Phenotypic variation in Bacillus subtilis Veening, Jan-Willem
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2007
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Veening, J-W. (2007). Phenotypic variation in Bacillus subtilis: bistability in the sporulation pathway. s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Nederlandse samenvatting
Bistabiele cellulaire differentiatie komt algemeen voor in de natuur. Bistabiliteit houdt in dat binnen een populatie van organismen die genetisch identiek zijn (bijvoorbeeld stamcellen tijdens embryonale ontwikkeling of bacteriën in een reageerbuis), er verschillende fenotypen te onderscheiden zijn. Zo zal de ene stamcel differentiëren in bijvoorbeeld een zenuwcel, terwijl een andere stamcel zich ontwikkelt tot een spiercel.
Beide cellen hebben hetzelfde DNA en zijn dus genetisch identiek, maar het fenotype van beide cellen is totaal verschillend. Om achter de moleculaire mechanismen te komen die bistabiele differentiatie en dus fenotypische variabiliteit dicteren, hebben we voor dit proefschrift gebruik gemaakt van de Gram-positieve bacterie Bacillus subtilis.
B. subtilis is een veelvoorkomende bacterie (vooral in bodemmonsters), is staafvormig en kan onder specifieke condities differentiëren en sporen vormen (zie Hoofdstuk 1, figuur 1). Binnen een isogene culture van B. subtilis cellen (die dus genetisch identiek zijn) is er een deel van cellen dat wel sporen vormt en een deel dat geen sporen maakt. Hoe genetisch identieke cellen in dezelfde omgeving differentiëren tot radicaal verschillende celtypes is intensief bestudeerd, maar de achterliggende moleculaire mechanismen zijn redelijk onbekend. Sporulatie in B. subtilis wordt aangestuurd door de zogenaamde ‘phosphorelay’. De phosphorelay is een aaneenschakeling van eiwitten die omgevingssignalen omzet en vertaalt. De uiteindelijke output van de phosphorelay culmineert in fosforylatie van Spo0A, de belangrijkste transcriptiefactor voor sporulatie-gerelateerde processen. Wanneer Spo0A gefosforyleerd wordt, kan het DNA binden en transcriptie van meer dan 100 genen activeren of onderdrukken. Veel adaptieve processen, zoals competentie voor DNA-opname, secretie en biofilm- formatie, hebben de sporulation-phosphorelay geïntegreerd in hun gen-netwerk.
Daarom is het werk in dit proefschrift niet alleen gespitst op sporeformatie, maar hebben we gekeken naar de algemene (heterogene) output van de phosphorelay (zogenaamde phosphorelay-heterogeniteit).
Om elementen te identificeren die phosphorelay-heterogeniteit beïnvloeden, hebben we gebruik gemaakt van een combinatie van genetische, biochemische en microscopische technieken. Hiermee hebben we gekeken naar groei, celdeling, genexpressie en differentiatie in individuele cellen en cellen binnen biofilms. Dit proefschrift beschrijft enkele moleculaire mechanismen die bistabiliteit tijdens sporulatie veroorzaken.
