University of Groningen
Omega transaminases: discovery, characterization and engineering
Palacio, Cyntia Marcela
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Palacio, C. M. (2019). Omega transaminases: discovery, characterization and engineering. Rijksuniversiteit Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Samenvatting en perspectief
7
SAMENVATTING
Aminotransferases, oftewel transaminases, zijn enzymen die de reversibele overdracht van aminogroepen van een amine donor naar een keton- of aldehyde acceptor katalyseren. Deze enzymen vervullen een belangrijke rol in het natuurlijke metabolisme van aminozuren en amines, maar ze hebben ook vele reeds bekende en potentiële toepassingen in het veld van biokatalyse. De asymmetrische conversie van een keton naar een chiraal amine is van bijzonder belang, omdat de chirale amines vaak voorkomen als bouwsteen in bioactieve stoffen. Een bijzonder voorbeeld is bloedglucose regulerende geneesmiddel sitagliptine, dat gesynthetiseerd wordt door middel van een combinatie van chemokatalytische en biokatalytische reactiestappen, waaronder een transaminase gemedieerde stap die een amine functionaliteit introduceert en daarbij een chiraal centrum creëert (1). Het vervangen van chemische amineringsreacties door enzymatische transaminering in meerstaps synthetische routes is interessant omdat het vaak de productopbrengst verbetert, de hoeveelheid afval vermindert, het energieverbruik reduceert en het hele productieproces vereenvoudigt (2). Ondanks dat sommige natuurlijke transaminases bijzonder goed werken, is het een uitdaging transaminases breder toepasbaar te maken voor industriële processen. De enzymstabiliteit die nodig is voor hoge reactietemperaturen en zware omstandigheden, zoals intensief roeren, kan onvoldoende zijn. In andere gevallen is een breder substraatbereik nodig, en proces-strategieën die evenwichts-problemen verhelpen kunnen nodig zijn om transaminases die in het laboratorium ontwikkeld zijn in de industrie toe te passen. Deze thesis beschrijft het verkennen van eigenschappen van bekende en nieuwe transaminases en het vaststellen van de mogelijkheden en beperkingen van hun gebruik in de biokatalyse. Kwesties die onderzocht worden zijn: enzymstabiliteit, het effect van gekoppelde enzymreacties op het netto reactie-evenwicht, en de structurele en katalytische eigenschappen van een nieuw klasse III transaminase.
In hoofdstuk 2 en 3 beschrijven we de ontdekking van een nieuw ω-transaminase genaamd PjTA in een stam van de gram-negatieve bacterie Pseudomonas jessenii. Deze stam is geïsoleerd op basis van zijn mogelijkheid om caprolactam als groeisubstraat te gebruiken. Het PjTA enzym behoort tot de groep van type I PLP enzymen, in het bijzonder tot de klasse III transaminases. Het enzym katalyseert de deaminering van 6-aminohexaanzuur tot 6-oxohexaanzuur, en is geïdentificeerd door proteoom-profilering van genen die geïnduceerd worden tijdens groei van de bacterie met caprolactam als groeisubstraat, waarbij de genoom-sequentie van de bacterie is gebruikt om het complete gen van het nieuwe transaminase te identificeren.
De genoom-sequentie is tevens gebruikt voor het opsporen van genclusters waarin andere genen zijn gelegen die betrokken zijn bij de afbraak van caprolactam in P.
jessenii. Vervolgens toonde het doorzoeken van databases met genoomsequenties aan
dat een Pseudomonas mosselii stam die ook caprolactam kan afbreken beschikt over genen die sterk verwant zijn aan de caprolactam-afbraak genclusters die wij vonden in
P. jessenii (3). Dit wijst erop dat dezelfde afbraakroute voor caprolactam aanwezig is in
beide stammen. Tevens bleek uit het doorzoeken van databases met eiwitsequenties dat enzymen die sterk lijken op PjTA aanwezig zijn in diverse andere Pseudomonas stammen’ Het vermogen lactamen of cyclische peptiden te metaboliseren lijkt niet ongewoon te zijn bij Pseudomonas bacteriën.
