University of Groningen
Known and unknown functions of TET dioxygenases: the potential of inducing DNA
modifications in Epigenetic Editing
Chen, Hui
DOI:
10.33612/diss.168496242
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Chen, H. (2021). Known and unknown functions of TET dioxygenases: the potential of inducing DNA modifications in Epigenetic Editing. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.168496242
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
APPENDIX 1
NEDERLANDSE SAMENVATTING
In ziekten zijn sommige genen inactief, dit kan door genetische mutaties of door zogenaamde epigenetische inactivatie veroorzaakt zijn. Bij een genetische mutatie wordt vaak het eiwit niet correct gemaakt waardoor het zijn activiteit niet kan uitvoeren. Bij epigenetische inactivatie is er geen fout in het DNA maar zijn er veranderingen op of aan het DNA molecuul wat het aflezen van het gen voorkomt. Een belangrijke manier van epigenetische inactivatie is DNA methylering op cytosines voor guanines (CpGs). In Hoofdstuk 2 van dit proefschrift hebben we een manier ontwikkeld om gen-specifieke DNA-demethylering voor dergelijke epigenetisch geinactiveerde genen te bewerkstelligen. Als potentiële "demethylase" kandidaten, hebben we TET dioxygenase familieleden TET1 en TET3, cytosine deaminase Aid en Apobec1, en het nucleotide excisie reparatie (NER) component Gadd45a getest. De kandidaten werden gefuseerd met zogenaamde zink vinger eiwitten (ZF), welke ontwikkeld zijn om promoter-sequenties van twee genen (ICAM-1 en EpCAM) te binden. Na bevestiging dat alle ZFfusie-eiwitten correct tot expressie kwamen, werd hun effect op DNA-methylatie en genexpressie beoordeeld. De resultaten toonden aan dat Aid, Apobec1 en Gadd45a niet leidde tot significante demethylering van CpGs in het doelgebied. Interessant genoeg ontdekten we dat TET1 en TET3 wel resulteerden in significante demethylering in het doelgebied van de ICAM-1-promoter, hoewel de mate van toediening (transductie-efficiëntie) voor deze fusie-eiwitten erg laag was (Hoofdstuk 2).
Omdat TET-dioxygenases veelbelovende leken om demethylering te bewerkstelligen, hebben we in Hoofdstuk 3 het gerichte demethylerings-effect van alle drie de TET-familieleden verder getest. Om het probleem van lage transductie-efficiëntie te overwinnen, zijn de behandelde cellen gesorteerd om ervoor te zorgen dat de cellen die werden gebruikt voor analyse succesvol waren getransduceerd zodat ze goed het ZF-TET CD-construct tot expressie konden brengen. We toonden demethylering van ICAM-1 en EpCAM-promoters aan voor TET2 en in mindere mate voor TET1, maar niet voor TET3. Interessant genoeg hebben we ook een significante verdubbeling van ICAM-1-transcriptie waargenomen na expressie van TET2 CD, en niet voor de inactieve TET2CD-mutant. In tegenstelling tot de gegevens verkregen voor ICAM-1, hebben we geen heractivering van EpCAM-transcriptie door ZF-TET2CD waargenomen. Deze gegevens gaven aan dat inductie van doelgenexpressie zou kunnen worden verkregen door TET2 naar promotersequencties te redigeren, maar dat de daadwerkelijke activering van transcriptie afhankelijk is van de locatie van de gedemethyleerde CpG-plaatsen in het promotor-gebied en/of van andere promoterkarakteristieken. Om inzicht te krijgen in de effecten van de ZF-TETfusies op het gehele DNA molecuul,
hebben we het methyleringsniveau van LINE-1-repeats geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat geen DNA-demethylering werd gedetecteerd voor drie CpG-plaatsen van de LINE-1-promoter na behandeling met een TET effectordomein. Voor zover wij weten, waren wij de eersten die daadwerkelijk TET-gemedieerde DNA-demethylatie induceerden op een hypergemethyleerd gebied in het DNA, en Hoofdstuk 3 beschrijft dus een interessante benadering voor het verder bestuderen van het mechanisme van door TET geïnduceerde DNA-demethylatie in de endogene chromatinecontext.