Initiatie van sporulatie is heterogeen
Het was al lang bekend dat binnen isogene B. subtilis cultures niet alle cellen hetzelfde fenotype ten toon stellen en dat sommige cellen sporuleren, terwijl anderen dat niet doen (Schaeffer et al., 1965; Dawes and Thornley, 1970). In 1994 werd de eerste ‘single cell study’ (experimenten waar specifiek naar genexpressie van individuele cellen wordt gekeken in plaats van naar gemiddelde genexpressie van een hele culture) gepubliceerd op het gebied van sporulatie-heterogeniteit, maar dit werk heeft geen serieuze navolging gehad in het veld (Chung et al., 1994). Een van de redenen hiervoor is een gebrek aan bruikbare methoden destijds. Het gebruik van het Green Fluorescent Protein (GFP) en spectrale varianten hiervan, zoals de Cyan en Yellow Fluorescent Proteins (CFP en YFP), maakt het mogelijk om ‘single cell’
analyses te doen. Het gen dat codeert voor GFP is oorspronkelijk geïsoleerd uit de kwal Aequoria victoria. Wanneer GFP geactiveerd wordt door blauw licht, emitteert het groen licht. Fusies met GFP maken het dus mogelijk om in levende cellen (zoals bacteriën) te kijken naar genexpressie of eiwitlokalisatie wanneer de cel aangeslagen wordt met blauw licht. Helaas was het in B. subtilis slechts beperkt mogelijk om CFP en YFP te gebruiken. Omdat de spectra van CFP en YFP elkaar nauwelijks overlappen, kunnen deze varianten tegelijkertijd in enkele cellen gebruikt worden om twee eiwitten of promotoren te bestuderen. Hoofdstuk 2 beschrijft de constructie van nieuwe varianten van CFP en YFP speciaal voor B. subtilis. De genen die coderen voor de originele CFP en YFP zijn voornamelijk geoptimaliseerd voor eukaryote- organismen. Hierdoor bleken transcriptionele fusies met deze genen niet goed te werken. Door een klein deel van een gen van B. subtilis (comGA) aan de oorspronkelijke sequenties van cfp en yfp te fuseren, werden de messenger-RNA’s van de nieuwe genen 20 tot 70 keer efficiënter vertaald in eiwit. Fusies met deze verbeterde varianten met de abrB- en spoIIA-promotoren lieten zien dat cellen die sporulatie initiëren (en spoIIA expresseerden) geen abrB expresseerden en vice versa (Veening et al., 2004). Dit toonde nogmaals aan dat sporulatie een heterogeen proces is.
Initiatie van sporulatie vertoont alle kenmerken van een bistabiele schakelaar
Theoretische modellen en experimenten in zowel prokaryoten en eukaryoten hebben aangetoond dat positieve feedback van een transcriptionele regulator, in combinatie met een non-lineaire response, kan leiden tot een bimodale distributie in expressie (Hasty et al., 2000; Becskei et al., 2001; Isaacs et al., 2003). Het wordt algemeen aangenomen dat stochastische fluctuatie (ruis of ‘noise’) in genexpressie er voor zorgt dat sommige cellen een drempelconcentratie van de regulator bereiken en daardoor een positieve feedbackloop aanzetten en meer regulator opbouwen. Deze cellen zullen dus ‘aan’ zijn, terwijl cellen die deze drempelwaarde niet bereiken ‘uit’ blijven (Ferrell, Jr., 2002; Rao et al., 2002). Vroegere studies in B. subtilis hebben al aangetoond dat
Samenvatting
spo0A geactiveerd kan worden door Spo0A~P en op die manier een auto- stimulatorische loop vormt (zie Hoofdstuk 3, figuur 1). Geïnspireerd door deze studies, vroegen we ons af of een constitutatief actieve variant van Spo0A (Spo0A*) in staat was een bistabiele activatie te laten zien in de aanwezigheid van autostimulatie.
Gebruik makend van dit artificiële systeem lukte het inderdaad om bij bepaalde concentraties van Spo0A* bistabiliteit in sporulatie-initiatie te laten zien. Wanneer autostimulatie verwijderd werd (door spo0A te muteren) was er geen sprake meer van bistabiliteit en cellen expresseerden de reporter voor initiatie van sporulatie in een lineair verband met Spo0A* inductie.
Deze experimenten lieten zien dat het sporulatie-netwerk alle intrinsieke voorwaarden heeft om aan een bistabiele schakelaar te voldoen en dat dit de geobserveerde fenotypische variabiliteit goed verklaart (Hoofdstuk 3).
Een zeer belangrijk resultaat van deze studie is dat sporulatie bistabiliteit actief bewaard wordt gehouden door zogenaamde phosphorelay-fosfatasen. Phosphorelay fosfatasen zijn eiwitten die fosfaatgroepen van eiwitten binnen de phosphorelay afnemen en op die manier zorgen voor een afname in Spo0A~P, de actieve vorm van de sporulatieregulator. RapA is een fosfatase die fosfaat afneemt van Spo0F~P, een phosphorelay-intermediair. Initieel expresseren alle cellen rapA via de ComA activatie route. Door bistabiliteit initieert een deel van de populatie sporulatie. Cellen die sporulatie niet initiëren blijven RapA accumuleren. Meer RapA betekent minder Spo0A~P. Dus cellen die sporulatie niet initiëren worden actief vertraagd om ook te gaan sporuleren door accumulatie van RapA. Deletie van rapA of spo0E (een andere fosfatase) resulteert in een afname van bistabiliteit en de meeste cellen zullen sporulatie initiëren. Deze resultaten laten zien dat B. subtilis meerdere paden gebruikt om sporulatie-bistabiliteit te behouden. Dit geeft aan dat sporulate-bistabiliteit een zeer belangrijk fysiologisch fenomeen is.