Gedurende de studie van bacteriële caprolactam afbraak door P. jessenii hebben we ontdekt dat een ATP-afhankelijk lactamase betrokken is bij de eerste reactiestap: omzetting van caprolactam naar 6-aminohexaanzuur (hoofdstuk 2). Dit product kan vervolgens worden gedeamineerd door de genoemde transaminase. De sequentie-analyse liet zien dat het afhankelijke caprolactamase behoort tot de ATP-afhankelijke carboxylases/lactamase superfamilie (4), en dat dit enzym verder lijkt op eiwitten die zijn geannoteerd als 5-oxoprolinase of hydantoinase. Andere genen die worden verondersteld een rol te spelen bij de afbraakroute voor caprolactam werden ook ontdekt, met functies bij stappen die volgen op de deaminering van 6-aminohexaanzuur. Proteoom-studies, sequentie vergelijking en (in het geval van de lactamase en transaminase) en functionele expressie werden gebruikt om de enzymen te identificeren.
De eigenschappen van het PjTA transaminase zijn verder onderzocht in hoofdstuk 3, door gebruik te maken van enzymen die recombinant tot expressie worden gebracht in E. coli. Structuur-studies en sequentie-vergelijking wijzen erop dat het nieuwe ω-transaminase inderdaad behoort tot de subgroep AT-II, klasse III aminotransferases van de “fold-type I” superfamilie van PLP enzymen. Verder liet vergelijking van de kristalstructuren van PjTA met de goed bestudeerde ω-transaminases van
Chromobacterium violeaceum (CvTA) en Vibrio fluvialis (Vf TA) en de recent gevonden
structuur uit Ochrobactrum anthropi (OaTA) zien dat de algehele structuur en actieve gebieden goed geconserveerd zijn.
Studies naar de activiteit van PjTA met als substraten de tussenproducten van caprolactam-afbraak 6-aminohexaanzuur (6-ACA) en 6-oxohexaanzuur (6-OHA), lieten zien dat PjTA een betere biokatalysator is voor deze stoffen in vergelijking tot de homologe ω-transaminases CvTA en Vf TA. Kinetische studies toonden aan dat de specificiteitsconstante (kcat/KM) voor 6-ACA en 6-OHA respectievelijk 2-20 keer en 25 keer beter waren voor het PjTA enzym. Dit wijst erop dat het PjTA enzym verder heeft kunnen evolueren voor efficiënte deaminering van het 6-aminohexaanzuur tussenproduct. Vergelijking van de structuren van de drie enzymen laat geen grote of globale verschillen zien die duidelijk maken waarom PjTA een betere activiteit heeft voor 6-ACA. Echter, een potentieel belangrijk verschil is zichtbaar in de tunnelachtige actieve plek dicht bij het reactieve centrum van het enzym. Hier maakt de 6-ACA carboxylaat groep van het externe aldimine tussenproduct een zoutbrug met een geconserveerd arginine
7
residu, Arg417. Het is bekend dat arginine conformationele veranderingen ondergaat in homologe enzymen, waardoor zowel een hydrofobe interactie kan aangaan met alkyl- of aromatische groepen van amine donoren alsook een elektrostatische interactie met een carboxyl groep van een acceptor zoals pyruvaat. In het geval van PjTA komt daar nog een andere interactie bij: de arginine 417 vormt een zoutbrug met de carboxyl groep van 6-ACA, hetgeen een meer naar buiten gerichte positie van de arginine iminium vereist dan mogelijk is in CvTA en Vf TA, omdat bij de twee laatstgenoemde enzymen een grote Phe in de weg zit. In PjTA is deze Phe vervangen door de veel kleinere Ser, hetgeen de herpositionering van de arginine en daarmee een interactie met de carboxyl groep van 6-ACA mogelijk maakt.
Kinetische experimenten lieten zien dat een hoge concentratie van 6-OHA een remmend effect zou kunnen hebben op de PjTA transaminase. Men vermoedt dat een dergelijke substraat-remming bij transaminases wordt veroorzaakt door de binding van de aldehyde acceptor aan de PLP vorm van het enzym, concurrerend met de amine donor. Remming door de amine donor is ook mogelijk, in dat geval door binding van het substraat aan de reeds geamineerde (PMP bevattende) vorm van het enzym. Ondanks dat het problematisch zou kunnen zijn voor toepassingen van transaminases in bij biokatalytische processen, verwachten we dat het enzym wanneer het is geïncorporeerd in een in vivo reactiepad bij lage concentraties werkt. Dan zijn expressie-niveaus, stabiliteit en selectiviteit de belangrijkste factoren die de prestaties bepalen.
