1
Samenvatting
Jaarlijks worden wereldwijd ongeveer 8 miljoen baby's geboren die lijden aan aandoeningen veroorzaakt door genetische afwijkingen. Er zijn verschillende testen ontwikkeld om deze afwijkingen in een vroeg stadium van de zwangerschap op te sporen. Deze prenatale screening en diagnostische testen bieden ouders de mogelijkheid om geïnformeerde reproductieve beslissingen te nemen. Prenatale diagnostische testen, waarbij zuivere foetale cellen worden verzameld en geanalyseerd, resulteren in de juiste diagnose van genetische afwijkingen bij de foetus. Helaas zijn deze testen invasief en houden ze een klein risico op een miskraam in. Om te vermijden dat alle zwangere vrouwen een invasieve test zouden moeten ondergaan, wordt het risico op een foetus met chromosomale afwijkingen eerst ingeschat door middel van niet-invasieve prenatale screeningstesten. Mede door de vooruitgang van de DNA-sequencing technologieën is hiervoor de cel-vrije niet-invasieve prenatale test (cfNIPT) ontwikkeld. Door analyse van het cel-vrije foetale DNA, dat aanwezig is in de bloedsomloop van de moeder, kunnen zwangere vrouwen gescreend worden op ernstige genetische aandoeningen van de foetus, zoals het syndroom van Down. Aangezien vals-positieven en vals-negatieven kunnen voorkomen bij deze test, wordt cfNIPT beschouwd als een screeningstest en moet een positief cfNIPT-resultaat altijd worden bevestigd door een invasieve diagnostische test voordat reproductieve beslissingen genomen worden. Naast de aanwezigheid van circulerend cel-vrij foetaal DNA, is ook de aanwezigheid van circulerende foetale cellen aangetoond in de maternale circulatie. Het isoleren van zuivere foetale cellen uit maternaal bloed, waardoor genetische analyse van het zuivere foetale genoom op een niet-invasieve manier mogelijk is, zou een enorme impact hebben op het veld van prenatale diagnose. Aangezien de verhouding tussen foetale en maternale cellen in het bloed lager is dan één op een miljard, vormt het isoleren en identificeren van deze cellen helaas een enorme uitdaging. In de afgelopen vier jaar hebben enkele onderzoeksgroepen de succesvolle isolatie van foetale cellen uit het bloed van zwangere vrouwen reeds aangetoond, maar de bekwaamheid om foetale cellen robuust te isoleren en te analyseren binnen een haalbare en klinisch implementeerbare workflow, blijft moeilijk te bereiken.
Om bij te dragen aan de ontwikkeling van een haalbare cel-gebaseerde niet-invasieve prenatale testmethode (cbNIPT), dienden twee hoofddoelen te worden bereikt. Het eerste doel van dit proefschrift was om te slagen in het isolatie van circulerende foetale cellen uit het bloed van de moeder. Het is aangetoond dat verschillende soorten foetale cellen aanwezig zijn in het bloed van de moeder, maar in dit proefschrift wordt er enkel op foetale trofoblasten gefocust omwille van hun grotere celgrootte en hun expressie van enkele relatief specifieke merkers. Aangezien deze circulerende foetale trofoblasten (CFT's) uiterst zeldzaam zijn in de circulatie van de moeder, is een verrijkingsstap vereist om hun selectie en isolatie te vergemakkelijken. Om het eerste doel te bereiken, werden verschillende technologieën onderzocht voor de verrijking en isolatie van individuele CFT’s in