Ruis en ontwikkeling
Het is aangetoond dat wanneer ruis geamplificeerd wordt door positieve feedback, dit bistabiliteit kan veroorzaken (Kærn et al., 2005). Alle experimentele data wees erop dat zowel competentie als sporulatie bistabiele karakteristieken vertonen (Smits et al., 2005; Maamar and Dubnau, 2005; Fujita et al., 2005; Veening et al., 2005). Daarom vroegen wij ons af of beide processen ook onderhevig zijn aan ruis. Ruis is ongewild in gen-netwerken die homeostasis reguleren (Rao et al., 2002; Paulsson, 2004; Vilar et al., 2002; Barkai and Leibler, 2000). Voor adaptieve fenotypen zoals competentie of sporulatie kan ruis erg nuttig zijn om fenotypische variabiliteit te veroorzaken.
In Hoofdstuk 4 hebben we gedetailleerd naar competentie en sporulatie gekeken onder condities die normaal gesproken deze paden niet activeren. De rationele gedachte achter deze studie is dat als beide paden onderhevig zijn aan ruis, er altijd enkele cellen moeten zijn die deze gen-netwerken geactiveerd moeten hebben. Onze
experimenten lieten zien dat zowel competentie als sporulatie onderhevig zijn aan ruis.
Dit betekent dat een klein deel van de populatie zich niet houdt aan de algemene regels van gen-regulatie en toch competent wordt of sporen vormt onder condities die dit normaal gesproken niet stimuleren. Dit heeft verstrekkende implicaties voor de medische wereld en voedingsindustrie. Sommige pathogene bacteriën, zoals Streptococcus pneumoniea, hebben de mogelijkheid om competent te worden. Dit is een serieus probleem met de toenemende antibiotica-resistentie van deze micro- organismen. Sporen zijn extreem hitteresistent en kunnen ontzettend hydrofoob en
‘plakkerig’ zijn. Daarom zijn ook sporen een groot probleem voor de voedingsindustrie.
Sporen die het sterilisatieproces overleven kunnen ontkiemen in producten en uiteindelijk ziekte en bederf veroorzaken. Onze studie laat zien dat het deel wat competent wordt of sporuleert, beperkt kan worden onder bepaalde groeicondities, maar door het ruizige karakter van de gen-netwerken die deze processen bepalen, zullen er altijd cellen zijn die zich atypisch gedragen. Daarom moet toekomstig onderzoek uitwijzen wat de meeste ruis veroorzaakt in deze paden om op deze manier middelen te identificeren die deze ontwikkelingsroutes kunnen uitschakelen.
De rol van ouderdom en epigenetische overerving in sporulatie
Behalve ruis zijn intrinsieke fysiologische parameters zoals de cel-cyclus en celouderdom belangrijke componenten die fenotypische variabiliteit kunnen veroorzaken (Avery, 2006). Het is onbekend of sporulatie-bistabiliteit puur en alleen door toevalsprocessen veroorzaakt wordt of dat een van deze fysiologische parameters dit fenomeen veroorzaakt. Het is ook niet bekend hoever van tevoren, voordat de fenotypische verandering zich uit, de beslissing om te differentiëren wordt gemaakt. In Hoofdstuk 5 hebben we gebruik gemaakt van time-lapse microscopie op B. subtilis om individuele celgroei, -deling, -expressie en -differentiatie te meten en om te bestuderen in hoeverre deze elementen bijdragen aan dit proces. Hoofdstuk 5 laat zien dat B. subtilis aan ouderdom lijdt en bij toename in ouderdom van de celpool een verminderde groeisnelheid vertoont. Het is interessant om te benoemen dat de grootte van dit ouderdomseffect vergelijkbaar is met ouderdom in Escherichia coli en Caulobacter crescentus (Stewart et al., 2005; Ackermann et al., 2003). Deze observatie breidt de aanwezigheid van veroudering uit buiten de groep van de proteobacteriën waar E. coli en C. crescentus toe behoren naar de groep van de Gram-positieve bacteriën. Dit benadrukt de aanwezigheid van veroudering binnen alle takken van leven. Veroudering in B. subtilis lijkt geen bepalende factor te zijn in de keuze om te sporuleren of niet. Geen van de fysiologische parameters die we konden meten (celbreedte, lengte, groeisnelheid, geboortepunt) bleek bepalend te zijn. Dit suggereert dat de initiële beslissing die bepaalt of een cel sporuleert of niet stochastisch van aard is; in lijn met de gepresenteerde resultaten in Hoofdstuk 4.