De studies aan het substraatbereik in hoofdstuk 3 laten ook zien dat PjTA een voorkeur heeft voor aromatische substraten, zoals eerder gevonden voor CvTA en
Vf TA (5). Toen lineaire substraten werden getest, liet PjTA een hogere katalytische
efficiëntie zien met 4-aminobutaanzuur dan met het lineaire substraat 1-aminopentaan. De oorzaak van deze verbeterde activiteit zou kunnen zijn dat de flexibele Arg417 bij het aktieve centrum van PjTA de carboxyl groep van 4-aminobutaanzuur herkent (6). Daarentegen vertoonden CvTA en Vf TA de beste activiteit met 1-aminopentaan. Dit is mogelijk gerelateerd aan verschillen in de moleculaire omgeving rond Arg417 in deze transaminases. Toekomstige studies die gericht zijn op het veranderen van de PjTA selectiviteit zouden kunnen kijken naar het vervangen van residuen rondom deze arginine. Een andere eiwit “engineering target” is de stabiliteit van het enzym. We hebben waargenomen dat het enzym vrij snel aktiviteit verliest onder verschillende condities, zoals opslag bij -20˚C of bij 4˚C in 50 mM kaliumfosfaat, pH 8, met 10% glycerol.
Het verbeteren van de stabiliteit van het PjTA enzym is onderzocht in hoofdstuk 4. We wilden gebruik maken van de zgn. FRESCO strategie, d.w.z. computergestuurd ontwerp en in silico screening om op zoek te gaan naar een versie van PjTA met verbeterde themostabiliteit zonder arbeidsintensieve screening in een laboratorium. Daarbij werden moleculaire dynamica (MD) simulaties onderzocht als instrument om de relatief flexibele oppervlakte gebieden in PjTA te vinden. Deze gebieden zouden
betrokken kunnen zijn bij vroege ontvouwing van het enzym, waardoor hydrofobe gebieden bloot komen te liggen, hetgeen leidt tot aggregatie en onomkeerbare inactivatie van het enzym. Omdat MD alleen naar oppervlakte flexibiliteit kijkt, werden diepgelegen residuen en interface residuen die betrokken zijn bij interacties tussen de subeenheden van het enzym niet meegenomen in deze analyse.
Door middel van deze aanpak is een verzameling van 96 verschillende PjTA mutanten ontworpen, elk met een enkele oppervlak-mutatie. Posities in delen van het eiwit waar op grond van MD-resultaten mutaties waarschijnlijk een stabiliserend effect kunnen hebben, zijn gekwalificeerd als hoge prioriteit posities; posities in gebieden die geen hoge flexibiliteit vertonen bij hoge temperatuur MD simulaties werden lage prioriteit posities genoemd. Van de 96 ontworpen mutanten werden er 64 geproduceerd en verkregen als gemuteerd PjTA enzym in oplosbare vorm. Hieronder waren 51 mutanten met aanpassingen op 29 hoge prioriteit posities, en 13 mutanten met aanpassingen op lage prioriteit posities. De stabiliteit van de mutanten is bepaald door met behulp van fluorescentie-metingen de ontvouwing van de enzymen te volgen bij oplopende temperatuur. De resultaten lieten zien dat de stabiliteit matig was verbeterd bij slechts een klein aantal varianten. De meeste mutaties waren neutraal of nadelig, maar vijf mutanten lieten een verbetering van thermostabiliteit zien van meer dan 1˚C in TM,app. Deze vijf mutanten hadden allen een mutatie in gebieden met relatief hoge flexibiliteit bij de MD-simulaties en de betreffende posities waren dus terecht gekozen als posities met hoge prioriteit. De positieve opbrengst van 11% (5/46, 46 van de 51 mutaties waren op posities met hoge prioriteit volgens het FRESCO-protocol, 5 waren van alternatieve striktere energiecriteria) is lager dan eerder gerapporteerd door Wijma et al. 2014 (7).
