University of Groningen
Drug metabolism in human and rat intestine van de Kerkhof, Esther Gesina
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2007
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
van de Kerkhof, E. G. (2007). Drug metabolism in human and rat intestine: an 'in vitro' approach. s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.
More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne- amendment.
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Appendix
Nederlandse samenvatting List of non-standard abbreviations
Dankwoord List of publications
Curriculum Vitae
Introductie
De darm is uitgerust met een breed scala aan metaboliserende enzymen (GMEn) en transporters (GTs), die betrokken zijn bij de opname en het metabolisme van geneesmiddelen. Dit versterkt de barrièrefunctie van de darm tegen lichaamsvreemde stoffen. Immers, GMEn kunnen lichaamsvreemde stoffen (xenobiotica), waaronder geneesmiddelen omzetten tot veelal inactieve verbindingen. GTs kunnen de opname en uitscheiding van xenobiotica beïnvloeden (hoofdstuk 1).
De mogelijkheden om deze processen bij de mens in vivo te bestuderen zijn schaars.
Daarom zijn in vitro methoden voor het bestuderen van geneesmiddelmetabolisme in de darm waardevol. Hiervoor is een aantal methoden beschikbaar. De voordelen en de beperkingen van deze methoden (intacte celsystemen, subcellulaire fracties en cellijnen) worden bediscussieerd in hoofdstuk 2.
Een in vitro - testsysteem om geneesmiddelmetabolisme en inductie daarvan bij de mens te voorspellen moet voldoen aan tenminste vier criteria. Ten eerste moet het model bestaan uit intacte cellen. Ten tweede dienen GMEn en GTs te blijven functioneren in ongeveer 24 uur durende incubaties. Dit is nodig om onderzoek naar geneesmiddelen die slechts langzaam worden gemetaboliseerd, maar ook naar mechanismen van inductie van metabolisme te kunnen uitvoeren. Ten derde moet de techniek toepasbaar zijn op zowel dierlijk als humaan weefsel. Diermodellen worden immers veelal gebruikt voor de voorspelling van deze fenomenen bij de mens, maar het is bekend dat er vele soortspecifieke verschillen zijn in geneesmiddelmetabolisme en geneesmiddel - geneesmiddelinteracties. Ten vierde moet het in vitro - testsysteem zeer efficiënt gebruik maken van het weefsel, omdat er maar weinig humaan darmmateriaal beschikbaar is voor onderzoeksdoeleinden.
Een van de modellen die aan deze voorwaarden zou kunnen voldoen is het darmplakjesmodel. Voorafgaand aan dit project werd dit darmplakjesmodel opgezet in ons laboratorium. Toen is al aangetoond, dat deze darmplakjes hoge metabole omzettingssnelheden bezaten gedurende 3 uur incubatie. Maar langere incubatieperioden zijn toen niet onderzocht.
Het darmplakjesmodel kent veel voordelen. Het gebruikt het darmweefsel zeer efficiënt en het bevat alle celtypen met enzymesystemen, co-factoren en transporters. Deze zijn in principe aanwezig in hun fysiologische context. Een ander voordeel is, dat het model kan worden gebruikt om het metabolisme te bestuderen in de verschillende segmenten van de darm. Het kan naar verwachting worden toegepast op zowel dierlijk als humaan weefsel en tevens zouden de plakjes wellicht 24 uur geïncubeerd kunnen worden.
Rattenstudies
Vanwege bovenstaande voordelen is ervoor gekozen om het darmplakjesmodel verder te karakteriseren voor metabolismestudies in de rat en het metabolisme in de rattendarm
snelheid af in distale richting en bleek de mate waarin deze afname plaatsvond af te hangen van het geteste substraat.
De darm reguleert het geneesmiddelmetabolisme door te reageren op inducerende maar ook inhiberende stimuli. Inductie van GMEn in de darm kan leiden tot een verandering in de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen. Een logische volgende stap was dan ook om te onderzoeken of deze weefselplakjes in staat waren te reageren op inductoren door de metabole omzettingssnelheden te verhogen (hoofdstuk 3 en 4). Hiervoor werden plakjes van dunne darm en colon 24 uur blootgesteld aan β-naphthoflavone. Deze blootstelling bleek de omzettingssnelheid van 7-ethoxycoumarine inderdaad te verhogen (hoofdstuk 3).