Samenvatting
Wat wel belangrijk bleek is de afstamming van de cel. Wanneer een cel eenmaal de beslissing heeft gemaakt om te sporuleren, dan kan hij deze keuze doorgeven aan zijn nakomelingen via epigenetische overerving. Epigenetische overerving is de overerving van een fenotype zonder dat verandering is opgetreden in het genotype. Deze epigenetische overerving kan tot zes generaties uitstrekken. Dit houdt in dat de initiële stimuli om te sporuleren al aanwezig kan zijn tijdens exponentiële groei, ruim voordat de nutriënten op zijn. Omdat een verdunning van een statisch signaal in een dergelijk geval 64 maal kan zijn, moet het haast wel zo zijn dat een actief ‘geheugen’ het signaal bewaart.
De intrinsieke karakteristieken van het sporulatiesignaal transductiesysteem geeft mogelijke aanwijzingen hoe het signaal behouden kan worden. Het is voorgesteld dat autofosforylerende kinasen het potentieel hebben om te werken als ‘geheugen modules’. Een specifieke stimulus activeert de kinase en de regulator blijft in zijn actieve staat onafhankelijk van de aanwezigheid of afwezigheid van de stimulus (Lisman, 1985). De nakomelingen van cellen in de ‘aan’-staat zullen hierdoor ook in de
‘aan’-staat zijn omdat de geactiveerde kinase (epigenetisch) overerft. De ontwikkeling van bevruchte kikker (Xenopus) eicellen worden door een dergelijk systeem gereguleerd (Xiong and Ferrell, Jr., 2003). Met behulp van artificiële gen-netwerken in zowel E. coli als Saccharomyces cerevisiae is aangetoond dat dergelijke auto- stimulatorische systemen ook als geheugenmodules kunnen werken in micro- organismen (Gardner et al., 2000; Becskei et al., 2001). Het sporulatiesignaal in B.
subtilis zou onthouden kunnen worden door de positieve feedbackarchitectuur dat aanwezig is in de Spo0A-cascade. Deze cascade begint namelijk met de activatie van auto-fosforylerende kinasen zoals KinA en KinB. De aanwezigheid van positieve feedback alleen is niet genoeg om een geheugenmodule te vormen. Competentie voor DNA-opname in B. subtilis bijvoorbeeld, is ook een bistabiel systeem dat afhankelijk is van positieve feedback. In tegenstelling tot sporulatie lijkt er geen geheugen in het competentie-netwerk te zitten. Dit uit zich op de wijze dat de kans dat cellen competent worden niet groter of kleiner is als zustercellen ook competent zijn. (Suel et al., 2006).
De voordelen van geheugen in het sporulatiesignaal door epigenetische overerving zijn ingewikkeld. Het is aangetoond in bacteriën dat wanneer cellen een milde temperatuurshock krijgen, deze cellen beter voorbereid zijn op een zwaardere shock (Goldstein et al., 1990). Het zou dus kunnen zijn dat het doorgeven van het sporulatiesignaal de nakomelingen helpt om beter voorbereid te zijn op potentiële nutritionele limitaties in de toekomst. Deze nakomelingen kunnen dus sneller en efficiënter reageren en sporen vormen.