Vier van de vijf gestabiliseerde mutanten lieten een gereduceerde katalytische activiteit zien; deze inverse relatie is eerder waargenomen tussen stabiliteit en functie (8, 9). Door te kijken naar de structuur werden mogelijke verklaringen gevonden voor de gereduceerde activiteit. De stabiliserende M419L mutatie bijvoorbeeld bevindt zich dichtbij het tunnelvormige actieve centrum van het enzym en dit kan invloed hebben op substraat-toegang en -binding, resulterend in reductie van enzymactiviteit. Eén mutant, A393R, liet een stijging van 30% zijn in katalytische activiteit zien, waarvoor geen duidelijke verklaring is. De complexiteit van de katalytische cyclus, met twee halfreacties, elk met meerdere chemische stappen, maakt het moeilijk om effecten op de reactiesnelheid te correleren met de aard van de mutatie.
Twaalf niet-stabiliserende mutaties werden ontdekt in locaties met hoge prioriteit en vier van deze leken aanzienlijk destabiliserend, hetgeen kan worden verklaard door het introduceren van hydrofobe groepen aan het eiwitoppervlak. Dit soort substituties worden vaker voorspeld door FRESCO, voornamelijk door de onderliggende Rosetta energie-berekeningen, en kunnen eenvoudig worden weglaten bij het testen in het laboratorium.
De resultaten lieten zien dat een mutatie-strategie waarbij veranderingen worden
7
aangebracht op posities die met hoge-temperatuur MD simulaties worden geïdentificeerd als gunstig of kansrijk, duidelijk potentieel heeft om gebieden te identificeren waar stabiliserende mutaties moeten worden toegepast. Echter, de resultaten met PjTA zijn niet spectaculair. Recente resultaten uit ons laboratorium (10) en observaties met een tetrameer halohydrin dehalogenase (11) wijzen erop dat mutaties die de interacties tussen de subeenheden van het enzym stabiliseren ook met de computer kunnen worden ontworpen. Een studie met een aminotransferase uit een metagenoom-bibliotheek (12) toonde aan dat ook mutaties die cofactor-binding verbeteren een groot positief effect kunnen hebben op de stabiliteit. De voordelen van het gebruik van hoge temperatuur moleculaire dynamica simulaties om prioriteitsgebieden te vinden voor stabiliserende mutaties zouden veel duidelijker kunnen zijn bij monomere enzymen.
Ten slotte beschrijven we in hoofdstuk 5 een biokatalytisch netwerk met drie enzymen voor de conversie van de ether alcoholen butyldiglycol (een primair ether alcohol) en 1-butoxy-2-propanol (een secundair ether alcohol) naar de corresponderende amines. Dit enzym-netwerk voor conversie van alcoholen naar amines is samengesteld uit een alcohol dehydrogenase van Geobacillus stearothermophilus, het transaminase van
C. violaceum dat ook gebruikt is in hoofdstuk 3 (CvTA), en een alanine dehydrogenase
afkomstig van Vibrio proteolyticus. De drie enzymen werden in E. coli tot overexpressie gebracht en gezuiverd. Drie met elkaar verbonden reacties, namelijk alcohol oxidatie, L-alanine-gedreven carbonyl aminering en reductieve pyruvaat animering met ammonia, zijn uitgevoerd in een één-pot-systeem, waardoor productie van de gewenste amine en tegelijkertijd recycling van de alcohol dehydrogenase cofactor NAD+ en de amine donor
L-alanine plaatsvindt. De netto reactie is dus: alcohol en ammonia geven organische amine en water, wat in zijn geheel een zeer aantrekkelijke conversie is, omdat er geen gebruikt wordt gemaakt van reducerende cofactoren of een organische amine donor. Verschillende concentraties van alcohol, ammonium en alanine werden getest om de opbrengst van amine te verbeteren tot 40%. De optimalisatie liet zien dat geen van de substraten kon worden toegevoegd in hoge initiële concentraties vanwege een remmend effect (alanine en het alcohol substraat) of een negatief effect op de stabiliteit van de enzymen (ammonium).
Het thermodynamisch evenwicht van het aminering netwerk met drie enzymen was een andere belangrijke factor die de maximale mate van conversie bepaalde, in overeenstemming met eerdere studies (13). Derhalve werden evenwichtscontanten berekend met de experimentele data volgens de Goldberg notatie (14). De resultaten lieten zien dat voor de eerste reactie, van alcohol naar keton of aldehyde, het evenwicht in de ongewenste richting van de alcohol is. Ook de evenwichtsconstante van de transaminering-reactie is ongunstig voor de productie van amine, met het evenwicht sterk aan de zijde van de substraten keton (of aldehyde) en L-alanine. Aan de andere kant laat de alanine dehydrogenase-gekatalyseerde recycling reactie, die de amine donor alanine en de elektron acceptor NAD+ regenereert, een gunstige evenwichtsconstante
zien. Deze laatste reactie stuwt dus het enzymatische netwerk tot de productie van amine, en zal dat beter doen bij hogere concentraties ammonium.
