeksel. Het is bekend dat geadsorbeerde speeksellagen (SCFs) in de mondholte  zorgen voor smering, welke permanent verstoord kan worden door ziekte, maar  dagelijks  ook  tijdelijk  verstoord  wordt  door  het  gebruik  van  verschillende  mondverzorgingsproducten.  Door  gebruik  te  maken  van  de  simpele  dagelijkse  dynamiek van verstoringen van de SCFs hebben we een analyse gemaakt van de