2 de context van cbNIPT. De resultaten van de meest veelbelovende technologie worden besproken in Hoofdstuk III. In dit hoofdstuk werd het VTX-1 Liquid Biopsy-systeem onderzocht met als doel de verrijking van CFT’s uit het bloed van een zwangere vrouw. Deze innovatieve, op grootte gebaseerde technologie gebruikt inertiële microfluidica en laminaire microschaal vortices voor de verrijking van grote cellen. De technologie is met name veelbelovend omdat er geen voorverrijkingsprocedures nodig zijn en het bloed rechtstreeks kan worden verwerkt op de Vortex-chip. De resultaten van deze studie bewijzen dat CFT’s in zeven van de tien gevallen succesvol opgezuiverd kunnen worden uit het bloed van vrouwen die zwanger zijn van een mannelijke foetus, tijdens week 11 – 13 van de zwangerschap. In drie van de tien gevallen kon de aanwezigheid van mannelijke foetale cellen in de opgezuiverde cellen niet worden aangetoond. Dit kan mogelijks verklaard worden door de kleine hoeveelheid bloed die werd verwerkt. Er werd slechts 8 ml bloed verwerkt, terwijl andere succesvolle CFT- isolatieprotocollen een input van 30 – 40 ml gebruiken. Door dit volume te verhogen, zou het aantal stalen waaruit onvoldoende CFT’s opgezuiverd kunnen worden, waarschijnlijk afnemen. Op basis van de qPCR- resultaten werd ook een schatting gemaakt van het aantal opgezuiverde cellen. Ongeveer 2 – 6 CFT's kunnen worden opgezuiverd uit 8 ml bloed van een zwanger vrouw. Bovendien werd een zeer hoge zuiverheid aan CFTs verkregen, aangezien slechts ± 1.524 maternale bloedcellen mee opgezuiverd waren. Dit lage aantal ongewenste maternale cellen zal de uiteindelijke selectie en isolatie van CFT's zeker vereenvoudigen. De volgende stappen omvatten de combinatie van deze verrijkingstechnologie met daaropvolgende immuun-gebaseerde kleuringsmethoden en individuele cel-isolatietechnologieën. Aangezien het VTX-1 Liquid Biopsy-systeem het mogelijk maakt om opgezuiverde cellen in alle beschikbare soorten verzamelcontainers op te vangen, wordt een haalbare integratie in een cbNIPT-workflow verwacht.
Na de verrijking van CFT's moeten alle vermoedelijk-foetale cellen afzonderlijk worden geïsoleerd. De isolatie van individuele cellen is belangrijk omdat er nog geen unieke, specifieke foetale trofoblastmerkers gekend zijn.
Daarom moet de ware foetale oorsprong van elke cel worden bevestigd. Bovendien moet naast identificatie ook de detectie van chromosomale afwijkingen mogelijk zijn op deze afzonderlijke foetale cellen. Om meerdere genetische analyses op een enkele cel mogelijk te maken, is volledige genoomamplificatie (WGA) onvermijdelijk.
Helaas zijn alle WGA-methoden vatbaar voor fouten en afhankelijk van de beoogde daarop volgende analyse kan een andere WGA-methode de voorkeur hebben. Daarom was het tweede doel van dit proefschrift om zowel identificatie als genetische analyse mogelijk te maken op de individueel geïsoleerde foetale trofoblast cellen na WGA. Om dit tweede doel te bereiken, werden verschillende WGA-methoden vergeleken op vlak van hun geschiktheid voor short tandem repeat (STR)-profilering en copy number variation (CNV)-detectie. Op basis van de resultaten weergegeven in Hoofdstuk IV, is het duidelijk dat REPLI-g Single Cell WGA Kit, DOPlify™ WGA, Ampli1™ WGA Kit, and PicoPLEX® WGA Kit één voor één een DNA-opbrengst genereren die voldoende hoog is om
3 meerdere genetische analyses op uit te voeren. MDA-gebaseerde REPLI-g resulteert in de meest complete STR- profielen, aangezien er bijna geen allel drop-out werd waargenomen en één volledig STR-profiel werd verkregen.