Onze studie is gedaan op B. subtilis cellen binnen microkolonies: een samenleving van sessiele bacteriële cellen. In tegenstelling tot cellen binnen vloeibare cultures, heeft epigentische overerving in dergelijke macrostructuren voornamelijk een effect op cellen die geografisch gegroepeerd zijn (‘zusjes’ liggen per definitie altijd naast elkaar).
Het is aangetoond dat sporulatie voornamelijk plaatsvindt binnen verhoogde structuren binnen biofilms in zogenaamde ‘fruiting bodies of bundels’ (Branda et al., 2001;
Veening et al., 2006a; Hoofdstuk 7). De formatie van biofilms in B. subtilis vereist systematische celdifferentiatie en wordt gecoördineerd door Spo0A (Branda et al., 2001; Veening et al., 2006b; Veening et al., 2006a; Hoofdstukken 3 en 7). Daarom zou epigentische overerving van het sporulatiesignaal cruciaal kunnen zijn voor de formatie van deze sociaal-georganiseerde structuren.
Sporulatie bistabiliteit is een vorm van risico spreiding
Risicospreiding (of ‘bet-hedging’) is een strategie die de conditie (of fitness) van een genotype kan verhogen onder variabele condities (Bradshaw, 1965; Stearns, 1976).
Een organisme kan nakomelingen produceren met verschillende fenotypen (bijvoorbeeld sporuleren of niet sporuleren). Als de toekomstige condities onvoorspelbaar zijn dan kan dit organisme dus een hogere kans hebben dat tenminste een van zijn nakomelingen goed geadapteerd is aan de nieuwe omgeving (Cohen, 1966). Omdat niet elk fenotype geschikt is voor de nieuwe omgeving is dit dus een vorm van risicospreiding. Het klassieke risicospreidingsvoorbeeld is de jaarlijkse zaadontkieming bij planten. Omdat niet elk jaar ideaal is voor een zaad om te ontkiemen en te groeien, maken sommige planten een mix van zaden. Sommige van deze zaden zullen snel ontkiemen, maar anderen slaan een of meerdere jaren over (Cohen, 1966).
Een belangrijke conclusie die gepresenteerd wordt in Hoofdstuk 5 is dat tijdens de microkolonieontwikkeling in B. subtilis niet alle cellen sporuleren en dat deze cellen een andere tactiek hanteren. Cellen die niet sporuleren benutten namelijk de nutriënten die beschikbaar komen tijdens de diauxische groeifase om te groeien in plaats van te sporuleren. Onze studie toont aan dat deze cellen het meest bijdragen aan de totale populatie en dus ‘fitter’ zijn dan sporulerende cellen (Hoofdstuk 5, tabel 1). Een deel van de populatie (de sporevormers) zullen beschermd zijn wanneer een catastrofale gebeurtenis plaatsvindt. De niet-sporevormers daarentegen zullen weer in het voordeel zijn als er plotseling nieuwe nutriënten beschikbaar komen. Een groot voordeel van heterogeniteit in een sporulerende culture is dat de nutriënten die vrijkomen bij de lysis van de moedercel (van een sporulerende cel) optimaal benut kunnen worden door de niet-sporulerende cellen.
Vertoont B. subtilis altruïstisch gedrag?