Momenteel zijn studies van de katalytische eigenschappen en fysiologische functies van TET-dioxygenase gericht op zoogdieren. TET-homologen kunnen echter ook worden gevonden in lagere eukaryoten, zoals acht TET-homologen geïdentificeerd in Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii). Bovendien is de aminozuursequentie van TET-homologen die een interactie aangaan met 2-OG in C. reinhardtii niet geconserveerd vergeleken met TET bij zoogdieren, hetgeen suggereert dat ze verschillende katalytische eigenschappen hebben. Om de evolutionaire geschiedenis van TET-dioxygenasen beter te begrijpen en nieuwe inzichten te verschaffen in het mechanisme van DNA-demethylering, hebben we de katalytische eigenschappen en fysiologische functies van TET homologen onderzocht in het vroegere evolutionaire organisme C. reinhardtii. We ontdekten eerst dat CrTET1 (ook CMD1 genoemd) in vitro 5mC kan katalyseren om twee nieuwe DNA-modificatieproducten te produceren (5-glyceryl-methylcytosine stereoisomeren genaamd, 5gmC). Het is belangrijk om CMD1-mutanten te kunnen maken om de katalytische reactie te verifiëren en de fysiologische functies in C. reinhardtii te ontrafelen. Lange tijd was er echter een gebrek aan effectieve genbewerkingsmanieren voor nucleaire genen in C. reinhardtii, wat de studie van onbekende functionele genen aanzienlijk beperkt. Daarom hebben we eerst een gen-bewerkingsmanier geoptimaliseerd op basis van Cas9-gRNA RNPs en een strategie ontwikkeld voor co-selectie van de targetgenmutant en MAA7-mutant. MAA7 codeert voor de β-subeenheid van tryptofaan, katalyseert de laatste stap van de synthese van tryptofaan en produceert tryptofaan met serine en indol als substraten. C. reinhardtii zal resistent zijn tegen 5-fluorindool (5-FI) wanneer frameshift-mutaties optreden op specifieke plaatsen van MAA7. Door de co-selectiestrategie te gebruiken, verkregen we CMD1-mutanten en mutanten van het VTC2-gen dat verantwoordelijk is voor de productie van vitamine C (VC) in C. reinhardtii (Hoofdstuk 4).
Vervolgens bevestigden we met behulp van deze mutanten dat CMD1 5mC in het genoom van C. reinhardtii kon modificeren en dat VC hierbij wordt gebruikt. Het suggereert ook dat metabolieten van kleine moleculen direct betrokken kunnen zijn bij DNA-modificatie en mogelijk betrokken zijn bij transcriptionele regulatie. In CMD1-mutanten daalde het gehalte van 5 gmC aanzienlijk, terwijl het gehalte van 5 mC toenam, wat suggereert dat de productie van 5 gmC gerelateerd was aan demethylering
208 209
van 5 mC. Fenotypisch vonden we dat de tolerantie van CMD1-mutanten voor sterk licht aanzienlijk was verminderd, en dat het vermogen van niet-fotochemische uitdoving (NPQ) en elektronenoverdrachtssnelheid ook aanzienlijk was verlaagd, wat aangeeft dat CMD1-mutanten duidelijke defecten hadden in licht-beschermingsmechanismen. Vervolgens hebben we het moleculaire mechanisme van dit defect onderzocht en vastgesteld dat het expressieniveau van een NPQ-kernfactor (Light-harvesting complex stress-related 3 (LHCSR3)) in CMD1-mutanten aanzienlijk was verlaagd. Bisulfietsequencing toonde aan dat het methyleringsniveau van DNA promotersequenties van LHCSR3 significant was toegenomen in CMD1-mutanten, wat de expressie van dit gen remde en fotobeschermingsdefecten in de CMD1-mutanten veroorzaakte. Hoofdstuk 4 onthult dus een nieuwe eukaryotische DNA-basismodificatie en de betrokkenheid ervan bij een functioneel geconserveerde, maar mechanistisch afwijkende, DNA-demethyleringsroute voor de epigenetische regulatie van fotosynthese.