Vervolgens hebben we theoretisch naar het algehele reactie-evenwicht gekeken als functie van substraatconcentraties. De resultaten lieten zien dat een hoge concentratie (≥ 0.7 M) van de amine donor ammonium benodigd is om een goede conversie (>90%) te bereiken. Daarom werd een reeks verschillende ammonia concentraties (80 mM tot 1 M) getest in het laboratorium. Wanneer een totale concentratie van 280 mM ammonium werd gebruikt, verbeterde de conversie van 40% naar 60%. Hiervoor was een stapsgewijze toevoeging van ammonium nodig, omdat de enzymen precipiteerden of aggregeerden wanneer een hoge concentratie ammonium in één keer werd toegevoegd. De resultaten wezen er opnieuw op dat verbeteren van de enzymactiviteit en stabiliteit, nu in de aanwezigheid van hoge concentraties ammonium en zout, een belangrijk toekomstig doel is.
PERSPECTIEF
Transaminases hebben goede eigenschappen voor gebruik als katalysator, zoals acceptatie van een breed scala aan substraten en een hoge product enantioselectiviteit bij asymmetrische conversies. Niettemin moeten beperkingen door een ongunstig evenwicht, lage thermische en proces-stabiliteit en lage activiteit met sommige substraten worden opgelost om een bredere toepassing in duurzame productie van amines mogelijk te maken. Naast ontdekking van nieuwe natuurlijke transaminase varianten, die een breder bereik aan conversies mogelijk maakt, komen enkele specifieke doelstellingen en strategieën voort uit het hier beschreven werk.
In hoofdstuk 4 hebben we geprobeerd de thermostabiliteit van de PjTA transaminase te verhogen met behulp van de computergestuurde FRESCO-strategie, vooral met het doel om te onderzoeken of MD simulaties kunnen helpen bij het bepalen van posities in het eiwit waar mutaties succesvol zijn. De gerichte mutaties aan het eiwitoppervlak, waar MD prioriteit gebieden aangaf, gaven echter matige verbeteringen. Om robuuste varianten van het transaminase te verkrijgen is het aan te raden de aandacht te verschuiven van het muteren van oppervlakte residuen naar het aanbrengen van mutaties die de interacties tussen de subeenheden van het enzym verbeteren. Dergelijke mutaties aan het raakvlak kunnen de interacties tussen de monomeren versterken, waardoor de thermostabiliteit van het enzym zal toenemen wanneer dissociatie van de subeenheden een rol speelt bij de inactivatie. Hayeshi et
al. (15) hebben laten zien dat een dimeer D-aminozuur transaminase hogere stabiliteit
en katalytische efficiëntie had wanneer een tryptofaan aan het raakvlak tussen twee subeenheden werd vervangen door een fenylalanine. Recente experimenten in ons laboratorium duiden erop dat computergestuurd ontwerp van mutaties op het raakvlak
7
van de subeenheden van PjTA inderdaad erg effectief is (10). Zoals hierboven genoemd, suggereert het werk van Börner et al. (16) dat ook mutaties die de binding van de PLP cofactor verbeteren de stabiliteit kunnen verhogen. Ook dergelijke mutaties kunnen waarschijnlijk worden voorspeld met behulp van computerberekeningen.
In hoofdstuk 5 hebben we vastgesteld dat zowel stabiliteit van de enzymen als het evenwicht van een amineringsreactie punten van aandacht zijn bij het ontwerpen van een transaminase-gekatalyseerd proces gebaseerd op een netwerk van meerdere enzymen. Alhoewel niet getest in deze thesis, is immobilisatie een van de meest bestudeerde strategieën om stabiliteit van enzymen te verbeteren onder procescondities. Deze strategie wordt breed toegepast omdat immobilisatie kan leiden tot aanzienlijke verbetering van operationele prestaties van biokatalyse. Koszelewski et
al. (17) lieten bijvoorbeeld zien dat de optimale temperatuur van het transaminase
TA-117 toenam van 30˚C naar 40-50˚C wanneer het enzym geïmmobiliseerd is als colloïdale sol-gel. Immobilisatie biedt ook de mogelijkheid tot hergebruik van de biokatalysator in verschillende cycli, zelfs bij hogere temperaturen. Neto et al. (18) lieten zien dat een op vast substraat geïmmobiliseerde ω-transaminase tot 8 cycli van 24 uur kan worden hergebruikt, terwijl het 50% van de originele activiteit behoudt. Deze aanpak zou kunnen helpen om de stabiliteit van de enzymen te verbeteren en om complete multi-enzymatische netwerken te hergebruiken.