Omdat de meeste gen-expressiestudies in vloeibare B. subtilis cultures gedaan zijn op hele (heterogene) populaties (en niet specifiek binnen subpopulaties), is er weinig bekend over de expressiepatronen van niet-sporulerende cellen tijdens de stationaire fase. Om dit te bepalen hebben we sporulerende cellen gescheiden van niet- sporulerende cellen en het transcriptoom van beide subpopulaties onderzocht
Samenvatting
(Hoofdstuk 6). Met behulp van promoter-GFP-fusies hebben we verschillende nieuwe niveaus van heterogeniteit kunnen ontdekken. Een van de meest interessante heterogene paden die we geïdentificeerd hebben, is het DegU gennetwerk. Twee genen die onder de controle van DegU staan, aprE en bpr, worden specifiek in een deel van de populatie tot expressie gebracht. Bpr en AprE zijn beide proteasen en worden uit de cel getransporteerd (secretie) en breken grote eiwitten in het groeimedium af tot kleine peptiden. Deze kleine peptiden kunnen weer door de cel worden opgenomen en gebruikt worden als een nieuwe bron van energie (Msadek, 1999). Binnen een overnachtculture kunnen er drie specifieke celtypen onderscheiden worden: 1) cellen die aprE/bpr expresseren, 2) cellen die aprE/bpr niet expresseren en 3) cellen die sporuleren (die aprE/bpr niet of niet meer expresseren). Genetische experimenten lieten zien dat aprE expressie afhangt van de sporulatie-phosphorelay en van fosforylatie van DegU. Omdat slechts een deel van de populatie de niveaus van Spo0A~P en DegU~P bereikt die noodzakelijk zijn voor aprE expressie, zal ook maar een klein deel van de cellen aprE daadwerkelijk expresseren (Hoofdstuk 6). Deze interconnectie van twee genetische routes heeft veel weg van een logische ‘EN’- schakelaar, waarbij twee inputs noodzakelijk zijn voor een enkele output. Vanuit een evolutionair perspectief lijkt dit ook logisch, omdat er geen noodzaak is om een complexe schakelaar te ontwikkelen die deze bistabiele uitkomst kan genereren. Deze studie toont nogmaals aan hoe versatiel de sporulatie-phoshorelay is in het omzetten van omgevingssignalen in een heterogene uitkomst.
Slechts een deel van de populatie brengt aprE en bpr tot expressie. Dus, cellen die deze proteasen maken en uitscheiden, helpen niet alleen zichzelf maar alle cellen binnen de vloeibare culture. Dit zou een eenvoudige vorm van altruïsme kunnen voorstellen, waarbij het gedrag van de altruïst ten koste gaat van zijn eigen conditie maar ten goede komt aan de rest van de populatie (West et al., 2006). Altruïsme kan alleen verklaard worden als het fenotype ten goede komt aan individuen met hetzelfde genotype (Kin selectie) (Hamilton, 1964; Maynard Smith, 1964). Daarom is het sociale fenotype wat B. subtilis in deze studie lijkt te tonen, goed te begrijpen omdat alle cellen in de culture genetisch identiek zijn. Toekomstig onderzoek moet uitwijzen of het echt altruïsme betreft (waar de altruïst lijdt) of dat het coöperatief gedrag is (waarbij zowel de gevende als de ontvangende partij gebaat zijn). Een alternatieve hypothese is dat de gesecreteerde proteasen levende cellen aanvallen en op die manier nieuwe nutriënten aanboren. In dit geval zijn de protease-producenten geen altruïsten maar kannibalen. Toekomstig onderzoek moet uitwijzen welke hypothese de correcte is.
Phosphorelay en biofilm-formatie
Bacteriën komen in de natuur voornamelijk voor in de vorm van multicellulaire samenlevingen, biofilms genoemd (Davey and O'toole, 2000). In Hoofdstuk 7 definiëren we B. subtilis biofilms als volgt: ‘samenlevingen van cellen samengevoegd
in een polymere matrix in een aderachtige (bundel)structuur op halfvaste agar oppervlakten’. In lijn met het actuele model voor biofilm-formatie laten we zien dat overproductie van de phosphorelay-componenten KinA en Spo0A bundelformatie stimuleren. Overproductie van de AbrB- en SinR-regulatoren daarentegen verminderen bundelformatie. Time-lapse fluorescentie-microscopie met B. subtilis GFP-reporters laat zien dat bundels de preferentiële plekken zijn voor sporeformatie, terwijl platte structuren vegetatieve (niet-sporulerende) cellen bevatten. De verhoogde bundels worden gemaakt voordat sporulatie geïnitieerd wordt. Een verstoorde werking van de phosphorelay leidt niet alleen tot verstoorde bundelformatie, maar ook tot de accumulatie van sporulatiemutanten en een verminderde hitteresistentie van sporen binnen deze biofilms. Deze resultaten laten nogmaals zien hoe belangrijk een gebalanceerde sporulatie-phosphorelay is voor zowel biofilm als sporenformatie en laat de diversiteit van de phosphorelay nogmaals zien. Dit werk laat tevens zien dat de concentraties van Spo0A~P in een graduele manier moeten accumuleren om in een gecoördineerde manier eerst biofilmformatie te stimuleren en vervolgens sporeformatie. Recentelijk werk laat ook zien dat een graduele toename in Spo0A~P belangrijk is voor sporeformatie (Fujita and Losick, 2005).