Vervolgens evalueerden we het gebruik van darmplakjes voor geneesmiddelmetabolisme en inductiestudies verder, zoals is beschreven in hoofdstuk 4. Voor inductiestudies werd verondersteld dat weefselplakjes langer (tot ongeveer 24 uur) geïncubeerd moesten worden. Daarom werd de vitaliteit en metabole omzettingssnelheid eerst geëvalueerd tijdens 24 uur durende incubaties alvorens inductieprocessen te bestuderen. In colonplakjes bleef zowel de vitaliteit als de metabole snelheid behouden gedurende 24 uur. In dunne darmplakjes werd de vitaliteit en metabole snelheid behouden gedurende 8 uur pre- incubatie. Daarna, bij pre-incubaties tussen 8 en 24 uur, nam de metabole snelheid af tot 24-92% van de initiële snelheid. Dit varieerde per substraat. Een vergelijkbaar fenomeen is uitgebreid beschreven voor primaire hepatocytencultures van de rat. Met algemene acceptatie, zo ook van de FDA, worden deze celculturen toch op grote schaal gebruikt voor inductie studies na 1-3 dagen, ondanks hun dalende enzyme-activiteiten gedurende incubatie. Daarom werden, na het evalueren van de vitaliteit en metabole omzetting in 24 uur durende incubaties, de inductiereacties bestudeerd in deze weefselplakjes. In de dunne darm bleken de inductiereacties al detecteerbaar na 5-24 uur blootstelling met de inductor, terwijl in colonplakjes inductiereacties detecteerbaar bleken na 8-24 uur blootstelling. Tegen de verwachting in kon alleen in dunne darmplakjes inductie door phenobarbital niet worden waargenomen.
Op grond van deze bevindingen stellen wij, dat voor de meeste reacties de metabole activiteit en inductiereacties duidelijk detecteerbaar zijn na 24 uur durende incubaties. Het weefselplakjessysteem is dus zeer geschikt voor kwalitatieve metabolisme- en inductiestudies tijdens 24 uur durende incubaties. Tot nu toe is dit systeem het enige beschikbare model dat gevalideerd is voor studies naar geneesmiddelmetabolisme voor incubatieperioden tot 24 uur.
Gradiënten in basaal geneesmiddelmetabolisme werden aangetoond over het darmkanaal in hoofdstuk 3 en waren ook al deels beschreven in de literatuur. Eventuele regionale verschillen in induceerbaarheid in de darm, waren echter nog niet duidelijk beschreven.
Vanwege het feit dat dit plakjessysteem zich uitstekend leent om deze regionale verschillen te bestuderen, werd de mate van inductie van geneesmiddelmetabolisme in duodenum, jejunum, ileum en colon vergeleken na in vitro en in vivo blootstelling (hoofdstuk 5). Alle segmenten van de darm bleken gevoelig voor inductoren, maar de mate waarin deze inductie plaatvond verschilde wel tussen de segmenten. Deze verschillen bleken parallel te lopen met de expressieniveaus van de verantwoordelijke nucleaire receptoren. Verder viel op, dat de resultaten verkregen na in vitro en in vivo blootstelling vergelijkbaar zijn. Een uitzondering daarop is, dat in colon de inductiereactie relatief hoger was na in vitro
blootstelling in vergelijking met in vivo. Dit laatste kan, in ieder geval deels, verklaard worden door het verschil in blootstelling aan de inductor in vivo en in vitro.
Alvorens darm- en leverdata te kunnen vergelijken, dienen de metabole snelheden te worden uitgedrukt in dezelfde eenheid: per metabool actieve cellen in het betreffende orgaan, dat wil zeggen per mg enterocyte eiwit in de darm en per mg hepatocyte eiwit in de lever. Na omrekening en vergelijking bleek dat de metabole snelheden in deze dunne darm enterocyten 8-152% bedroegen van de snelheden gemeten in hepatocyten (hoofdstuk 9).
Een vergelijking van inductiereacties in darmplakjes en gepubliceerde leverdata toonde tevens aan, dat de inductie in grote mate kwalitatief vergelijkbaar was in lever en darm.
Humane studies
Een in vitro - testsysteem dat ook toepasbaar is op humaan materiaal, biedt vele voordelen voor de juiste voorspelling van geneesmiddelverwerking in de darm van de mens. Daarom bestudeerden we de toepasbaarheid van het beschreven systeem op humaan darmweefsel (hoofdstuk 6). De vitaliteit en metabole activiteit bleken in deze preparaten constant te blijven in 4 uur durende incubaties. Na vergelijking met gepubliceerde hepatocytendata, bleek de metabole omzettingssnelheid in enterocyten 37-288% te bedragen van de snelheden in hepatocyten (hoofdstuk 9). Verder viel op, dat de fase II conjugatiesnelheid (glucuronidering en sulfatering) in colonplakjes praktisch gelijk was aan de snelheid in plakjes van de dunne darm, terwijl de cytochroom P450 (CYP) gemedieerde fase I omzettingen veel langzamer waren in plakjes van colon dan van dunne darm.