Door een co-selectiestrategie te ontwikkelen, hebben we dus twee mutanten soorten verkregen voor niet-fenotypische doelwitgenen (CMD1- en VTC2) met CRISPR-gestuurde gen-bewerking. De efficiëntie van het verkrijgen van CMD1-mutanten was echter erg laag: we identificeerden slechts één mutant uit 986 5-FI-resistente kolonies. We hebben vervolgens ontdekt dat de editing-efficiëntie van doelgenen (FKB12, FTSY en IFT46) gemedieerd door Cas9-gRNA RNPs positief gerelateerd is aan het transcriptionele niveau. Als alternatief zou het verbeteren van de screeningsnauwkeurigheid van kandidaat-mutanten uit de celpopulatie, ook de isolatie-efficiëntie van mutanten voor doelwitgenen met lage editing-efficiëntie, waaronder CMD1, kunnen verbeteren. Daarom hebben we een door microhomologie gemedieerde integratie van donor-DNA en gerichte integratie-afhankelijke tweestaps screeningprocedure ontwikkeld, om de gewenste mutanten effectief te kunnen isoleren. Met deze strategie hebben we zes CMD1-mutanten geïdentificeerd uit 60 hygromycine B-resistente kolonies, waardoor de efficiëntie met ongeveer 100-voudige wordt verhoogd in vergelijking met de co-selectiestrategie (Hoofdstuk 5).
We vonden verder dat deze zes CMD1-mutanten in twee typen konden worden verdeeld. Eén type integreert een compleet donor-DNA op de Cas9-splitsingsplaats en wordt CMD1 "precieze mutant" genoemd, terwijl een ander type twee donor-DNAs op de Cas9-plaats integreert door een linker-DNA-fragment en CMD1 "onnauwkeurige mutant" wordt genoemd. Bovendien vertoonde DNA-sequentiebepaling voor weerszijden van het donor-DNA geen base deleties. Dit geeft aan dat de integratiegebeurtenis door microhomologie gemedieerde en recombinatie-afhankelijke knock-in van donor-DNA heeft plaatsgevonden. Bovendien toonden onze screeningen ook aan dat CrTET2, een paralogisch gen van CMD1, niet bestond in de
CC-5325-stam, wat nuttig zal zijn om de functies van CMD1 en 5gmC verder te onthullen. De benadering zal een nieuwe weg openen voor het verbeteren van de mutant-isolatie-efficiëntie van kandidaatgenen met een laag transcriptieniveau en is nuttig om de functie ervan verder te onthullen. Als zodanig biedt deze studie een effectief platform voor gerichte knock-out / of knock-in voor elk gen van interesse door de beschreven methoden en de eerder gedemonstreerde co-selectiestrategieën te gebruiken (Hoofdstuk 5).
APPENDIX 2
212
LIST OF PUBLICATIONS
1. Jian-Huang Xue*, Guo-Dong Chen*, Fuhua Hao*, Hui Chen*, Zhaoyuan Fang, Fang-Fang Chen, Bo Pang, Qing-Lin Yang, Xinben Wei, Qiang-Qiang Fan, Changpeng Xin, Jiaohong Zhao, Xuan Deng, Bang-An Wang, Xiao-Jie Zhang, Yueying Chu, Hui Tang, Huiyong Yin, Weimin Ma, Luonan Chen, Jianping Ding, Elmar Weinhold, Rahul M. Kohli, Wen Liu, Zheng-Jiang Zhu, Kaiyao Huang, Huiru Tang & Guo-Liang Xu. (2019). A vitamin-C-derived DNA modification catalyzed by an algal TET homologue. Nature, 569, 581-585.