Op basis van eerder gepubliceerde resultaten van onze groep, is de hypervertakte structuur die wordt gegenereerd door REPLI-g echter het meest vatbaar voor representatiebias en is ze daarom niet erg geschikt voor CNV-detectie. Aangezien betrouwbare CNV-detectie cruciaal is binnen cbNIPT, krijgt REPLI-g in deze context niet de voorkeur. Naast REPLI-g wordt PicoPLEX verkozen boven Ampli1 en DOPlify op vlak van STR-profilering, wat reeds werd verwacht op basis van de op MDA-gebaseerde pre-amplificatiestap. Helaas is deze methode mogelijks minder robuust. Ampli1 en DOPlify presteren het slechtst op vlak van STR-profilering, aangezien meer dan de helft van de verwachte allelen is weggevallen. Volledige STR-profielen worden niet als noodzakelijk geacht om foetale cellen te kunnen onderscheiden van maternale cellen, maar een hoog aantal drop-outs zal de identificatie zeker bemoeilijken. Aangezien PicoPLEX uitblinkt qua CNV-detectie en het op één na beste presteert voor STR-profilering, krijgt deze WGA-methode de voorkeur voor de amplificatie van verse individuele foetale cellen in een cbNIPT-context.
Helaas vormt de onmiddellijke verwerking van bloedstalen na afname een grote uitdaging in een klinische setting. Daarom hebben verschillende bedrijven bloedafnametubes ontwikkeld die een cel-conserveermiddel bevatten. In tegenstelling tot normale EDTA-bloedafnametubes, die binnen 4 uur moeten worden verwerkt om cel-lyse te voorkomen, mogen deze conserveringstubes een langere tijd bewaard worden bij kamertemperatuur.
De meeste conserveringstubes zijn gebaseerd op formaldehyde-vrije fixatie van alle kern-houdende bloedcellen, waardoor cel-lyse wordt voorkomen. Omdat de exacte combinatie van reagentia echter vaak strikt vertrouwelijk is, is de invloed van het conserveermiddel op de DNA-kwaliteit onvoorspelbaar.In Hoofdstuk V werden in plaats van verse cellen, Streck cfDNA BCT-gepreserveerde cellen gebruikt om de geschiktheid van dezelfde vier WGA- methoden voor STR-profilering en CNV-detectie te beoordelen na bewaring. Er werden duidelijke verschillen in WGA-prestaties opgemerkt voor geconserveerde cellen in vergelijking met verse cellen. Het genereren van een STR-profiel na amplificatie van een individuele cel met REPLI-g is mogelijk voor verse cellen, maar bijna onmogelijk met gepreserveerde cellen. Met een gemiddeld drop-out percentage van 77 % en een maximum van vijf correct geanalyseerde STR-loci per staal, wordt REPLI-g als ongeschikt beschouwd voor STR-profilering na cel-preservatie. Bovendien resulteerde REPLI-g, omwille van de zeer onregelmatige verdeling van reads over het genoom, ook niet in bruikbare CNV-profielen. De prestatie van REPLI-g is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het input-DNA, wat verklaard kan worden door het amplificatie-mechanisme dat inherent is aan multiple displacement amplificatie (MDA)-gebaseerde WGA. Wanneer DNA wordt gefragmenteerd, neemt de efficiëntie van het Phi29-polymerase af en wordt de vorming van hypervertakte structuren belemmerd, wat finaal resulteert in onder- en oververtegenwoordiging van bepaalde regio's in het genoom. Waarschijnlijk introduceert
4 het Streck cfDNA BCT-preservatiemiddel DNA-fragmentatie, wat de ondermaatse prestaties van REPLI-g zou verklaren. In tegenstelling tot REPLI-g resulteren PicoPLEX, DOPlify en Ampli1 wel in bruikbare STR-profielen, met vergelijkbare gemiddelde drop-out waarden. Voor PicoPLEX en DOPlify wordt geen duidelijk patroon waargenomen in de drop-outs, terwijl Ampli1 in bijna alle stalen consequent dezelfde 6 STR-loci laat uitvallen.