Een andere manier om de stabiliteit van transaminases te verbeteren is door gebruik te maken van complete cellen, iets wat in deze thesis ook niet is onderzocht. Het gebruik van hele cellen in de biokatalyse is een veelbelovende strategie, omdat stabiliteit van de enzymen wordt verbeterd en toevoegen van cofactoren onnodig is, met als gevolg dat netwerk reacties zoals omschreven in hoofdstuk 5 economisch aantrekkelijker worden. Klatte et al. (19, 20) hebben een aminering van alcoholen met behulp een netwerkreactie die lijkt op wat is omschreven in hoofdstuk 5 laten zien. Zij gebruikten
E. coli cellen die drie enzymen overproduceerden: transaminase, alcohol dehydrogenase
en alanine dehydrogenase.
Een grote uitdaging bij het ontwerpen van een reactie met ω-transaminases is het ongunstige thermodynamisch evenwicht van de reactie (21), zoals omschreven in hoofdstuk 5. Een veel gebruikte strategie is om het evenwicht te verschuiven door een overmaat van een van de substraten te gebruiken. Truppo et al. (22) hebben laten zien dat een grote overmaat van de amine donor isopropylamine met acetofenon als amine acceptor resulteerde in een conversie van 95%. Hoewel het eenvoudig lijkt deze strategie te implementeren, is een belangrijk aspect dat de activiteit van het enzym verlaagd kan worden door substraat-inhibitie of zelfs ontvouwing van het enzym wanneer een grote hoeveelheid substraat wordt toegevoegd. Dit laatste effect kan alle enzymen in het multi-enzymatische netwerk beïnvloeden, en ook uitzout-effecten kunnen optreden bij hoge substraatconcentraties. De keuze van de amine donor zal ook invloed hebben op de positie van het thermodynamisch evenwicht.
Ten slotte is de verwijdering van een product of co-product een andere methode om het evenwicht van transaminase-gemedieerde reacties te verschuiven. Dit kan worden bereikt door bijvoorbeeld het continue fysisch scheiden van de producten van het reactiemengsel, zoals door verdamping van aceton wanneer isopropylamine wordt gebruikt als amine donor (23); of door het ontwerpen van cascade reacties (24), zoals het hergebruik van de amine acceptor pyruvaat terug naar alanine (zie hoofdstuk 5), de conversie van pyruvaat naar lactaat door een dehydrogenase of de enzymatische decarboxylering van pyruvaat.
7
REFERENTIES
1. Savile CK, Janey JM, Mundorff EC, Moore JC, Tam S, Jarvis WR, Colbeck JC, Krebber A, Fleitz FJ, Brands J, Devine
PN, Huisman GW, Hughes GJ. 2010. Biocatalytic asymmetric synthesis of sitagliptin manufacture. Science 329:305–
310.
2. Malik MS, Park E, Shin J. 2012. Features and technical applications of ω-transaminases. Appl Microb Biotechnol
94:1163–1171.
3. Hong S-J, Park G-S, Khan AR, Jung BK, Shin J-H. 2016. Draft genome sequence of a caprolactam degrader bacterium:
Pseudomonas taiwanensis strain SJ9. Braz J Microbiol 69:2015–2016.
4. Weidenweber S, Schühle K, Demmer U, Warkentin E, Ermler U, Heider J. 2017. Structure of the acetophenone carboxylase core complex: prototype of a new class of ATP-dependent carboxylases / hydrolases. Sci reports 7:1–10. 5. Kaulmann U, Smithies K, Smith MEB, Hailes HC, Ward JM. 2007. Substrate spectrum of ω-transaminase from
Chromobacterium violaceum DSM30191 and its potential for biocatalysis. Enzyme Microb Technol 41:628–637.