* Co-First Author
2. Monique G P van der Wijst, Muralidhar Venkiteswaran, Hui Chen, Guo-Liang Xu, Torsten Plösch, and Marianne G Rots. (2015). Local chromatin microenvironment determines DNMT activity: from DNA methyltransferase to DNA demethylase or DNA dehydroxymethylase. Epigenetics, 10, 671-676.
3. Hui Chen, Hinke G Kazemier, Marloes L. de Groote, Marcel H. J. Ruiters, Guo-Liang Xu and Marianne G. Rots. (2014). Induced DNA demethylation by targeting Ten-Eleven Translocation 2 to the human ICAM-1 promoter. Nucleic Acids Research, 42, 1563-1574.
4. Bo Liu, Yuan-Feng Liu, Ya-Rui Du, Andrei N. Mardaryev, Wei Yang, Hui Chen, Zhi-Mei Xu, Chen-Qi Xu, Xiao-Ren Zhang, Vladimir A. Botchkarev, Yu Zhang and Guo-Liang Xu. (2013). Cbx4 regulates the proliferation of thymic epithelial cells and thymus function. Development, 140, 780-788.
Appendix 2
APPENDIX 3
Appendix 3 Acknowledgements Time flies like an arrow, and always leaves us in a hurry! More than 10 years have
passed since I joined Prof. Xu Guo-Liang's research group of Shanghai institute of biochemistry and cell biology as research assistant in 2009. Ten years of experience and precipitation have made me more mature and stable, accumulated more professional knowledge, and also increased my social experience; it has also made me transform from a hairy boy into a husband and father, and at the same time, I have understood the responsibilities to be undertaken. The people and experiences that I have met in the past 10 years have flashed in my mind like a slide show. They are so familiar and kind. As my doctoral dissertation is about to be completed, what I am most grateful for is the mentors, classmates, friends and family who have been accompanying me, supporting and encouraging me all the way. I would like to take this opportunity to express my most sincere thanks to all of you!
First of all, I would like to express my most sincere respect and thanks to two supervisors, Marianne G Rots, Professor of the medical center of Groningen university in the Netherlands, and Xu Guo-Liang, Professor of the Shanghai institute of biochemistry and cell biology !
Ten years ago, I was honored to be a member of Prof. Xu's group. Here, I really entered the door of life science research, learned the knowledge and technology for life, and set up my own life direction and goal. Prof. Xu is definitely the most hardworking person. During the day, night and holiday, we can always see Prof. Xu in the laboratory. His high work enthusiasm, rigorous scientific attitude and the spirit of scientific research will always be my model. Under the careful guidance and instruction of Prof. Xu, I have improved my experimental skills and professional knowledge, learned how to cooperate with others to carry out project research efficiently, and established the awareness of innovative thinking. In addition, I also would like to thank Prof. Xu for giving me the opportunity to continue my studies and achieve my important goals in life. With the recommendation of Prof. Xu, I got the opportunity to study for the joint cultivation of doctor's degree at Groningen University in the Netherlands. It gave me the opportunity to meet another mentor on the road of scientific research, Prof. Marianne.
Deeply thank you, Prof. Marianne, for giving me the opportunity to interview, and more importantly, for your special trip from Groningen to Shanghai to interview me. Eight years ago, I came to Prof. Marianne's group of the medical center of the University of Groningen and started my doctoral research life. I still remember clearly that on the day of my arrival, Prof. Marianne personally drove me to my apartment and helped me move my luggage to my room. The next day, Professor Marianne took me to a scenic spot by the sea in Groningen and introduced her little daughter to me. This
made me feel the warmth of my home, relieved the tension and uneasiness caused by my first visit to another country, and accelerated my adaptation to the new environment to a large extent. After I got familiar with the new laboratory, Prof. Marianne patiently explained to me the theoretical knowledge and technical route of the epigenetic editing system, which made me understand the purpose and significance of the subject quickly, and laid a good foundation for the subject to go on the right track as soon as possible. Through every conversation or regular meeting with Prof. Marianne, I gradually expanded my research vision, imperceptibly cultivated the ability of independent scientific research, and at the same time gave me a clearer understanding of myself in a relatively unfamiliar environment. In addition to scientific research, Prof. Marianne often cares about my life and invites me to visit her home many times, which makes me feel warm, and also promotes our relationship to the realm of being a teacher and a friend.