Hiernaast vergeleken we de omzettingssnelheden in de weefselplakjes en in weefsel dat was ingebed in een Ussing kamer opstelling. Deze Ussing kamer opstelling was gevalideerd en aanwezig bij Astrazeneca, Mölndal, Zweden (hoofdstuk 6). De Ussing kamer preparaties bleken vitaal en metabool stabiel in 3-4 uur durende incubaties. De verdeling van de excretie van de metabolieten naar het lumen en naar de basolaterale (bloed) kant kon ook bestudeerd worden met het Ussing kamer systeem. We hebben aangetoond, dat de afzonderlijke metabolieten in verschillende mate werden uitgescheiden naar lumen en bloed. Tevens bleek, dat de omzettingssnelheden van de weefselplakjes en Ussing kamer preparaties vergelijkbaar waren. Op grond hiervan concludeerden we, dat beide systemen bruikbaar zijn voor kwantitatieve geneesmiddelmetabolisme studies.
Vervolgens bestudeerden we de toepasbaarheid van humane jejunum weefselplakjes voor inductiestudies (hoofdstuk 7). De vitaliteit en metabole snelheden bleken redelijk stabiel in 24 uur durende incubaties. De metabole snelheden daalden gemiddeld maar tot 40-50%. Dit gold voor de meeste substraten na 24 uur pre-incubatie. Alleen de hydroxylatie van diclofenac (gemedieerd door CYP2C9) daalde sterker (90%). In colonplakjes waren de CYP omzettingen niet detecteerbaar. De glucuronide- en sulfaatconjugatiesnelheden daarentegen waren wel detecteerbaar en bleken constant in 24 uur durende incubaties.
humane darmplakjesmodel een waardevol systeem vormt om inductie van GMEn en GTs te bestuderen in de humane darm.
Er was maar weinig bekend van de inductiereacties van GME en GT in de humane darm.
Daarom werd er besloten om dit verder te onderzoeken. Inductiereacties van vijf prototypische inductoren werden getest op 19 verschillende genen (GMEn, GTs en nucleaire receptoren) (hoofdstuk 8). Dexamethason bleek voornamelijk CYP3A4 en CYP1A1 te verhogen, daar waar rifampicine voornamelijk CYP3A4, MDR1 en MRP2 induceerde. Phenobarbital verhoogde CYP3A4, UGT1A6, MDR1 en MRP2. β- naphthoflavone verhoogde weer voornamelijk CYP1A1, MRP2 en PXR en quercetine verhoogde CYP1A1, UGT1A6, MRP3 en PXR.
Op grond van deze bevindingen concludeerden we, dat iedere inductor een bepaalde set genen kan induceren. Dit betekent dat, zoals bekend van lever, ook in de darm deze genen gecoördineerd gereguleerd zijn. Deze inductie van GMEn en GTs in de darm kan consequenties hebben voor het ‘first-pass’ metabolisme in de darm. Vergelijkingen van inductiereacties in darm en lever, maar ook in mens en rat toonden verschillen aan in metabole snelheden en inductiereacties in darm en lever, maar ook in mens en rat (hoofdstuk 8 en 9). Dit laatste benadrukt maar weer eens hoe belangrijk het is om humaan weefsel te gebruiken om tot een juiste voorspelling van geneesmiddelmetabolisme en inductieprocessen in de mens te kunnen komen.
Conclusies
De studies beschreven in dit proefschrift laten duidelijk zien, dat zowel het weefselplakjesmodel voor rat als humaan weefsel geschikt is om geneesmiddelmetabolisme en geneesmiddelinteracties te bestuderen. Het vormt een veelbelovend alternatief voor in vivo studies en zou kunnen bijdragen aan de 3 V’s (vervanging, verfijning en vermindering van proefdiergebruik) in het onderzoek naar nieuwe geneesmiddelen. Bovendien biedt het de mogelijkheid om inductieprocessen te bestuderen in verschillende darmsegmenten losgekoppeld van de lever.
Kortom het darmplakjessysteem vormt een zeer geschikt model voor onderzoek naar de potentiële verschillen in geneesmiddelmetabolisme in rat en mens, maar ook in darm en lever. Bovenal verbreedt het de mogelijkheden om in vitro onderzoek te doen naar geneesmiddelmetabolisme in de menselijke darm.