6. Steffen-Munsberg F, Vickers C, Thontowi A, Schätzle S, Meinhardt T, Svedendahl Humble M, Land H, Berglund
P, Bornscheuer UT, Höhne M. 2013. Revealing the structural basis of promiscuous amine transaminase activity.
ChemCatChem 5:154–157.
7. Wijma HJ, Floor RJ, Jekel PA, Baker D, Marrink SJ, Janssen DB. 2014. Computationally designed libraries for rapid enzyme stabilization. Protein Eng Des Sel 27:49–58.
8. Poole LB, Loveys DA, Hale SP, Gerlt JA, Stanczyk SM, Bolton PH. 1991. Deletion of the omega-loop in the active site of staphylococcal nuclease. 1. Effect on catalysis and stability. Biochemistry 30:3621–7.
9. Gleason FK. 1992. Mutation of conserved residues in Escherichia coli thioredoxin: Effects on stability and function. Protein Sci 1:609–616.
10. Q. Meng, C. Palacio, H.J. Wijma EL. Robust ω-transaminases by computational stabilization of subunit interfaces. In preparation.
11. Arabnejad H, Lago MD, Jekel PA, Floor RJ, Thunnissen AWH, Scheltinga ACT Van, Wijma HJ, Janssen DB. 2017. A robust cosolvent-compatible halohydrin dehalogenase by computational library design. Protein Eng Des Sel 30:175– 189.
12. Börner T, Bartsch S, Vogel A, Adlercreutz P, Grey C. 2017. Three in one: temperature, solvent and catalytic stability by engineering the cofactor-binding element of amine transaminase. ChemBioChem 18:1482–1486.
13. Höhne M, Kühl S, Robins K, Bornscheuer UT. 2008. Efficient asymmetric synthesis of chiral amines by combining transaminase and pyruvate decarboxylase. ChemBioChem 9:363–365.
14. Goldberg PW, Roth A. 2014. Bounds for the query complexity of approximate equilibria. ACM 8:639–656.
15. Hayashi H, Inoue Y, Kuramitsu S, Morino Y, Kagamiyama H. 1990. Effects of replacement of tryptophan-140 by phenylalanine or glycine on the function of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochem Biophys Res Commun
167:407–412.
16. Börner T, Rämisch S, Reddem ER, Bartsch S, Vogel A, Thunnissen A-MWH, Adlercreutz P, Grey C. 2017. Explaining operational instability of amine transaminases: Substrate-induced inactivation mechanism and influence of quaternary structure on enzyme–cofactor intermediate stability. ACS Catal 7:1259–1269.
17. Koszelewski D, Müller N, Schrittwieser JH, Faber K, Kroutil W. 2010. Immobilization of ω-transaminases by encapsulation in a sol-gel/celite matrix. J Mol Catal B Enzym 63:39–44.
18. Neto W, Schürmann M, Panella L, Vogel A, Woodley JM. 2015. Enzymatic immobilisation of ω-transaminase for industrial application: Screening and characterisation of commercial ready to use enzyme carriers. J Mol Catal B Enzym
117:54–61.
19. Klatte S, Wendisch VF. 2015. Role of L-alanine for redox self-sufficient amination of alcohols. Microb Cell Fact 14:1–10. 20. Klatte S, Wendisch VF. 2014. Redox self-sufficient whole cell biotransformation for amination of alcohols. Bioorg Med
Chem 22:5578–5585.
21. Höhne M, Brundiek H. 2016. Transaminases – A Biosynthetic Route for Chiral Amines, p. 4–451. In Lutz Hilterhaus, Andreas Liese, Ulrich Kettling, and GA (ed.), Applied Biocatalysis From From Fundamental Science to Industrial ApplicationsFirst. Wiley-VCH.
22. Truppo MD, Rozzell JD, Moore JC, Turner NJ. 2009. Rapid screening and scale-up of transaminase catalysed reactions. Org Biomol Chem 7:395–398.
23. Park E, Dong J, Shin J. 2013. ω-Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of unnatural amino acids using isopropylamine as an amino donor. RSC oublishing 11:6929–6933.
24. Simon RC, Richter N, Busto E, Kroutil W. 2014. Recent developments of cascade reactions involving ω-transaminases. ACS Catal 4:129–143.