Here, I would like to sincerely say to Prof. Xu and Prof. Marianne again, thank you for all you have done!
I would like to thank Prof. Jeltsch, Prof. Plosch and Prof. Hu Ping of the reading committee for your careful review of my doctoral dissertation, as well as your valuable comments and suggestions.
Special thanks to Prof. Huang kai-Yao of the Institute of Hydrobiology of the Chinese Academy of Sciences, Prof. Yang Wen-Qiang of the Institute of Botany of the Chinese Academy of Sciences, and Prof. Pan Jun-Min of Tsinghua University for their guidance and gifts of experimental materials during the progress of the project.
Thank you, associate professor Shen Xue-Ren, associate professor Du Ya-Rui in Prof. Xu's group. As a laboratory manager, Mr. Shen is amiable and good at communication. He combed everything in order. Prof. Xu's laboratory was able to operate effectively, largely thanks to Mr. Shen's meticulous work. "There is an old man at home, if there is a treasure" is the most appropriate sentence to use on Mr. Shen. I feel very lucky to have an elder like him to provide logistical support for our research project. Associate professor Du Ya-Rui is my first navigator after I joined Prof. Xu's laboratory. She is honest, kind and compassionate. I am more used to calling her sister Du. She personally demonstrated and taught many of my experimental skills. In addition, I also learned from sister Du that I should do things in a crisp and orderly manner, and make clear and orderly arrangements for the progress of my own subject. After learning the experimental skills with sister Du for a while, Prof. Xu arranged me to join the research project on the function of Cbx4 in the thymus of mice led by senior brother Liu Bo.
216 217
Appendix 3 Acknowledgements
Thank you, Dr. Liu Bo, who is currently conducting post-doctoral research in UC Berkeley. Senior brother Liu Bo is funny and humorous. He speaks carefully and clearly. He has a keen judgment and unique opinion on the problems encountered in the experiment. Every time I discuss the experimental problems with him, I always feel like bathing in the spring breeze and holding the summit, which also makes me gain the thinking mode of doing scientific research. Thanks to the guidance and help of senior brother Liu Bo in the first two years, it laid a good foundation for me to carry out independent research on my own project in Dutch laboratory later. I sincerely thank the above three people and wish you good health, happy life and everything you wish!
Thank you, Dr. Marloes and Ms. Hinke, the main collaborators of the doctoral project in the Netherlands. In the first half year of my stay in the Netherlands, I was mainly involved in Dr. Marloes's research project. Under the patient guidance of Dr. Marloes, I learned and mastered the design and construction of zinc finger protein expression plasmids, the packaging of retroviruses and subsequent cell transduction experiments, and reserved experimental skills for my own project later. Thanks to Ms. Hinke for her great assistance after my own project was launched. In addition, I would like to extend my special thanks to Dr. Marloes and Ms. Pytrick for agreeing to serve as Paranimfen in my defense ceremony. I would like to thank you for your assistance in preparing my defense!
Thanks to other members of the EGE group (when I was there), Marcel, Jelleke, Ieneke, Fahimeh, Christian, Rutger, David and Monique, your company in the laboratory has added many wonderful moments to the monotonous scientific research life.