Deze resultaten geven drie mogelijke hypotheses over hoe sporulatie-bistabiliteit werkt in de praktijk. Het zou kunnen zijn dat Spo0A auto-stimulatie alleen initieert nadat cellen eerst een graduele toename in Spo0A~P hebben doorlopen en het zogenaamde ‘low-threshold regulon’ hebben geactiveerd. Een meer controversiële theorie is dat Spo0A auto-stimulatie niet de bron is van sporulatie-bistabiliteit maar dat cellen een langgerekte Gaussian distributie in Spo0A~P niveaus vertonen. Door ruis in transcriptie en door de verschillende affiniteiten van Spo0A~P om DNA te binden, zullen sommige cellen eerder dan andere cellen genoeg Spo0A~P hebben opgebouwd om het zogenaamde ‘high threshold regulon’ te activeren. De unidirectionaliteit wordt dan veroorzaakt door de activatie van de alternatieve sigmafactoren die leiden tot formatie van het asymmetrische septum. Na de formatie van dit asymmetrische septum kan B. subtilis niet meer terug naar vegetatieve groei en moet B. subtilis het verdere proces van sporenformatie afmaken. Deze hypothese verklaart niet de aanwezigheid van geheugen in het sporulatiepad. De meest waarschijnlijke hypothese is dat auto-activatie van Spo0A al in een vroeg stadium getriggered wordt en dat dit een subpopulatie van cellen in de Spo0A-‘aan’-staat en een subpopulatie van cellen in een Spo0A-‘uit’-staat genereerd. De Spo0A~P niveaus in de Spo0A-‘aan’-cellen nemen niet exponentieel toe, maar nemen toe in een graduele manier. Deze gecontroleerde manier van Spo0A~P-accumulatie wordt veroorzaakt door de vele negatieve feedbacks (zoals RapA en Spo0E) die op de phosphorelay werken (Hoofdstuk 3).
Samenvatting Andere suggesties voor toekomstig onderzoek
Het voorkomen van zeer resistente bacteriële sporen tijdens de diverse stadia in voedingsproductie is een serieus probleem voor de voedingsindustrie. Sporen van verschillende Bacillen kunnen bederf (B. subtilis, B. coagulans, B. licheniformis) of zelfs ziekte veroorzaken (B. cereus). Tijdens het conserveren van voedingsproducten heeft men vaak te maken met een diversiteit aan sporen met verschillende hitteresistenties (vaak binnen dezelfde isogene populaties). De moleculaire mechanismen die deze hitteresistente heterogeniteit veroorzaken, zijn slecht begrepen.
Toekomstig onderzoek zou naar de oorsprong van deze variabiliteit moeten kijken.
Het meeste onderzoek dat naar hitteresistentie van sporen is gedaan, is slechts beschrijvend van aard (Gonzalez et al., 1999). Onder andere het werk beschreven in dit proefschrift toont aan dat verschillende groeicondities tijdens vegetatieve groei kan leiden tot sporen met verschillende hitteresistenties. Sporen geïsoleerd uit biofilms bijvoorbeeld zijn veel resistenter dan sporen van dezelfde stam geïsoleerd uit vloeibare cultures (Hoofdstuk 7). Bovendien laat het werk in dit proefschrift zien dat al in de vroegste stadia van sporenformatie een grote hoeveelheid aan heterogeniteit bestaat en dat een deel van deze heterogeniteit veroorzaakt wordt door epigenetische mechanismen (Hoofdstukken 2 t/m 6). Deze studies geven waardevolle aanwijzingen en goede startpunten voor toekomstig onderzoek. De exacte relatie tussen heterogene ontwikkeling en hitteresistentie van sporen zou uitgezocht moeten worden.
Mogelijkerwijs geeft dergelijk onderzoek indicaties over de moleculaire mechanismen die heterogeniteit in sporenresistentie veroorzaken. Dit zou de voedingsindustrie waardevolle informatie opleveren om betrouwbare voorspellingen te kunnen doen en vooral om procesparameters te vinden die microbieel veilig voedsel kunnen garanderen.