Deze consistente uitval van loci kan worden veroorzaakt door de initiële fragmentatiestap die wordt uitgevoerd in op linker adapter (LA)-PCR gebaseerde WGA-methoden. Mogelijks knippen de restrictie-enzymen van Ampli1 de primer-bindingsplaatsen van bepaalde STR-loci waardoor de correcte amplificatie van deze loci tijdens STR- profilering wordt belemmerd. Ten slotte, op vlak van CNV-detectie, werden bijna alle CNV's correct geanalyseerd met Ampli1, PicoPLEX en DOPlify, maar enkel Ampli1 resulteerde in 100 % sensitiviteit en specificiteit. Daarom wordt Ampli1 in deze setting verkozen boven PicoPLEX en DOPlify. Over het algemeen zal de bewaring van het bloed voor 24 uur in Streck cfDNA BCT-tubes de daaropvolgende STR-profilering of CNV-analyse dus niet belemmeren, zolang een geschikte WGA-methode wordt gekozen.
Ten slotte wordt zelfs met de meest geschikte WGA-methode onvolledige STR-profilering verwacht na WGA van enkele cellen. Aangezien moeder en kind de helft van hun DNA delen, vormt de betrouwbare discriminatie van foetale cellen en moedercellen, op basis van onvolledige STR-profielen, een uitdaging.Binnen het forensische veld wordt SNP-profilering vaak voorgesteld voor verwantschapsanalyse, aangezien een lagere mutatiesnelheid wordt verwacht voor deze merkers over verschillende generaties. Omwille van hun bi-allelische aard moeten echter meer dan 40 SNP-loci samen geamplificeerd worden om een vergelijkbaar onderscheidend vermogen te verkrijgen als 15 STR-loci. In Hoofdstuk VI werden zowel STR-profilering als SNP-profilering geëvalueerd voor de discriminatie van individuele cellen afkomstig van verwante individuen, na PicoPLEX WGA. Om een cbNIPT- setting na te bootsen, werden drie gezinnen opgenomen in deze studie, elk bestaande uit twee ouders en twee nakomelingen. Om elke cel te identificeren als een ouder-cel of een nakomelingen-cel, werd een nakomelingen- ouder-waarschijnlijkheidsratio (OPLR) berekend op basis van de gegenereerde STR-profielen en SNP-profielen, rekening houdende met allel drop-outs en drop-ins veroorzaakt door WGA. Zowel SNP-profilering als STR- profilering bleken in staat om individuele cellen van een ouder of een nakomeling correct te onderscheiden na PicoPLEX WGA, met 100 % sensitiviteit en specificiteit, maar een hogere bewijskracht wordt verkregen voor SNP- profilering. De bewijskracht is ook afhankelijk van de beschikbaarheid van het genotype van beide ouders. In een normale cbNIPT-setting is alleen het genotype van de moeder bekend, waardoor onzekerheid voor de andere ouder in de OPLR-berekening wordt geïntroduceerd. Als echter het genotype van beide ouders beschikbaar is voor OPLR-berekening, wordt er geen onzekerheid geïntroduceerd voor de andere ouder en wordt een verhoogde bewijskracht verkregen. Aangezien immuun-gebaseerde kleuringsprotocollen vaak formaldehyde-fixatie van cellen vereisen voor de fluorescerende labeling van interne cel-merkers, werden zowel formaldehyde-
5 gefixeerde cellen als verse cellen in deze studie opgenomen. Er werden geen grote verschillen opgemerkt in de prestatie van PicoPLEX WGA voor formaldehyde-gefixeerde cellen in vergelijking met verse cellen, wat in overeenstemming is met de verwachtingen op basis van de resultaten van Hoofdstuk IV en Hoofdstuk V.
Ten slotte kunnen we concluderen dat er met dit proefschrift enkele belangrijke stappen gezet zijn op weg naar haalbare cbNIPT. Met de veelbelovende, op grootte gebaseerde Vortex-verrijkingstechnologie zijn we slechts één stap verwijderd van CFT-isolatie uit het bloed van zwangere vrouwen. Bovendien hebben we, zodra deze foetale cellen kunnen worden geïsoleerd, alle daaropvolgende technologieën onder de knie met betrekking tot WGA, bevestiging van foetale cel identiteit, en CNV-analyse van het foetale genoom.