Thank you for my main collaborators in the doctoral research in Shanghai, Dr. Xue Jian-Huang, Dr. Chen Guo-Dong, Dr. Duan Yi-Min, Yang Qing-Lin and Zhang Xiao-Jie. Thanks to Dr. Xue Jian-Huang and Dr. Chen Guo-Dong for their outstanding work in identifying the reaction mechanism of CMD1, which laid a solid foundation for the follow-up of CMD1 project. Thanks to Yang Qing-Lin and Zhang Xiao-Jie for their important efforts in the massive purification of Cas9 protein, it is precisely the high purity and high activity of Cas9 protein that provides a guarantee for the subsequent access to key experimental materials. Thanks for Dr. Duan Yi-Min's efforts in the preparation of CMD1 overexpression strain in Chlamydomonas. Thank you very much, Zhang Xiao-Jie and Jin Zi-Yang, for your contribution in identifying CMD1 and KU80 mutants. It is with the fruitful work of all of the above that the whole research work can continue to advance smoothly. In addition, I would like to thank other members of
the “Chlamydomonas group”, Xia Wei, Xu Lu-Ang and Fan Qiang-Qiang, for your help and suggestions in the progress of the project.
Thanks to Han Bin-Bin, Xu Qin, Zhou Tian-Tian, Sun Mei-Ling, Wang Chao, Ji Zhi-Jian, Cen Chao-Chao, Cui Hang-Yuan and other junior brothers and sisters who are still in Prof. Xu's group. I wish you can do more outstanding work!
Thanks to Lin Yi-Hui, Wu Hai-Ping, Li bin-Zhong, Hu Jia-Lei, Liu Peng, Huang Zheng, Wang Yang, Hu Xiao, Cui Qing-Yan, Gu Tian-Peng, Zhang Lei, Zhang Run-Rui, Guo Fan, Mao Shi-Qing, Li Zheng, Li Tong, Dai Hai-Qiang, Chen Jia-Jia and Cheng Shi-Song, who have graduated from Prof. Xu’s group. Your excellent work has laid a good foundation for the laboratory!
I would also like to thank Xu Zhi-Mei and Gao Juan, who are still in the service of Prof. Xu’s group, and He Yu-Fei, Xie Zhi-Guo, Xu Yu, Xu Gui-Fang, Liu Wei, Du Lin, Song Xue-Hui, Wei Xi-Xiao and Zhong Na, who have already resigned. Thank you for all your support and help in work and life! I feel very lucky to work with you. Life is more colorful with your company! I wish you all the best!
Finally, I would like to thank my family sincerely. Thanks to my parents, you have worked hard to raise me up, provide me with education and always give me room for my own development. Your meticulous care enables me to devote myself to scientific research work. I will repay the kindness of upbringing with my whole life. Thank my parents-in-law. You not only married your only daughter to me, but also always supported my scientific research work. I would also like to sincerely and deeply thank my wife Chen Shu for her unrepentant support and sharing the sweetness and pain of life with me in the past eight years. Your understanding, tolerance and love support me to finish my doctoral studies. I can't express my gratitude in words. I believe that our life will be better in the future. Finally, I would like to thank my two lovely children, brother, who is almost four years old, and sister, who is over one year old. You two are the most precious gifts given to me by god. Let you two grow up healthily and happily is the forever power source in my life.
I would like to dedicate this thesis to my family.
Chen Hui
APPENDIX 4
220 221
Appendix 4 Acknowledgements in Chinese
光阴似箭，日月如梭，时间总是在不经意间离我们匆匆而去！从 2009 年以研究 实习员身份加入中科院上海生物化学与细胞生物学研究所徐国良课题组，到现在已 经过去了 10 年有余。 10 年的历练与沉淀，让我多了份成熟和稳重，积累了更多的专 业知识，也增添了些许的社会阅历；更让我从一个毛头小伙蜕变为丈夫和父亲，同 时也明白了要担起的责任。10 年间遇到的人和经历的事，就像幻灯片一样在我脑海 中不断闪现，是如此的熟悉而又亲切。 在我的博士学位论文即将完成之际，我最感 恩的是一路走来一直陪伴在身边、给我支持和鼓励的老师、同学、朋友和家人。借 此机会，我要向你们表达我最诚挚的谢意！ 首先，我要向我的两位导师，上海生物化学与细胞生物学研究所的徐国良研究员 和荷兰格罗宁根大学医学中心的 Marianne 教授，表达最诚挚的敬意和感谢！ 十年前，我有幸成为了徐老师实验室的一员，在这里我真正进入了生命科学研究 的大门，学习到了终身受用的知识和技术，同时也树立了自己的人生方向和目标。 徐老师绝对是我们实验室工作最勤奋的人，他高昂的工作热情、严谨的科学态度和 精益求精的科研精神将始终是我学习的榜样。在徐老师悉心的指导和教诲下，我提 高了自己的实验技能和专业知识，学会了如何高效的与他人合作开展课题研究，更 树立了要有创新思维的意识。此外，还要特别感谢徐老师给了我继续深造并完成自 己人生重要目标的机会。 在徐老师的推荐下，我通过面试获得了去荷兰格罗宁根大 学攻读联合培养博士学位的机会，这也让我有幸结识了科研道路上的另一位导师， Marianne 教授。感谢 Marianne 教授给了我面试的机会并专程从荷兰来到上海对我进 行面试。 八年前，我来到格罗宁根大学医学中心 Marianne 教授实验室开始了博士阶段的 科研生活。我还清晰的记得，在抵达那天，Marianne 教授亲自驾车将我送到公寓门 口，并协助我将行李搬到所住的房间。第二天，Marianne 教授带我游玩了格罗宁根 海边的一个景点，并将她的小女儿介绍给我认识。这让我感受到了家的温暖，缓解 了因初到异国它乡而产生的紧张与不安，并在很大程度上加速了我对新环境的适应。 在熟悉了新实验室之后，Marianne 教授耐心的给我讲解了 Epigenetic Editing 系统的理 论知识和技术路线，使我很快就理解了所要进行课题的目的与意义，为课题能尽快 走上正轨奠定了很好的基础。 通过每次与 Marianne 教授的交谈或例会，使我逐渐开 拓了研究视野，潜移默化间培养了独立进行科学研究的能力，同时也让我在相对陌 生的环境中对自己有了更加清晰的认识。除了科研之外，Marianne 教授还经常关心 我的生活，并多次邀请我到其家中做客，让我倍感温暖的同时，也让我们的关系提 升到亦师亦友的境界。 在此，我要再次衷心的对徐老师和 Marianne 教授说，谢谢你们所做的一切！ 衷心感谢论文审阅委员会的 Jeltsch 教授、Plosch 教授和胡萍教授，感谢你们对我 博士学位论文的认真评阅，以及所给予的宝贵意见和建议。 感谢徐老师实验室的沈学仁老师、杜雅蕊副研究员和目前在 UC Berkeley 进行博 士后研究的刘博师兄。作为实验室的管家，沈老师和蔼可亲，善于沟通。他将一切 都梳理的井井有条，实验室的良性运转很大程度上得益于其细致入微的工作。“家 有一老，如有一宝”这句话用在沈老师身上真是再合适不过，能够有他这样一位长 者为我们的课题提供后勤保障，真乃幸事也。杜雅蕊副研究员是我加入徐老师实验 室后的第一个领路人，她为人正直善良，心怀怜悯，我更习惯亲切的称其为小杜师姐， 我的许多实验技能都是由她亲自示范传授的。此外，从小杜师姐身上我也学到了做 事要干脆利落，对自己课题的进展要做到条理清晰，安排有序。在跟随小杜师姐学 习了一段时间的实验技能之后，徐老师安排我加入了由刘博师兄领导的关于 Cbx4 在 小鼠胸腺中功能的研究课题。刘博师兄风趣幽默，说话思维缜密且条理清晰，对实 验中遇到的问题有着敏锐的判断和独到的见解。每次与他讨论实验问题后总有如沐 春风、醍醐灌顶之感，也让我收获了做科研的思维方式。正是有了刘博师兄在这最 初两年中对我的指导和帮助，才为我后来在荷兰实验室开展自己课题的独立研究奠 定了良好基础。衷心感谢以上三位，祝你们身体健康，生活开心，一切遂愿！ 感谢我在荷兰进行博士阶段课题研究时的主要合作者 Marloes 博士和 Hinke 女士。 在刚到荷兰的前半年时间里，我主要参与 Marloes 博士的研究课题。在 Marloes 博士 的耐心指导下，我学习并掌握了锌指蛋白表达质粒的设计和构建，逆转录病毒的包 装和后续的细胞转导实验，为半年后开展我自己的课题储备了实验技能。感谢 Hinke 女士在后期我自己的课题开展之后所给予的大力协助。另外，还要特别感谢 Marloes 博士和 Pytrick 女士，感谢你们同意作为我博士学位答辩过程中的“Paranimfen”（“疯 狂伙伴”）。对于你们在帮助我准备答辩过程中所做的各项辅助工作，我在此深表 感激与谢意！感谢 EGE group 的其余成员，Marcel, Jelleke, Ieneke, Fahimeh, Christian, Rutger, David and Monique，在实验室中有了你们的陪伴，才为单调的科研生活增添 了许多精彩瞬间。 感谢我在上海进行博士阶段课题研究时的主要合作者薛建煌博士、陈国栋博士、 段一民博士、杨清林和张晓洁。感谢薛建煌博士和陈国栋博士在鉴定 CMD1 反应机 理方面所作的杰出工作，为该课题的后续进行打下了坚实的基础。感谢杨清林与张 晓洁在大量纯化 Cas9 蛋白上所做的重要努力，正是有了高纯度与高活性的 Cas9 蛋 白，才为后续得到实验关键材料提供了保障。感谢段一民博士在制备 CMD1 过表达 藻株中所做的努力。还要特别感谢张晓洁和金子扬，谢谢你们在鉴定 CMD1 突变体 和 KU80 突变体中所做的贡献。正是有了以上各位富有成效的工作，才令整个研究工 作不断顺利推进。另外，还要感谢衣藻小组中的其他成员，夏维、许路昂和范强强， 感谢你们在课题进行过程中所给予的各种帮助和建议。 特别感谢中科院水生生物学研究所的黄开耀教授、中科院植物所的杨文强研究 员，以及清华大学的潘俊敏教授在课题进行过程中所给予的指导和实验材料的馈赠。
Appendix 4 感谢徐老师实验室已经毕业离开的林毅晖、吴海平、李滨忠、胡佳磊、刘鹏、黄晸、 王旸、胡晓、崔庆岩、顾天鹏、张磊、张润瑞、郭帆、毛石清、李筝、李彤、代海强、 陈甲甲和程时颂，你们出色的工作为实验室打下了良好的基础！感谢目前尚在徐老 师实验室的韩斌斌、徐骎、周添添、孙美玲、杨清林、王超、夏维、季智健、岑超超、 崔航远等师弟师妹，与你们相处轻松而融洽，祝愿你们做出更多更好的工作！另外， 我还要感谢目前徐老师组还在职的徐旨梅、高娟，以及已经离职的贺宇飞、谢志国、 徐煜、徐桂芳、刘伟、杜林、宋雪慧、魏熹啸和钟娜，感谢你们在工作和生活方面 给予的所有支持和帮助。非常有幸能与你们共事，生活中有了你们的陪伴，才显得 更加丰富多彩！祝你们一切顺利！ 最后，我要衷心地感谢我的家人。感谢我的父母，你们含辛茹苦的将我养大，供 我接受教育并始终给我自己发展的空间，你们无微不至的关怀使得我能全身心投入 到科研工作中，养育之恩，终生难报。感谢我的岳父岳母，你们不仅将唯一的女儿 许配给我，还始终默默地支持着我。我还要特别感谢我的妻子陈舒，八年来她始终 无怨无悔的支持着我，与我共同分担着生活的甜蜜与痛苦。你的相濡以沫支撑着我 最终完成自己的学业，感激之情无以言表，相信我们今后的生活会更美好。最后， 还要感谢我那两个可爱的孩子，快四岁的哥哥和一岁多的妹妹。你们是上天赐给我 最珍贵的礼物，让你们健康快乐成长是我生活中永远的动力来源。 谨以此论文献给我的家人。 陈 辉 2020 年 2 月 26 日于上海
